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方法論記事

縦用の眼の前房に移植、非侵襲

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DOI:

10.3791/50466

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2013年3月10日

 ,  , 
1Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Medicine, University of Miami Miller School of Medicine, 4Department of Physiology & Biophysics, University of Miami Miller School of Medicine, 5The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet

この記事について

サマリー

眼内移植し、共焦点顕微鏡を組み合わせた新しいアプローチがグラフトされた組織内での単一セルの解像度で縦、非侵襲性のリアルタイムイメージングを可能にする。我々は、マウスの眼の前房に膵島を移植する方法を示します。

要約

生体内イメージングは​​、生物学の研究に不可欠なツールとして浮上している。その過程で、多くのイメージング技術は、非侵襲的に動物に異なる生物学的過程を研究するために開発されてきた。しかし、既存の生体内イメージングモダリティの主要な技術的な限界は、単一セルの解像能力を持つ非侵襲的、縦画像を組み合わせることができないことである。我々は前眼房への移植は、 生体内で細胞レベルの分解能で非侵襲的な、縦撮影が可能多目的実験プラットフォームを提供するなどの重要な制限を回避する方法をここに示す。我々は、マウスに移植手順を示し、すなわち、臨床的意義、膵島移植でモデルを使用して代表的な結果を提供します。前眼房に移植し、様々な組織で直接可視化を可能にするだけでは、このアプローチはがれするためのプラットフォームを提供長期的なフォローアップを実施し、標的組織で監視することにより、n個の薬。なぜなら目の給付だけでなく、移植治療の前房にその汎用性、組織/細胞移植のために、それは、このようなシグナル伝達とがんや自己免疫疾患の発症などの生理学的および病態生理学的プロセスを研究するために 、in vivoアプリケーションで他にも及ぶ。

概要

生体顕微鏡の進歩は、in vitro試験1で予測されていない生理現象を明らかにした。これは、生きている動物にインビトロ法によって得られた従来の知見を翻訳に挑戦を強調しています。過去10年間では、生きた動物の組織の可視化はかなりの撮像モダリティ2、3、4、5、6の技術の進歩によって改善された。これは、非侵襲的に標的組織の縦可視化を可能にするための実験動物モデルで実現可能なアプリケーションを用いた in vivoイメージングアプローチのための必要性に拍車をかけている。

このような磁気共鳴イメージングと陽電子放射断層撮影法、または生物発光イメージング技術としては、体7-8、9の奥深くの臓器/組織の非侵襲的イメージングを有効にしている。しかし、これらの技術は使用Oにもかかわらず、高いバックグラウンド信号と低空間分解能に起因する単一細胞の解像度を達成することはできませんF高コントラスト材料または組織特異的発光4。これは二光子蛍光共焦点顕微鏡10の出現で対処されました。二光子顕微鏡は、前例のない詳細11、12と携帯電話のイベントを可視化し、定量化するために生体内イメージングの研究を可能にしました。これは、健康と病気13、14、15、16の重要な生物学的プロセスの特性評価につながっている。先駆的な生体内イメージング研究は、主に切除された組織（ 例えば、リンパ節） を用いたin vivo条件で "模倣"しているが、他の研究では 、in situ 17、18、19、20、21 に画像さらさ標的組織への侵襲的なアプローチを使用しています。他の研究でも侵襲的なアプローチおよび in vivo 22、23、24、25 に制限された撮像解像度に関連付けられた制限を回避するには、 "ウィンドウ室モデル"を使用しています。ウィンドウ室モデルでは、透明な窓を有する室は、外科的にdiffeで皮膚に注入される動物の家賃の場所（背や耳、皮膚、乳房脂肪、肝臓など）（ 例えば 、マウス、ラット、ウサギ）。このアプローチは明らかにin vivoイメージングの高解像度を可能にしますが、それは、チャンバを移植する侵襲的手術を必要とし、数週間または数ヶ月22の上に縦イメージング研究を収容することができない場合があります。

それが最近になって前眼房（ACE）への移植、すなわち、低侵襲で高解像度の共焦点顕微鏡法を組み合わせることで、in vivoイメージングプラットフォーム26,27 における強力で汎用性の高いような"自然な身体の窓"を提供している。実証されたACEへの移植は組織28、29、30の様々な生物学的側面 ​​を研究するために、過去数十年で使用されてきた、そして高分解能イメージングとその最近の組み合わせにより、単一細胞の解像度で膵島の生理学を勉強して有効になって非侵襲的かつ長手方向に<> 26、27（商標）。このアプローチは、動物モデルにおける1型糖尿病（未発表データ）の開発の間に自己免疫応答を研究するために使用されました。また、それぞれのACE膵芽または個々の腎糸球体、（未発表データ）に移植することにより、腎機能の研究では、膵臓の発達を研究するだけでなく、ために使用された。このアプローチを使用した最近の報告書はさらに、膵島移植31日後の免疫応答を研究するための応用を実証しました。重要なのは、この研究では、眼の前房への移植は、実行する自然な身体のウィンドウを提供示した：in vivoで移植組織の（1）の長手方向の、非侵襲的イメージング、（2） 生体内でで 、細胞の表現型と生存率を評価するためにcytolabeling その場で 、標的組織で免疫細胞の浸潤（3）リアルタイム追跡、および局所適用または眼内注射によって（4）地元の介入。

