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方法論記事

プロテインWISDOM：ベンチ用

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DOI:

10.3791/50476

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2013年7月25日

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1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

この記事について

サマリー

私たちは、タンパク質設計のいくつかの重要な領域に取り組むことができる計算de novoタンパク質設計法を開発しました。これらの手法を普及させるために、タンパク質設計のためのオンラインツールであるProtein WISDOMを紹介します(http://www.proteinwisdom.org)。構造テンプレートから始めて、安定性を高めるための単量体タンパク質の設計と、結合親和性を高めるための複合体の設計を行うことができます。

要約

デノボタンパク質設計の目的は、天然の配列に対して、例えば結合親和性、アゴニストまたはアンタゴニストの動作、又は安定性などの特定の性質、所望の改善を持つ3次元構造に折り畳まになるアミノ酸配列を見つけることである。タンパク質の設計には、現在の進歩の薬物設計と発見の中心に位置しています。だけでなく、タンパク質の設計は潜在的に有用な薬物標的の予測を提供し、それはまた、タンパク質の折り畳みプロセスおよびタンパク質 - タンパク質相互作用の理解を高めるない。このような定方向進化のような実験方法は、タンパク質の設計の成功を示している。しかし、そのような方法はtractably検索できる限られた配列空間によって制限されています。対照的に、計算設計戦略は、特性及び機能の様々な被覆配列の非常に大きなセットのスクリーニングを可能にする。我々は、計算のde novoタンパク質設計メトキシの範囲を開発しているタンパク質設計のいくつかの重要な分野に取り組むことのできるDS。これらには、増大した結合親和性のために増加した安定性との複合体のための単量体のタンパク質の設計が含まれています。

より広範な使用のためのこれらの方法我々現在のタンパク質WISDOM（普及にhttp://www.proteinwisdom.org ）、タンパク質設計に関するさまざまな問題のために自動化された方法を提供するツールです。構造テンプレートは、設計プロセスを初期化するために提出されます。設計の第一段階は、シーケンス空間にポテンシャルエネルギーの最小化を介して安定性を改善することを目的とする最適化シーケンスを選択する段階である。選択された配列は、その後、折り目特異ステージと結合親和性の段階を介して実行されています。プロセスの各ステップのための配列のランク順序付きリストは、関連する設計された構造に加えて、設計の包括的な定量的評価をユーザに提供します。ここでは詳細をOを提供fは、それぞれ設計方法、並びに方法の使用によって達成いくつかの注目すべき実験成功。

概要

De novoタンパク質設計は、改善された特性または機能を持つ望ましい三次構造を生成するタンパク質配列の同定です。タンパク質のネイティブフォールドは自由エネルギー最小値にあるコンフォメーションであるため、de novoタンパク質設計では、ターゲットフォールドに自由エネルギー最小値を持つ配列を探します。この問題は、Drexler1 と Pabo2 によって最初に記述され、"逆折り畳み問題" と呼ばれました。しかし、1つの配列が1つのフォールディング構造解しか得られないタンパク質フォールディング問題とは異なり、de novoタンパク質設計問題では縮退が見られます。多くの異なるアミノ酸配列は、同じ三次構造と機能をもたらすことができます。

タンパク質設計は伝統的に合理的な設計と指向性進化を通じて実験的に行われてきましたが、最近では、実験方法に固有の限られた探索空間を克服するために計算方法が採用されています。決定論的手法、確率論的手法、確率論的手法など、さまざまな計算手法が使用されています。3,4 初期の計算方法では、固定バックボーンテンプレートを使用して、問題を解決しやすくしました。5-7 より高速なプロセッサ、高性能コンピューティング、およびより効率的なアルゴリズムの出現により、バックボーンの柔軟性は、固定バックボーンテンプレートのアンサンブル8-14を使用することによって、または原子間距離と二面角の範囲の観点からテンプレートを表現することによって真のバックボーンの柔軟性を組み込むことによって組み込まれるようになった。15,16

この論文では、Protein WISDOMについて詳細に説明しています。これは、私たちの計算de novoタンパク質設計フレームワークを利用するために学術コミュニティに利用可能になったオンラインツールです。このフレームワークは、HIV、がん、補体疾患、その他の自己免疫疾患などの疾患を標的とした治療用途のために、多数のタンパク質の設計に適用されています。予測されたペプチドの多くが実験的に検証され、この方法の威力が実証されました。表1は、タンパク質またはペプチドのサイズ、予測数、実験検証など、設計されたさまざまなタンパク質の概要を示しています。

名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 日 名 歳 名 名 名 名 名 名 名 名 名
タンパク質設計タンパク質の長さ# 計算予測の数# の実験的検証参考
ヒトβ-defensin-2の全配列設計41340 (17)
ヒトC3のコンプスタチン阻害剤13283月3日(18、19)
ラットC3cに結合するコンプスタチン類似体135 △ 20
ジセリン伸長を伴うコンプスタチン類似体158  
コンプスタチンアナログW4A9の安定化構造1318  
C3a受容体アゴニストおよびアンタゴニスト77204月7日(21)
C5a受容体作動薬およびアンタゴニスト746161年2月 
HIV-1 gp14阻害剤1264月5(22)
HIV-1 gp120阻害剤914  
Bcl-x LおよびBcl-2のBak阻害剤16-18105月5日(23)
ERK2の阻害剤1125  
EZH2の阻害剤211710月10日(24)
LSD1およびLSD2の阻害剤164120月17日 
HLA-DR1の阻害剤136 (25)
PNPの阻害剤513  

