眼内移植し、共焦点顕微鏡を組み合わせた新しいアプローチがグラフトされた組織内での単一セルの解像度で縦、非侵襲性のリアルタイムイメージングを可能にする。我々は、マウスの眼の前房に膵島を移植する方法を示します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
生体内イメージングは、生物学の研究に不可欠なツールとして浮上している。その過程で、多くのイメージング技術は、非侵襲的に動物に異なる生物学的過程を研究するために開発されてきた。しかし、既存の生体内イメージングモダリティの主要な技術的な限界は、単一セルの解像能力を持つ非侵襲的、縦画像を組み合わせることができないことである。我々は前眼房への移植は、 生体内で細胞レベルの分解能で非侵襲的な、縦撮影が可能多目的実験プラットフォームを提供するなどの重要な制限を回避する方法をここに示す。我々は、マウスに移植手順を示し、すなわち、臨床的意義、膵島移植でモデルを使用して代表的な結果を提供します。前眼房に移植し、様々な組織で直接可視化を可能にするだけでは、このアプローチはがれするためのプラットフォームを提供長期的なフォローアップを実施し、標的組織で監視することにより、n個の薬。なぜなら目の給付だけでなく、移植治療の前房にその汎用性、組織/細胞移植のために、それは、このようなシグナル伝達とがんや自己免疫疾患の発症などの生理学的および病態生理学的プロセスを研究するために 、in vivoアプリケーションで他にも及ぶ。
概要
生体顕微鏡の進歩は、in vitro試験1で予測されていない生理現象を明らかにした。これは、生きている動物にインビトロ法によって得られた従来の知見を翻訳に挑戦を強調しています。過去10年間では、生きた動物の組織の可視化はかなりの撮像モダリティ2、3、4、5、6の技術の進歩によって改善された。これは、非侵襲的に標的組織の縦可視化を可能にするための実験動物モデルで実現可能なアプリケーションを用いた in vivoイメージングアプローチのための必要性に拍車をかけている。
このような磁気共鳴イメージングと陽電子放射断層撮影法、または生物発光イメージング技術としては、体7-8、9の奥深くの臓器/組織の非侵襲的イメージングを有効にしている。しかし、これらの技術は使用Oにもかかわらず、高いバックグラウンド信号と低空間分解能に起因する単一細胞の解像度を達成することはできませんF高コントラスト材料または組織特異的発光4。これは二光子蛍光共焦点顕微鏡10の出現で対処されました。二光子顕微鏡は、前例のない詳細11、12と携帯電話のイベントを可視化し、定量化するために生体内イメージングの研究を可能にしました。これは、健康と病気13、14、15、16の重要な生物....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
次の手順は2ステップで実体鏡下で行われ、最初のステップは、カニューレ内に島をロードする必要が第二段階では、ACEへの実際の移植である。動物で実行されるすべての手続きは、マイアミ大学の制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）によって承認された。
1。移植するためのカニューレでロードランゲルハンス島
- サークルを絞り込むのに皿を回転させて中央培養皿の中の小島。
- "リザーバ"からカニューレを外し、清潔な表面にカニューレと接続チューブを配置します。リザーバは、フィルタ（ 図1a）を使用せずに300μlの使い捨てプラスチックピペットチップで作ることができる。
- リザーバ内に吸引時の小島の連続的な流れを確保するために貯水池の気泡を洗い流す。貯水池のフラッシングがフットペダルを使用してハンズフリー電動注射器ドライバを前方に駆動することによって行われます（ 図1b、c）である。また、これは（例えば生理食塩水、PBSまたは培養培地などの滅菌液であらかじめロード）リザーバーに膵島の吸引を可能にするために、シリンジ内の空間を作ります。
- 優しくリザーバーに膵島の所望量を吸引除去する。彼らはリザーバーを入力して、底部に向かって一緒に残るような島は渦になる傾向がある。吸引は、フットペダルを使って後方電動注射器ドライバを駆動することによって行われます。 <....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