ここでは、D膵島を用いて眼の前房に移植を行う方法emonstrate。

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プロトコル

次の手順は2ステップで実体鏡下で行われ、最初のステップは、カニューレ内に島をロードする必要が第二段階では、ACEへの実際の移植である。動物で実行されるすべての手続きは、マイアミ大学の制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）によって承認された。

1。移植するためのカニューレでロードランゲルハンス島

  1. サークルを絞り込むのに皿を回転させて中央培養皿の中の小島。
  2. "リザーバ"からカニューレを外し、清潔な表面にカニューレと接続チューブを配置します。リザーバは、フィルタ（ 図1a）を使用せずに300μlの使い捨てプラスチックピペットチップで作ることができる。
  3. リザーバ内に吸引時の小島の連続的な流れを確保するために貯水池の気泡を洗い流す。貯水池のフラッシングがフットペダルを使用してハンズフリー電動注射器ドライバを前方に駆動することによって行われます（ 図1b、c）である。また、これは（例えば生理食塩水、PBSまたは培養培地などの滅菌液であらかじめロード）リザーバーに膵島の吸引を可能にするために、シリンジ内の空間を作ります。
  4. 優しくリザーバーに膵島の所望量を吸引除去する。彼らはリザーバーを入力して、底部に向かって一緒に残るような島は渦になる傾向がある。吸引は、フットペダルを使って後方電動注射器ドライバを駆動することによって行われます。
  5. 接続チューブを介してリザーバにカニューレを再接続します。
  6. 培養皿に戻ってカニューレ先端を配置し、カニューレ内に次にチューブに貯水池の小島を洗い流す。あなたは優しく（タッピング）チューブ（ 図1d） "フリック"でチューブ/カニューレを埋戻しとして膵島一緒残ることを確認します。先に島の全ての気泡がカニューレをフラッシュされる前または後に停止します。よくわからない場合は、小島が残って空気としてカニューレの奥に入ると停止前方に小島の泡は、ACEの小島からの逆流（逆流）を防止することができます。一夜消費します。
  7. この段階では、ACE（次の手順を参照してください）​​に膵島を注入する準備が整いました。

2。前眼房に膵島移植

  1. ステレオスコープの下に暖かいパッドの上に麻酔マウスを置きます。
  2. 酸素/イソフルレン麻酔器に接続されている麻酔 "マスク"にマウスの鼻を置きます。マスクは1ミリリットル使い捨てプラスチックピペットチップ（フィルターなし）から作られ、狭い方の端（ 図2a、b）を介して麻酔のチューブに接続されています。
  3. そっと眼の蓋が良い露出と簡単にアクセスできます（ 図2c）に目を光らせて空いている方の手の人差し指と親指を使用していて、 "ポップ"移植する引っ込める。これは上の過度の圧力によって、マウスの呼吸を妨げることなく完璧にいくつかの練習が必要になります首や頭への血流を遮断する。
  4. 使い捨てインスリン注射器（29 - 31G）を使用して、メスのように、慎重に角膜の先端のみを貫通し、単一横切開を行います。 ACE（ 図2d）のうち、注入中の膵島の逆流を最小限にするために、角膜と角膜輪部の頂点との中点で切り込みを入れる。
  5. 注意深く切開を通してカニューレを（小島がプリロード）を挿入します。
  6. ゆっくりとカニューレの膵島を取り出して虹彩の上にそれらを預ける。 ACEの過度の圧力上昇に起因する膵島逆流を防ぐために、切開に象限の反対の中でできるだけ少ないボリューム（s）として、短時間の推力で膵島を取り出します。これは、さらにカニューレを（ステップ1.6を​​参照してください）​​ロード中にチューブに膵島を圧縮することにより確保することができる。
  7. ゆっくりACEのカニューレを引っ込める。島の大ボリュームは圧力に起因する膵島還流として注入した場合、これは特に、重要なステップです必ずACEの内部に蓄積避けられないかもしれない。カニューレの周りに切開して過剰圧力を解放するために、ACEの中にある状態で膵島逆流を最小限に抑える/排除するために、穏やかにカニューレを回転させます。あなたはカニューレを撤回し、必要に応じて、ACEから完全に後退する前に圧力がおさまるまでカニューレを待つように試みると同時に逆流の兆候がないか確認してください。
  8. 滅菌PBSまたは生理食塩水を移植された眼をすすぐ。
  9. 最初の48時間、術後鎮痛（0.05 mg / kgの皮下）にブプレノルフィンを注入します。
  10. 直ちに移植後の移植眼にエリスロマイシン点眼抗生物質軟膏を塗る。
  11. 麻酔からの回復を可能にするために温めておいたケージに戻って動物を置きます。

