方法論記事

従来のホログラフィック光トラッピング機能を備えた高分解能顕微鏡の構成

DOI：

10.3791/50481

⸱

2013年4月22日

 ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, University of Utah

この記事について

サマリー

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ここに記載されているシステムでは、複数のトラップを作成し、操作することのできる伝統的な光学トラップと同様に、独立したホログラフィック光トラッピングラインを採用。また、生物学的酵素活性の同時高速·高分解能な測定を可能にしつつ、屈折率粒子の複合幾何学的配置の作成を可能にする。

要約

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光学トラップの高解像度顕微鏡システムは、このような誘電ビーズ1または細胞小器官2,3と同様に、トラップの中心に対してそれらの位置の高空間分解能と時間分解能の読み出し用として、様々な屈折オブジェクトの正確な操作が可能になります。システムがここに980nmの1つのこのような "伝統的な"トラップ動作が持って説明。それはさらに、同時に波長1064nmにおける4,5顕微鏡の視野内に複雑なトラッピングパターンを作成し、操作するために、市販のホログラフィックパッケージを使用して第二の光学トラップシステムを提供する。同時に高速およびナノメートルスケールでのピコニュートン動作と力の生産高分解能測定を行いながら、2系統の組み合わせは、同時に複数の屈折オブジェクトの操作を可能にする。

概要

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光トラッピングは、生物物理学6における主要技術の一つである。光トラッピングに重要な進歩は、三次元の捕獲パターンではなく、従来のポイントトラップ7の作成 ​​を可能にするホログラフィックトラップの開発をされています。このようなホログラフィックトラップは屈折オブジェクトの位置で汎用性の利点を持っています。しかし従来のトラップは簡単に市販のホログラフィックキットよりも対称に整列させることができる。彼らはまた、閉じ込められたオブジェクトの迅速正確なトラッキングを可能にします。ここではひとつの楽器で2トラッピングのアプローチを組み合わせて、ユーザーが必要に応じて両方の利点を活用できるようにするシステム（ 図1）について説明します。

構築光学トラップ（単一または複数のレーザービームに基づく）の一般的な考察は別の場所8-10詳細に議論されています。ここで、私たちはsに固有の考慮事項を概説etupと当社アライメント手順の詳細を提供。例えば、2つの光トラッピングビームを有するシステムは、典型的には、屈折物体を捕捉し、捕捉された物体の位置のデカップリング読出しのために（意図的に低電力ビーム）その他を使用するための1つのレーザビームを用いて、（ 例えば、参考文献11）の前に記載されている。ここしかしながら、両方のレーザビームは、両方の捕捉のために使用されるので（300 MWまたはより高い）動力高くする必要がある。生物系の測定では、トラッピングのため使用されるレーザーは、最適に光誘発タンパク質分解1を最小化するために波長の特定のNIRウィンドウ内に収まる必要があります。ここでは、980 nmのダイオードとするため、低コスト、高可用性と操作のしやすさの1,064 nmのDPSSレーザーを使用することを選択しました。

また、4,5、リアルタイムで同時に複数のトラップを作成し、操作する空間光変調器（SLM）を使用することを選択した。これらの装置は市販されているしかし完全なセットアップへの統合は、ユニークな課題を提示。ここでは、これらの潜在的な困難に対処し、汎用性の高い楽器を提供する実用的なアプローチを説明する。我々は、変更された設計のためのガイドとして使用することができる具体的なセットアップのための明示的な例を提供します。