表 1.de novoタンパク質設計フレームワークを使用して設計されたタンパク質およびペプチドの要約。計算予測の#は、好ましい予測の数として表されます(つまり、特定のカットオフを超える特異性、またはネイティブシーケンスよりも大きい近似結合親和性)。実験検証の#は2つの数値を示します:1つ目は実験的に検証された予測の数、2つ目は実験的にテストされた予測の総数です。

ペプチドの抗菌特性を高めるために、ヒト-β-ディフェンシン-2(hβD-2)の設計を行いました。17 このデザインでは、1)hβD-2に沿った最大10の変異、および2)システインを除くすべてのhβD-2残基位置のフルシーケンスデザイン(8、15、20、30、37、および38)の2つのケースを考慮しました。このデザインでは、3つの異なるデザインテンプレートと3つの異なるシーケンス選択モデルが使用されました。10個の突然変異デザインと全配列デザインの両方について、加重平均モデルと距離ビンモデルの間で、突然変異の類似性が高いレベルが観察されました。さらに、多数の配列が、ネイティブ配列よりも有利に計算されたフォールド特異性値を持つことがわかりました。

補体系阻害剤(C3、C3a、C5a)は、脳卒中、心臓発作、アルツハイマー病、喘息、関節リウマチ、異種移植の拒絶反応、成人呼吸器疾患、乾癬、クローン病などの多くの免疫疾患と戦うために設計されました。タンパク質設計フレームワークによって予測されたC3cの3つのコンプスタチン阻害剤と合理的に設計された3つの配列が、天然のコンプスタチンよりも優れた結合剤であることが実験的に検証されました。18,19

さらなる研究では、非霊長類のC3cに対するコンプスタチンの活性の喪失を調べ、ラットとマウスのC3c阻害剤の候補をいくつか設計しました。5つの配列は、C3cを阻害することが知られているW4A9コンプスタチン変異体よりもラットC3cとの良好な関連自由エネルギーを持っていることが示されました。これは、Arg1による新たな塩橋形成によるものです。20 N末端伸長を有する8つの配列は、ジセリン伸長を有するW4A9よりも優れた結合剤であると予測された。最後に、18のコンプスタチン配列がW4A9の結合したコンフォメーションを安定化すると予測され、霊長類および非霊長類のC3c阻害剤の強力な候補を提供しました。

C3c阻害剤に加えて、C3aおよびC5a受容体アゴニストおよびアンタゴニストは、C3aおよびC5aの構造に基づいて設計されました。モデルによって予測された7つのC3a配列を実験的にテストしました。配列のうち2つは強力なアゴニストであり、他の2つは部分的なアゴニストでした。21 2つの強力なアゴニストは、以前に発見された「スーパーアゴニスト」よりも58倍の改善を示しました。C5a受容体アゴニストおよびアンタゴニストの設計により、61の配列のセットが提供されました。すべての配列が合成され、2つが新規のC5aアゴニストであることがわかりました。

HIV-1の融合阻害剤は、HIV-1が細胞に感染するのを防ぐために設計されました。最初の設計は、HIV-1のエンベロープ糖タンパク質であるgp41を対象としていました。タンパク質設計フレームワークは、ネイティブ配列よりも優れた結合剤である6つの配列を予測しました。これらの予測配列のうち4つは、HIV-1を阻害することが実験的に検証され、最良の配列はIC50が29μMと低かった。この配列は、天然配列よりも3〜15倍の改善を示し、エンフビルチド耐性ウイルス株に対する活性の損失はありませんでした。22 2番目のデザインは、HIV-1の別のエンベロープ糖タンパク質であるgp120を対象としていました。14の配列はgp120の結合剤であり、HIV-1の追加の潜在的な融合阻害剤を提供すると予測されました。

がんに関連する多数のタンパク質が、がん治療の有望な標的を提供しました。Bcl-2およびBcl-xLは、細胞死を防ぐ抗アポトーシスタンパク質です。これら2つのタンパク質の阻害剤は、がん細胞の細胞死を誘導するように設計されました。10の配列がネイティブよりも優れた結合剤であると予測され、これらの結果は以前の実験結果と突然変異誘発結果を捉えました。23 別の標的タンパク質であるERK2は、シグナル伝達カスケードに関与しており、抗増殖性がん治療の有望な標的となっています。25の配列がERK2の阻害剤であると予測されました。

ヒストンメチルトランスフェラーゼと脱メチル化酵素は、前立腺、乳がん、リンパ腫、骨髄腫、膀胱、結腸、皮膚、肝臓、子宮内膜、肺、胃など、多くのがん種に関連するヒストンメチル化を動的に制御します。de novoタンパク質設計フレームワークにより、EZH2(リジンメチルトランスフェラーゼ)の17の阻害剤が特定され、実験的にテストされた10のすべてがEZH2を阻害することがわかりました。24 最も強力なペプチドは、約13μMのIC50を有し、酵素濃度の上昇に対しても同等に効果的であり、補因子と競合しませんでした。これらのペプチドは、EZH2の阻害剤の最初のセットでした。フレームワークにより、LSD1(デメチラーゼ)の阻害剤53が予測され、実験的に試験された20の阻害剤のうち、17がLSD1の阻害剤、18がLSD2の阻害剤であった。最も優れた阻害剤は、IC50の値が1 μM未満であったため、これまでに発見されたペプチド阻害剤の中で最も強力です。