"良い"移植を定義するいくつかのパラメータがあります。良い移植は出血せずに進み、映像に見られるように切開を行ったものです。出血は、ACE（ 図3a）にメス（針）の先端のみを貫通することによって防止/最小化されます。これはまた、虹彩の接触および穿刺を防ぐことができます。また、時間（ 図3c、d）の上に、角膜の濁りを発生させることなく、非常によく治る小切開を確実にするでしょう。移植の成功へのもう一つの重要な側面は、ACEの還流切れによる損失なし小島の合計所望の量を移植できるようにすることです。などのプロトコルステップ1.6で述べたように、これは、ACE（ 図3b）の最終カニューレの後退時に外切開を密封助けるのに空気泡を使用することにより、最小限のボリュームを吐出小島と、該当する場合は最小限に抑えることができます。また、iを提供瞳孔と角膜輪部のエッジとの間の虹彩の上sletsは、in vivoイメージング（ 図3d） のために非常に適し.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
マウス膵島は、以前説明したように33、密度勾配上での精製に続くコラゲナーゼ消化を用いて単離した。孤立した膵島を移植する前に、一晩培養した。これは必要とされないかもしれないが、それは小島が単離手順から回復できるようにすることをお勧めします。これは、生き残った/堅牢な膵島の移植性を確保するように移植が糖尿病のレシピエントで実行される時に重要です。
移植は、酸素/イソフルラン混合（1.5-3％）効果と吸入で一般化された麻酔下で行われる。代替吸入または注射麻酔薬（ 例えば、ケタミン）を使用することができる。注射麻酔を使用する場合は、プロトコルでステップ2.2をスキップします。手順の実行中に低体温症を防ぐために、熱源ので麻酔動物を提供する。一般的に無血管共同で切開を行う際に一部のマウスでは、血管を破壊することが可能であるrnea。例えば、ヌードマウスの角膜は血管化する傾向がある、可能な場合に血管化地域を避ける。切開あたりの新しい注射器を使用しています。切開を行う際に針で虹彩に穴をあけることは避けてください。アイリスとの接触を防止し、更にアイリスに向かっ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
PO.B.商用サービスのプラットフォームとして眼の前房を使おうとしているバイオテクノロジー会社Biocrine、の創設者の一人です。 ACはこの技術を保護する特許になります。
謝辞
私たちは、博士を認める。カミッロリコルディ、アントネッロピレッジ、R.ダマリスMolano、ステファンSpeierと実りある議論のためのダニエルNyqvist。我々はまた、ビデオ録画のヘルプはEleutヘルナンデスとディエゴ·エスピノーサ-Heidmann技術支援のために、マイク·バルデスとマーガレットFormosoに感謝します。バイロンマルドナドは、編集された記録され、最終的な映像を作り出した。研究支援は、糖尿病研究所財団（提供されたwww.DiabetesResearch.org ）、NIH / NIDDK / NIAID（MHAにF32DK083226、ACへのNIH RO3DK075487; PO.B.へU01DK089538）。 PO.Bに追加の研究支援はカロリンスカ研究所、スウェーデン研究評議会、スウェーデン糖尿病財団、ファミリーErling Perssonさん、財団、ファミリークヌートとアリスウォレンバーグ財団、スカンディア·インシュアランス·カンパニー·リミテッド、活気のある（から資金を介して提供されましたFP7-228933から2）、カロリンスカ研における糖尿病における研究戦略推進プログラムitutet、ノボノルディスク財団、バースフォンKantzow財団。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名称 | 会社 | カタログ番号 | 説明/コメント |
| IsoTHESIA（イソフルラン） | Buttlerアニマルヘルスサプライ | 11695-6775-2 | 99.9パーセントイソフルラン/ mlの |
| Ketaset（ケタミンHCL） | フォートダッジ·アニマルヘルス | 0856-2013-01 | 代替注射麻酔 |
| Beprenex（ブプレノルフィン塩酸塩） | レキットベンキーザー·ヘルスケア（英国）株式会社 | 12496-075-7-1 | 0.3 mg / mlの |
| エリスロマイシン眼軟膏、USP、0.5％ | アクロン | 17478-070-35 | 移植された眼に予防的に適用された |
| 0.9％塩化ナトリウム（生理食塩水） | ホスピーラ社 | 0409-7983-03 | 静脈注射用。無菌の |
| PBS | ギブコ | 10010-023 | 1X。無菌の |
| CMRL培地1066 | Cellgro | 98から304-CV | 補足し、CITの修正。小島のための好ましいメディア |
参考文献
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