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プロトコル

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1。 980nmの波長シングル光学トラップの設置

  1. 980nmの波長における光トラッピングは、多くの場合、生物物理学実験で安価なレーザダイオードに最適な300 mWのような高い電力出力で容易に入手可能である。これは、公知のモードフィールド径を有する偏波面保存シングルモードファイバピグテールとするダイオードレーザが好ましい。繊維は、モードフィルタとして機能する十分な長さが必要であり、一般的にFC / PCまたはFC / APCコネクタのどちらかで終了します。これらのうち、FC / APC光と潜在的なフィードバックの不安定性の反射を最小限に抑えるバックすることが好ましい。
  2. 電力と温度制御を可能にするマウントで980 nmのレーザダイオードを固定します。受動的な放熱を最大化することにより、温度調節器の故障に起因するダイオード障害の危険性を最小限に抑えるために、直接光学テーブルにマウントを固定することをお勧めします。
  3. 光学コリメートビームにPC / APCファイバコネクタを取り付けます。それは調節可能な光ファイバポートが最も有用であるので、平行ビームは、最小限の発散を持っていることを保証することが重要。選択された光ファイバポートは、ダイオードピグテールファイバのモードフィールド径と一致することを確認する。ビームは音響光学偏向器（AOD）又は電気光学偏向素子を用いてラスターする場合（EOD）はコリメートレーザビームウエストはまた、デフレクタ開口の大きさよりも僅かに小さくなければならない。
  4. ビームルーティング、拡張、および他の所望のコンポーネントの配置を可能にするために、顕微鏡から十分な距離を置いて光学テーブルへコリメートアダプターを固定します。顕微鏡への全体的なビーム経路に匹敵する距離で一貫性のあるビームウエストを確保するためのファイバーポートを調整します。
  5. 図1に示されているミラーを取り付けます。顕微鏡から目的を削除し、客観的な取り付けの段階で開口を通してルートにビームをミラーを使用しています。望ましい場合には、ダイクロイックミラーDM1とDM3の配置はまで省略することができます後で。 DM2とDM3はショートパスの両方であり、IRに近く、上記反射する可視光を透過する。
  6. 一時的に顕微鏡の光軸上に整列目的の代わりに赤色レーザーポインタを、マウントすると便利です。カスタムメカニカルアダプタは、レーザーポインタのセンタリングを確保することが必要である。レーザーポインタからの可視光は、その後ファイバーポートの開口部の中央に戻ってルーティングすることができ、その後レンズを（下記参照）をインストールするために使用することができます。
  7. 必要に応じて1としてステアリングコンポーネント（AODまたはEOD）の将来の挿入を可能にする光ファイバポートから適切な距離で980 nmのビームエキスパンダー（L8とL9）をインストールします。拡大ビームは、わずかに目標の後焦点絞りを入れすぎなければなりません。 （ここでは、125ミリメートルと60ミリメートルの焦点距離を持つレンズは約ビームウエストを倍増するためにケプラーの配置である。）適切なレンズ配置と粗いアラインメントを確保するために目に見えるレーザーポインタービーム（1.6節を参照）を使用します。
  8. インストール示された（ここで両方とも60ミリメートルの焦点距離を有する）1と望遠鏡配置lで980 nmの操舵レンズ（L2 ​​及びL3）。 L3は、対物レンズの後側焦平面に共役な面に取り付けられている。ビームステアリングを可能にする高精度XYZ位置決めステージ上にマウントL3。それは繰り返し位置決めとトラップの再配置を可能にする、そのためのマイクロデジタルインジケータを持つXYZステージのために有用です。 0.5 "は、旅行の範囲は通常は十分ですが、光軸に沿ってL3の位置決めのためのより長い旅行が役に立つかもしれません。適切なレンズ配置と粗いアラインメントを確保するために目に見えるレーザーポインタービーム（1.6節を参照）を使用します。

2。レーザー検出器の設置

  1. 図1に示すように、コンデンサ上記ダイクロイックミラーDM3をインストールする。カスタムマウントは、通常必要とされる。コンデンサーアセンブリの側面にクワッドフォトダイオード（QPD）や位置敏感型検出器（PSD）8を確保し、ENS980 nmのレーザービームがDM3によって反射することUREは大体中央にそれに当たっている。 QPDを使用する際には、レーザビームのセンサーの正確なセンタリングを可能にするにはXYステージ上に搭載されていることを確認する。
  2. DM3とセンサの間のL1を（通常は30 mmレンズ）をインストールします。センサー上の単一スポットにビームを集束するように位置は、L1。
  3. L1は顕微鏡照明と周囲の照明から1,064 nmのビームと同様の浮遊可視光の反射を遮断するために直前にノッチフィルタを取り付けます。