最後の2つのタンパク質システムは、セリアック病、1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、チャーグ・シュトラウス症候群、橋本甲状腺炎、バセドウ病、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、アレルギーなど、さまざまな自己免疫疾患の治療に標的を提供しました。これらの潜在的な阻害剤はいずれも実験的に検証されていませんが、フレームワークはHLA-DR1に結合する6つの配列とPNPに結合する13の配列を予測しました。

表2は、de novoタンパク質設計フレームワークを使用して予測された実験的に検証された阻害剤とアゴニストをまとめたものです。近似結合親和性指標は、9つの配列(ヒトC3c、HIV-1 gp41、EZH2、LSD1、およびLSD2の阻害剤)を予測するために使用され、フォールド特異度指標は、4つの配列(C3aRのアゴニスト/アンタゴニスト)を同定するために使用されました。これらのペプチドは、de novoタンパク質設計フレームワークの成功、特に追加された近似結合親和性指標を浮き彫りにしています。このフレームワークは、その適用性において非常に用途が広いです。25の異なる疾患に関連する6つの異なるタンパク質が成功裏に設計され、実験的に検証されました。

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名前IC50EC50タンパク質ターゲット該当する病気
SQ0270.94 μM ヒトC3c脳卒中、心臓発作、アルツハイマー病、喘息、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、I型糖尿病、クローン病、膵炎、嚢胞性線維症
SQ0861.98 μM ヒトC3c
SQ0594.73 μM ヒトC3c
SQ110-4 15.2 nMC3aR
SQ060-4 36.4 nMC3aR
SQ007-515.4 nM C3aR
SQ002-526.1 nM C3aR
SQ43529 - 253 μM HIV-1 GP41エイズ
SQ03713.57 μM EZH2前立腺がん、乳がん、リンパ腫、骨髄腫、膀胱がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がん、子宮内膜がん、肺がん、胃がん
SQ011-10.521 μM LSD1
SQ016-10.249 μM LSD1
SQ026-12.51 μM LSD2
SQ015-11.332 μM LSD2

表 2.さまざまな疾患を標的とする計算予測および実験的に検証されたペプチド。

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プロトコル

方法の概要

Protein WISDOMで使用されているde novo設計フレームワークは、2つのステージで構成されています。第1ステージでは、指定されたテンプレート構造に折り畳まれるアミノ酸配列の順位付きリストを作成します。第2ステージでは、折り畳み特異性または近似結合親和性のいずれか、あるいはその両方を算出することで、これらの配列を検証します。前者は主に単一タンパク質の設計に使用され、後者は複合体（標的タンパク質に結合するペプチド）の設計に使用されます。図1に、このフレームワークに含まれるステップの概要を示します。

設計入力： de novo タンパク質設計フレームワークでは、いくつかの入力を定義する必要があります。まず1つ目は設計テンプレートです。これは、タンパク質内のすべての原子の座標を含む3次元（3D）タンパク質構造です。構造は剛体または柔軟体のいずれかになります。剛体テンプレートは固定された原子座標のセットであり、X線結晶構造解析構造から得られます。柔軟体テンプレートは、固定された原子座標のセット、または原子座標の上限および下限値となる場合があります。これらのテンプレートは、NMR溶液構造、分子動力学、またはドッキングシミュレーションから得ることができます。

デザインテンプレートは、設計タンパク質の許容変異セットを生成するために使用されます。このセットでは、配列のどの位置に変異が可能か、およびどのアミノ酸への置換が可能かが定義されます。変異セットは、デザインテンプレートにおける各残基の溶媒接触表面積（SASA）を算出することで生成されます。残基の溶媒露出度が50%を超える場合は、親水性アミノ酸のセット（D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, T）が許容されます。残基の溶媒露出度が20%未満の場合は、疎水性アミノ酸のセット（A, F, I, L, M, V, W, Y）が許容されます。残基の露出度が20%から50%の間にある場合は、すべてのアミノ酸が許容されます。システインは、実験データまたは文献データで適切であると判断されない限り、通常は変異セットから除外されます。小型アミノ酸（A, G, T）は、通常すべてに変異セットに含まれます。利用可能な場合は、実験的または文献的な知見を用いて、特定のアミノ酸位置の変異セットを手動で修正することができます。