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結果

"良い​​"移植を定義するいくつかのパラメータがあります。良い移植は出血せずに進み、映像に見られるように切開を行ったものです。出血は、ACE（ 図3a）にメス（針）の先端のみを貫通することによって防止/最小化されます。これはまた、虹彩の接触および穿刺を防ぐことができます。また、時間（ 図3c、d）の上に、角膜の濁りを発生させることなく、非常によく治る小切開を確実にするでしょう。移植の成功へのもう一つの重要な側面は、ACEの還流切れによる損失なし小島の合計所望の量を移植できるようにすることです。などのプロトコルステップ1.6で述べたように、これは、ACE（ 図3b）の最終カニューレの後退時に外切開を密封助けるのに空気泡を使用することにより、最小限のボリュームを吐出小島と、該当する場合は最小限に抑えることができます。また、iを提供瞳孔と角膜輪部のエッジとの間の虹彩の上sletsは、in vivoイメージング（ 図3d） のために非常に適し...

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ディスカッション

マウス膵島は、以前説明したように33、密度勾配上での精製に続くコラゲナーゼ消化を用いて単離した。孤立した膵島を移植する前に、一晩培養した。これは必要とされないかもしれないが、それは小島が単離手順から回復できるようにすることをお勧めします。これは、生き残った/堅牢な膵島の移植性を確保するように移植が糖尿病のレシピエントで実行される時に重要です。

移植は、酸素/イソフルラン混合（1.5-3％）効果と吸入で一般化された麻酔下で行われる。代替吸入または注射麻酔薬（ 例えば、ケタミン）を使用することができる。注射麻酔を使用する場合は、プロトコルでステップ2.2をスキップします。手順の実行中に低体温症を防ぐために、熱源ので麻酔動物を提供する。一般的に無血管共同で切開を行う際に一部のマウスでは、血管を破壊することが可能であるrnea。例えば、ヌードマウスの角膜は血管化する傾向がある、可能な場合に血管化地域を避ける。切開あたりの新しい注射器を使用しています。切開を行う際に針で虹彩に穴をあけることは避けてください。アイリスとの接触を防止し、更にアイリスに向かっ...

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開示事項

PO.B.商用サービスのプラットフォームとして眼の前房を使おうとしているバイオテクノロジー会社Biocrine、の創設者の一人です。 ACはこの技術を保護する特許になります。

謝辞

私たちは、博士を認める。カミッロリコルディ、アントネッロピレッジ、R.ダマリスMolano、ステファンSpeierと実りある議論のためのダニエルNyqvist。我々はまた、ビデオ録画のヘルプはEleutヘルナンデスとディエゴ·エスピノーサ-Heidmann技術支援のために、マイク·バルデスとマーガレットFormosoに感謝します。バイロンマルドナドは、編集された記録され、最終的な映像を作り出した。研究支援は、糖尿病研究所財団（提供されたwww.DiabetesResearch.org ）、NIH / NIDDK / NIAID（MHAにF32DK083226、ACへのNIH RO3DK075487; PO.B.へU01DK089538）。 PO.Bに追加の研究支援はカロリンスカ研究所、スウェーデン研究評議会、スウェーデン糖尿病財団、ファミリーErling Perssonさん、財団、ファミリークヌートとアリスウォレンバーグ財団、スカンディア·インシュアランス·カンパニー·リミテッド、活気のある（から資金を介して提供されましたFP7-228933から2）、カロリンスカ研における糖尿病における研究戦略推進プログラムitutet、ノボノルディスク財団、バースフォンKantzow財団。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名称 会社 カタログ番号 説明/コメント
IsoTHESIA（イソフルラン） Buttlerアニマルヘルスサプライ 11695-6775-2 99.9パーセントイソフルラン/ mlの
Ketaset（ケタミンHCL） フォートダッジ·アニマルヘルス 0856-2013-01 代替注射麻酔
Beprenex（ブプレノルフィン塩酸塩） レキットベンキーザー·ヘルスケア（英国）株式会社 12496-075-7-1 0.3 mg / mlの
エリスロマイシン眼軟膏、USP、0.5％ アクロン 17478-070-35 移植された眼に予防的に適用された
0.9％塩化ナトリウム（生理食塩水） ホスピーラ社 0409-7983-03 静脈注射用。無菌の
PBS ギブコ 10010-023 1X。無菌の
CMRL培地1066 Cellgro 98から304-CV 補足し、CITの修正。小島のための好ましいメディア

参考文献

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