設計テンプレート内の配列のペア相互作用エネルギーを計算するために、力場が選択されます。どのような力場でもこのフレームワーク内で使用するように適合させることができますが、2つの距離依存力場が開発されており、de novo設計フレームワークで広く使用されています。1つ目は高解像度Cα-Cα力場26であり、距離は残基のCα炭素間で定義されます。2つ目は高解像度セントロイド-セントロイド力場27であり、距離は残基のセントロイド間で定義されます。力場におけるエネルギーパラメータは、大規模なタンパク質トレーニングセットにおいて、低エネルギーの高解像度デコイが天然構造よりもエネルギー的に不利になるように求める線形計画法パラメータ推定問題を解くことで導出されました。高解像度セントロイド-セントロイド力場およびCα-Cα力場は、ともにヒトβ-ディフェンシン-2を用いた先行研究でテストおよび検証されています17。力場を距離ビンに離散化することで、実際の主鎖の柔軟性がモデルに組み込まれています。アミノ酸ペア間の距離は特定の距離ビンに対応し、一定の距離範囲に対して同一のエネルギー値が与えられます。これにより、配列選択最適化モデルで主鎖の動きを考慮することが可能になります。

電荷制約または含有量制約という形式の生物学的制約は、追加の設計入力としてユーザーが手動で含めることができます。電荷制約では、設計された配列またはその一部で満たされなければならない特定の電荷または電荷範囲を指定します。電荷は、正に帯電した残基（KおよびR）の合計から、負に帯電した残基（DおよびE）の合計を引いた値として計算されます。含有量制約では、配列内における特定のアミノ酸の出現回数の上限および下限を指定します。生物学的制約は、一般的に天然配列に対する広範な配列アラインメントを通じて定義されます。これは、あるタンパク質ファミリーについて自然界に存在する電荷およびアミノ酸含有量の既知の生物学的限界を捉えるためです。さらなる制約は、既知の実験データの解析を通じて手動で定義されます。

ステップ1：配列の選択： オリジナルの配列選択法は、まずKlepeis et al.によって開発されました。15,16 この手法は、整数線形計画法（ILP）モデルを用い、設計テンプレートにおけるエネルギーに基づいてアミノ酸配列を選択し、順位付けします。その後、剛体（単一）テンプレート向けに計算効率の高い配列選択モデルを採用することで改良され、さらに柔軟なテンプレート向けモデルの開発を通じて拡張されました。この大域的最適化法はランダム変異に依存せず、理論的に全配列空間を探索し、大域的な解を決定することが保証されています。これは、他の既存のあらゆるアプローチと比較して、本手法が持つ大きな利点です。

単一構造モデル：Klepeis et al.15,16によって提案された配列選択モデルの原型は、Fung et al.28によってさらに洗練されました。その最終的な形式を式1に示します。

数式、制約を伴う最適化問題；数理最適化、記号表記。
集合 i=1,...,nは、設計テンプレートにおける残基位置を定義します。各位置iにおいて、変異はj{i}=1,...,miで表され、位置iが20種類の天然アミノ酸のいずれかへの変異を許容する場合、mi=20となります。k>iであるエイリアス集合k≡iおよびl≡jは、すべてのユニークなペア相互作用を表すために用いられます。アミノ酸変異をモデル化するために、バイナリ変数yj 下付き i 上付き j、数学表記、方程式内の変数。および一次導関数表記 y'_k、方程式、微積分の概念、教育用公式。が導入されます。モデルが位置iにアミノ酸jを割り当てた場合、変数yj 下付き i 上付き j、数学表記、方程式内の変数。は値1をとり、それ以外の場合は値0をとります（一次導関数表記 y'_k、方程式、微積分の概念、教育用公式。についても同様です）。目的関数は、設計テンプレートにおけるすべてのペアエネルギー相互作用の総和を表します。パラメーター抽象代数におけるテンソル表記の例；添字表記を示す数式。は、アミノ酸jが占める位置iとアミノ酸lが占める位置iとの間のエネルギー相互作用であり、2つの位置におけるα炭素または側鎖重心間の距離（xi,xj,）およびアミノ酸jとlの種類に依存します。これは、yj 下付き i 上付き j、数学表記、方程式内の変数。と一次導関数表記 y'_k、方程式、微積分の概念、教育用公式。の両方が1に等しい場合にのみ、目的関数に寄与します。

Fung et al.28は、定式化(1)が配列選択のための他の12個の同等の二次割当類似モデルよりも計算効率が有意に高いことを明らかにした28,29。特に、ヒトβ-ディフェンシン-2の2つの配列選択問題において、Klepeis et al.15,16によって提案されたオリジナルモデルを上回る性能を示した。これらの問題の複雑性は、一方が3.4x1045、もう一方が49個の線形生物学的制約を加えた6.4x1037であった。Pentium IV 3.2 GHzプロセッサ上のCPLEX 9.030を用いてこれら2つの問題を大域的最適解まで解いたところ、Klepeis et al.15,16のオリジナルモデルではそれぞれ53,263 CPU secおよび4,578 CPU secを要した。対して定式化(1)では、同様のタスクにわずか649 CPU secおよび14 CPU secしかかからず、これは計算効率においてそれぞれ82倍および327倍の向上に相当する。

加重平均モデル：Fung et al.28は、設計テンプレートが柔軟であり、一連の構造を含むというde novoタンパク質設計の典型的なケースに対処するため、2つのモデルを開発した。加重平均モデルでは、単一構造モデル（式1）のエネルギーパラメータ 静的平衡式 ΣE_ik^jl(x_i,x_k)wt(x_i,x_k,d) の方程式、数学的概念 (xi,xk)の代わりに、加重平均エネルギー 抽象代数におけるテンソル表記の例、インデックス表記を示す数学的表現 を使用する。重み wt(xi,xk,d) は、テンプレート構造において xi と xk の間の距離が距離ビン d に収まる頻度によって決定される。加重平均モデルの最終形式は式2に示される。

最適化問題の方程式、線形計画法モデル、制約条件とバイナリ変数、数学的定式化。
ディスタンス・ビン・モデル：柔軟なテンプレート構造のための2番目の配列選択モデルでは、バイナリ変数 bikd を導入することで、複数の構造からの距離情報を組み込んでいます。この変数は、xi と xk の間の距離が距離ビン d に該当する場合に1となり、それ以外の場合は0となります。また、別のパラメータとして導入された disbin(xi, xk, d) は、いずれかのテンプレート構造における xi と xk の間の距離が距離ビン d に該当する場合に1となり、それ以外の場合は0となります。アミノ酸ペアにつき1つの距離ビンのみが全エネルギーに寄与するため、目的関数内の抽象代数学におけるテンソル表記の例、添字表記を示す数式。 は 数学方程式 Σ E(x) 図、静的平衡、研究分析のための総和公式。 に置き換えられます。しかし、これにより目的関数に非線形性が導入されます。モデルの線形化および実行可能性のために追加が必要な制約に関する詳細は、Fung et al.28 を参照してください。ディスタンス・ビン・モデルは式 3 に示されています。

最適化問題の方程式。線形計画法モデル。制約条件とバイナリ変数。数式化。
上述のように定式化された整数線形計画法（ILP）問題15-17はいずれも、分枝限定法を用いて厳密に解くことができます。28-30これらの手法により、大域的な最小エネルギー配列への一貫した信頼性の高い収束が保証されます。

ステージ2：バリデーション： 図2に、ステージ2の2つのアプローチの詳細な概要を示します。この図では、最終的なランキング指標を算出するために必要な手順と、各ステップで生成される構造数が示されています。

フォールド特異性（Fold Specificity）：フォールド特異性は、ステージ1で導出された予備設計をランキングするために使用される指標である。この計算の目的は、エネルギー計算に基づき、各配列がテンプレート構造へどの程度適切にフォールドするかを、テンプレートの元の配列と比較して評価することである。この手法には2つのアプローチがあり、それぞれ計算負荷が異なる。

最初の手法はKlepeis et al.によって実施されました15,16。この手法では、決定論的な大域的最適化に基づくタンパク質構造予測フレームワークであるASTRO-FOLD 26,27,31-47 を利用しています。この手法は計算負荷が非常に高いため、現在のProtein WISDOMの実装には採用されていません。計算リソースの制限および、設計において潜在的に数百から数千の配列に対してこの計算を行う必要性を認識し、Fung et al.17はTINKER/CYANA48-50を用いたより効率的な手法を提案しました。この手法では、構造のフレキシブルテンプレートを定義します。フレキシブルテンプレートは、Cα 原子間の距離、ならびに残基のϕおよびψ角の上限値と下限値を用いて定義できます。単一の構造の場合、初期距離と二面角が使用され、境界は固定距離またはパーセンテージとして定義されます。デフォルトの境界は、Cα距離に対して±10%、二面角の境界に対して±10°です。フレキシブルテンプレートの場合、設計への入力として与えられたすべてのテンプレート構造で見られる最大値および最小値から境界を得ることができます。各配列に対して初期境界が定義されると、CYANA 2.148,49を用いて数百のコンフォーマーを含むアンサンブルが生成されます。コンフォーマーは、CYANAのねじれ角ダイナミクス模擬アニーリングプロトコルを用いて生成され、タンパク質を急速に加熱し、その後ゆっくりと冷却することで、サンプリングされたコンフォーメーションを追跡します。模擬アニーリングの後、ファンデルワールス半径の重なりによる衝突、ならびに距離および角度制約の違反を最小限にする局所エネルギー最小化が行われます。デフォルトでは、最終的に500個の構造が生成されます。各配列のアンサンブル内の各構造は、AMBER力場51 を用いたTINKER 3.650での局所最小化にかけられます。最小化された各構造の最終的なポテンシャルエネルギーが表にまとめられます。この全体的なアプローチを、開始配列および各候補変異配列に対して実行します。その後、以下のボルツマン分布（式4）を用いて、天然配列に対する各変異配列のターゲットフォールドへのフォールド特異性を算出できます。

天然状態および新規状態における静的平衡方程式 Σ(e^(-βEi))；数式。
近似結合親和性：近似結合親和性の算出法は、標的タンパク質と複合体を形成している設計配列の順位付けに使用されます。これらの計算は、ステージ1から得られた配列に対して直接行うか、あるいはフォールド特異性ステップで得られた高フォールド特異性配列に対して行うことができます。

Lilien et al.52は、タンパク質-リガンド複合体の近似的な結合親和性を算出する手法を提案した。この手法は、タンパク質、リガンド、およびタンパク質-リガンド複合体のロタマーベースのアンサンブルを生成し、それらのアンサンブルを用いて分配関数を算出することに基づいている。この近似的な結合親和性はK*で表記され、式5によって定義される。

ここ q光リポソーム（Photoliposomes） タンパク質-リガンド複合体の分配関数であり、 qb は遊離タンパク質の分配関数であり、 qL は、遊離リガンドの分配関数である。分配関数は式6で定義されており、そこでは集合が B, F および L 結合したタンパク質-リガンド複合体、遊離タンパク質、および遊離リガンドの、それぞれ回転異性体に基づいたコンフォメーションを含む。 En 配座エネルギー n, R は気体定数であり、 T 温度です。

Thermodynamic equilibrium equations; Σe^(-Eb/RT); scientific formula for internal energy.
構造予測： 計算を開始するためには K* 、各配列の3次元構造が必要となります。これはRosettaのAbRelax機能を用いて行います。53-55 Rosetta 3.4ソフトウェアパッケージの一部です。AbRelaxアルゴリズムの背後にある戦略は、タンパク質の局所構造は局所的な配列の影響を受けるが、配列のみによって一意に決定されるわけではないという実験的な観察に基づいています。モンテカルロアルゴリズムを用いて、局所的なタンパク質構造を配列由来の構造フラグメントに置き換えます。この手法により、埋没した疎水性残基、ペアを形成するβストランド、および特異的な側鎖相互作用などの非局所的な相互作用を考慮した、最終的なコンパクトなタンパク質構造が構築されます。

クラスタリング： 次に、AbRelaxで得られた構造をOREOを用いてφおよびψ角に基づきクラスタリングします。56,57 このクラスタリング手法により、構造アンサンブル全体の代表的な主鎖構造を明らかにします。上位10個の最大クラスターから得られた平均構造と、全体で最もエネルギーが低い構造を、標的タンパク質へのドッキング用に選択します。これにより、各ペプチド配列に対して11個の固有な主鎖構造が得られ、アンサンブル生成に主鎖の柔軟性が組み込まれます。

ドッキング予測：ドッキング予測にはRosettaDockを使用します。58-60各配列について、11種類のペプチド主鎖構造のそれぞれを標的タンパク質に対してドッキングさせます。本ケースでは結合部位が既知であるため、ペプチドを結合部位の近傍に配置し、結合部位に対して垂直方向に3 Å、平行方向に8 Åの並進移動、および8°の回転を許容します。RosettaDockは、低解像度および高解像度のドッキング動作にモンテカルロアルゴリズムを使用します。各ドッキングランにより、複合体構造の大きなアンサンブルが生成されます。11回のランそれぞれのうち、エネルギーが最も低い10個の複合体を、最終的なロタマーに基づくコンフォメーションアンサンブル生成の開始構造として使用します（1配列あたり110個の開始構造）。

最終アンサンブルの生成： RosettaDesign61は、fixbb関数を通じて側鎖のロタマーのみを調整することで多数の構造を生成できるため、最終的なロタマーベースのコンフォメーションアンサンブルの生成に使用されます。RosettaDesignに複数の開始構造を与え、各構造に対して残基をランダムに選択し、モンテカルロアルゴリズムを用いてロタマーを変更します。この操作を数千回のロタマー置換が試行されるまで繰り返し、分配関数に大きく寄与する最終的な低エネルギーコンフォメーションを得ます。

ペプチドアンサンブルを生成するために、規模の大きい10個のクラスターそれぞれからエネルギーが最も低い10個のペプチド構造と、全体でエネルギーが最も低い10個のペプチド構造を、RosettaDesignの開始構造として使用します（開始構造は合計110個）。各開始構造に対して200個のロタマーコンフォーマーを生成し、最終的に22,000個の構造からなるアンサンブル（式6における集合L）を得ます。このアンサンブルには、主鎖の柔軟性とロタマーの柔軟性の両方が組み込まれています。

複合体アンサンブルは、ドッキング予測ステップで得られた110個の開始構造を用い、開始構造あたり200個のロタマーコンフォーマーを生成することで同様に作成されます。最終的なアンサンブルサイズは22,000構造となります（式6のセットB）。柔軟性は、使用される多様なペプチド主鎖構造、多様なドッキングコンフォメーション、および各開始構造に対するロタマーコンフォーマーによって考慮されています。

タンパク質アンサンブルは、標的タンパク質の構造のみに対してRosettaDesignを実行することで生成されます。この例では、単一の開始構造から2,000個のロタマー配座が生成されるため、最終的なアンサンブルサイズは2,000構造となります（式6のFに相当）。

タンパク質WISDOM

Protein WISDOM（Protein Workbench for In Silico De novo design Of bioMoleculesの略）は、我々のde novoタンパク質設計フレームワークにユーザーフレンドリーな形式でアクセスできるようにした、アカデミックコミュニティ向けのオンラインツールです。単一のタンパク質鎖にテンプレートフォールドを導入させる設計から、標的タンパク質に結合する新規ペプチドの設計まで、一般的によく遭遇するいくつかの設計目的に対応しています。続く2つのセクションでは、遭遇する主な2種類のタンパク質設計問題に関するProtein WISDOMの機能について説明します。1つ目のタイプでは、指定された設計テンプレートにおいて有利な新規配列を選択するために配列選択（sequence selection）を適用し、その後、フォールド特異性（fold specificity）を用いてその新規配列を検証します。2つ目のタイプでは、複合体として結合したペプチドの新規配列を選択するために配列選択を用い、その後、フォールド特異性と近似結合親和性計算の両方を用いてその新規配列を検証します。

ユーザー登録

Protein WISDOMのウェブページ http://www.proteinwisdom.org にアクセスしてください。

ページ右上のユーザーログインボタンをクリックしてください。登録するには「こちらをクリック」をクリックしてください。

メールアドレスと希望するユーザー名に関する情報を入力し、「次へ（Continue）」をクリックします。

氏名、所属機関、グループ、住所などの追加情報を入力してください。利用規約に同意するチェックボックスを選択します。「登録を送信する」ボタンをクリックしてください。

ステップ1：配列の選択

タンパク質配列およびテンプレート構造の提出

ユーザーログインボタンをクリックして、タンパク質設計実験を開始します。ユーザーには「ユーザーホームページ」(図3)が表示され、そこには送信済みのジョブ数、アップロード済みの構造（テンプレート）数、およびこれまでにアップロードした構造の一覧が記載されています。

「Create New Job」をクリックして、新しいデザインジョブを開始します。ユーザーは「Job Submission」ページ（図 4）に移動します。ジョブに名前を付け、それが以前のジョブに基づいているかどうかを指定します（すなわち、同じデザインテンプレート、変異セット、および生物学的制約を新しいジョブにインポートできますが、ユーザーは変異セットや生物学的制約を変更することが可能です）。「continue」をクリックします。

設計テンプレートのタンパク質構造をアップロードします（図 5）。このテンプレートは、標準的なタンパク質データバンク（PDB）形式である必要があります。剛体テンプレート（すべての原子に対して1つの座標セットを持つもの）または柔軟なテンプレート（NMR溶液構造から得られたものなど、複数のモデルを持つもの）のいずれかを使用できます。単一のタンパク質を設計する場合、テンプレートには1つのチェーンしか含めることができません。ユーザーは新しいテンプレートをアップロードするか、以前にアップロードした既存のテンプレートから選択できます。可能であれば、オプションでテンプレートのpdb IDを指定してください。複数のテンプレートをアップロードする場合は、各モデルが "MODEL #" で始まり、"ENDMDL" で終わっていることを確認してください。すべての残基が天然アミノ酸で指定されていることを確認します。「Continue」をクリックします。

テンプレートのアップロードが成功すると、Protein WISDOMにテンプレート内で検出された残基数、チェーン数、およびモデル数が表示され、配列がリストアップされます。その後、ユーザーにテンプレートの確認が求められます。テンプレート構造が正しく入力されていることを確認し、「Continue」をクリックしてください。

テンプレートのアップロードと確認が正常に完了すると、ユーザーは「メインコントロールページ」に移動します（図 6）。このページでは、ジョブのステータス確認、変異セットおよび生物学的制約の修正、そしてステージ1：配列選択のジョブ送信を行うことができます。この時点ではステージ1が完了していないため、ステージ2のオプションは表示されません。ステージ1の結果が得られると、これらのオプションが表示されます。

変異セットの選択

「メインコントロールページ」にある「Mutation Sets」リンクをクリックして、変異セットを定義します。

変異を許可する残基を選択し、それらがどのアミノ酸に変異することを許可するかを選択します(図 7)。デフォルトでは、任意の部位における許容アミノ酸は、溶媒接触表面積 (SASA) に基づいて選択されます。変異セットの設定が必要です。

変異セットを選択した後、「Save Changes」をクリックします。ユーザーは変異セットの編集を継続して行うことができます。変異セットの編集が完了したら、クリックして「Main Control Page」に戻ってください。

生物学的制約の選択

「メインコントロールページ」の「生物学的制約」リンクをクリックして、生物学的制約を定義します。

タンパク質全体またはその一部において、電荷またはアミノ酸組成の制約を指定します（図 8）。

必要に応じて、許容される総変異数を制限してください。生物学的制約の設定は任意です。完了したら、クリックして「メインコントロールページ」に戻ってください。

ステージ1の提出：配列の選択

「Begin Stage 1」リンクをクリックして、ユーザーを「Submit Stage 1」ページへ移動させます。

設計するチェーン（図 9）、生成する配列数、距離依存性力場、およびモデルを選択します。複合体を設計し、折り畳み特異性（Fold Specificity）の計算を希望する場合は、設計するチェーンを1つだけ選択する必要があります。アップロードしたテンプレートが単一構造であるか、「リジッドテンプレート」である場合は、「Single Structure」モデルのみが使用可能です。アップロードしたテンプレートがフレキシブルな場合は、「Single Structure」、「Weighted Average」、「Distance Bin」の3つのモデルから選択できます。解決すべき最適化の計算複雑性に注意してください。許容される計算複雑性の上限は 2025 です。

ジョブを送信します。ユーザーは「メインコントロールページ」にリダイレクトされます（図10）。ジョブのステータスが更新され、現在の進行状況が表示されます。送信後、ジョブは編集ロック状態になります。

ジョブが完了すると、ユーザーに設計された配列のリストを含む結果メールが届きます。結果は「Main Control Page」でも確認可能です。ページ上には「Stage 2: Fold Specificity」のボックスが表示され、ユーザーはこの検証を実行することができます。

ステージ2：Fold Specificity（倍率特異性）の算出

フォールド特異性の投稿

「Begin Stage 2: Fold Specificity」をクリックして、「Build Stage 2」ページに移動します。テンプレート柔軟性係数を距離のパーセンテージまたは固定距離で指定し、Cα-Cα距離の上限および下限を定義します。テンプレート柔軟性係数をパーセンテージで指定し、φおよびψ二面角の上限および下限角度を定義します。フレキシブルテンプレートを使用する場合、距離の上限および下限は、すべてのテンプレートモデルにおける最小および最大距離値として設定されることに注意してください。同様に、角度の上限および下限は、すべてのモデルにおける最大および最小角度値から設定されます。

「送信」ボタンをクリックします。

配列あたりに生成する構造数を指定し、「Continue」をクリックします。なお、生成できる構造数は1配列につき最大500個までであることに注意してください。

「Continue」をクリックして、フォールド検証への提出を確定してください。ステージ1およびステージ2は、ステージ2が完了するまで編集不可となります。

ジョブが完了すると、結果が記載されたメールがユーザーに送信されます。Protein WISDOMの「Main Control Page」で結果を確認してください（図11）。ここでは、設計された配列、ステージ1からの対応するエネルギー値、およびステージ2からの折りたたみ特異度値を含むテキストファイルを表示およびダウンロードできます。さらに、「View Results」リンクをクリックすると、ステージ1のランクとエネルギー値、およびステージ2のランクと折りたたみ特異度値を示すテーブルがブラウザに表示されます。

ステップ3：タンパク質-ペプチド複合体の近似結合親和性計算

近似結合親和性の算出では、設計したリガンドタンパク質/ペプチドと複合体の残りの部分との親和性を計算します。これらの算出は、ステージ1の直後、またはフォールド特異性の算出が完了した後に行うことができます。

「Sequence #」をクリックして、近似結合親和性計算を開始する配列を選択します。ユーザーは「Select Sequence」ページに誘導され、そこでは設計された配列のリストとともに、配列の選択順位およびフォールド特異性ランクが表示されます。近似結合親和性の計算には非常に高い計算負荷がかかるため、一度に選択できる配列は1つだけです。1つの配列の計算が完了すると、ユーザーは別の配列を選択して近似結合親和性を計算させることができ、この結果は前の結果に追加され、完了したすべての配列の近似結合親和性が表示されます。配列を選択して保存すると、ユーザーは「Main Control Page」にリダイレクトされます。

「Begin Stage 2: Approximate Binding Affinity」をクリックしてジョブを送信します。完了すると、シーケンス番号、近似結合親和性、および式6における分配関数の値を含む添付ファイルがユーザーにメールで送信されます。それ以降の近似結合親和性ジョブにおいて、このファイルには完了したすべてのシーケンスの結果が含まれます。全結果（シーケンス選択、フォールド特異性、および近似結合親和性）は、ジョブの「Main Control Page」にアクセスすることでも確認できます（図12）。

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結果

De Novo 設計によるHIV-1進入阻害剤の作製

Protein WISDOMに実装されたde novo設計フレームワークは、いくつかの重要な治療システムの阻害ペプチド設計に使用されてきました（表1および2）。特筆すべきシステムの一つに、宿主細胞受容体CD4へのHIV-1侵入を阻害するペプチドの設計があり、ここではProtein WISDOMインターフェースの実用的な使用を実証するための代表的なシステムとして用います。これらのペプチドは、宿主Tヘルパー細胞へのHIV-1の融合および侵入において重要な役割を果たす膜貫通サブユニットgp41を標的とするよう設計されました。なお、結果は必ずしも元の論文に提示されたものと同一になるとは限りません。これは、本手法のこの部分で使用されるRosetta法の確率論的な性質と、元の論文発表以降にRosetta2.3からRosetta3.4へアップデートされたことによるものです。

ジョブを開始するには、ユーザーが有効なタンパク質設...

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ディスカッション

de novoタンパク質設計フレームワークは、配列選択段階と検証段階の2つの段階で構成されています。このフレームワークは、剛性と柔軟性のあるデザインテンプレートを処理するのに十分な堅牢性を備えており、単一のタンパク質デザインまたは複雑なタンパク質デザインに適用できます。このフレームワークは、数十の疾患に応用できる多数のタンパク質システムへの適用に成功しています。多くのデザインが実験的に検証されており、これまでに発見されたいくつかのタンパク質の最も強力な阻害剤またはアゴニストを提供しています。このフレームワークは、Protein WISDOMを介して学術コミュニティに提供されるようになりました。

この方法には 3 つの重要なステップがあります。1つ目は、タンパク質設計にグローバル最適化技術を採用した配列選択段階です。タンパク質設計問題は、非常に複雑な問題です(n個の変異可能な位置に対して20個の可能な配列)。この数は、実験計画法で考慮できる可能なシーケンス数よりも大幅に多くなります。突然変異と生物学的制約をさらに組み込むことで...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

CAFは、NSF、NIH(R01 GM52032;R24 GM069 736)、および米国環境保護庁、EPA(R 832721-010)です。この研究の一部は、国防総省(Air Force Office of Scientific Research)の政府の支援を受けて実現しました。JSはNIH(P50GM071508-06)からの支援に感謝しています。 MLBPは、National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship(32 CFR 168a)からの支援に感謝します。GAKは、米国国立科学財団大学院研究フェローシップ(助成金番号DGE-1148900

)からの支援に感謝します。

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