3。 1,064 nmの波長ホログラフィトラップの設置

  1. セットアップのホログラフィックの部分は、このパッケージで使用されるホログラムミラーは5または10 W / cm 2での最大入射電力定格されている市販のハードウェア/ソフトウェアのパッケージを中心に構築されています。この電力範囲内の単一モードTEM00ビームは簡単に1,064 nmの波長でDPSSレーザーから供給することができます。
  2. 高架上の1,064 nmレーザーをマウントプラットフォームは、およそ980ライン（第1参照）のビーム経路の高さを一致させる。
  3. 直接制御できない場合は、レーザパワーを手動で右側のレーザ出力開口後の半波長板（HWP）と偏光子（PBS）をインストールすることによって調整することができる。これは、ビームの偏光のためのホログラムミラー要件に一致させることができるように回転ステージの偏光板を取り付けることが有用である。
  4. 1,064 nmのビームエキスパンダー（L6とL7）をインストールします。レーザービームウエストは、ホログラフィックミラーの対角サイズに合わせて拡大されている必要があります。大拡張比（10倍以上）のためには、小さなパンダの大きさを維持するために心配かもしれません。 （：16 mmであり、ここでは175ミリメートル）従って、異常に小さい焦点距離のレンズを使用することが望ましい場合がある。
  5. 客観を通じて1,064 nmのビームを向けるように示されているように、他のミラーを取り付けます。
    1. それはundiminishe可能になるようにセキュアDM1キネマティックマウントにおけるダイクロ（入射45°の角度）とは、980 nmの光路内にアセンブリを配置そのビームのD伝送。
    2. レーザーポインターの光をアクティブにします。 DM1ミラーが適切にこのビームの経路内に空間光変調器（SLM）を位置決めする可視光の量を十分に反映すべきである。 SLMは、着信および発信のレーザービームは、通常の発生率にできるだけ接近しているように、角度を付けする必要があります。しかし、入射角は、レーザビームがレンズマウント、および他の光学部品によってクリップされないように十分に大きくなければならない。 5°の角度が容易に達成されると十分に小さい必要があります。最後DM1からSLMまでの距離を正確にレンズL4とL5の挿入が（下記3.6を参照）SLM鏡面と客観のバック焦点面を活用できる​​ように、測定されなければならない。
    3. 1,064 nmのビームエキスパンダからSLMに光を導くためにミ​​ラーを取り付けます。レーザーポインターの光が中央にビームエキスパンダー開口に当たることを確認してください。
  6. L4とL5レンズを取り付けます（ここでは12のレンズそれぞれ5mmで200ミリメートル）。この望遠鏡のペアは、対物レンズの後焦点面にSLM鏡面をコンジュゲートし、また少しだけ入れ過ぎに目的の背面開口部をビームウエストを減らすことができます。私たちは、SLM離れDM1から空間に長い焦点距離のレンズを選んだ。これにより、第2のレーザ線の余地をクリアしなくアライメントを容易にする傾向があるのみならず。
  7. レーザーポインタを削除します。粗いアラインメント絞りとして機能するようにマウントアダプタにしておきます。

4。システムのインストールとアライメント注意

  1. 目的の後焦点面と光学的に共役になるようレンズL3とSLMがように配置しなければなりません。光トラッピングビームが顕微鏡の無限大の空間に注入される場合、L4とL5の共通の焦点が試料面に光学的に結合している。
  2. 歌うIRカードビューアはレーザーポインターのアダプタの開口部の中心軸に沿って移動する980 nmの光を合わせます。
  3. IRカードTを使用して、oが1,064 nmのビームはDM1、L2、およびL3上と1,064 nmのビームはレーザーポインターのアダプタの開口部の中心軸に沿って行くことを980 nmのビームと同じスポットに当たることを確認してください。
  4. を目的としたレーザーポインターマウントアダプターを交換します。高開口数の対物油または水が典型的である。
  5. レーザービームを"歩く"ことで9で説明したように放射状に対称の干渉パターンをカメラで見られるまで980 nmのトラップの位置を合わせます。
  6. ホログラフィックミラーをオフにして（ つまり、受動的ミラーとして機能）1,064 nmのトラップを整列させる非回折1,064 nmの光を"歩く"ためにSLMとDM1を使用しています。
  7. SLMは、視野内の強い不動レーザートラップをもたらす重要な非回折ビームを生成する。これは、位置合わせのために有用であるが、実験のために望ましくないかもしれません。このトラップをブロックするには一つ（試料面に位置共役な非回折光の経路に小さな不透明なオブジェクトを挿入することができます例えば番目L4とL5）のE共通の焦点。この中央のスポットブロッカーが集光された光（記載されているシステムのための100-300ミクロン径のブロッカー）のためのエアリーディスクの直径よりも若干大きくする必要があるのサイズ。
  8. SLMの向きを一致させる偏光子を用いた1,064 nmのビームの偏光をdjust。所望に応じて光の出力パワーを設定する半波長板を回転させる。
  9. 必要に応じて、980 nmのレーザー線にAOD又はEODビームステアリング要素を挿入。目的のバックフォーカルプレーンにこれらの要素の適切な共役を確保し、トラップを再調整。ゴニオステージ上ステアリング要素をマウントすると便利です。

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結果

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組み立てられた設定は、オペレータがリアルタイムで複数の屈折オブジェクトをトラップし、視野内の全ての三次元的にそれらを配置することができる。我々は11マイクロスフェア（ 図2）トラップして楽器のホログラフィック機能を示す。各オブジェクトを閉じ込めるトラップは手動で、最終的な配置が、この実験を行ったユタ大学のロゴを示すように、トラッピング時に再び配置されている。ホログラフィック従来のトラップを合わせた機能は、 図3に示されている。従来のトラップは徐々に速くなり、中央のビーズを移動（1.3、10および82ミクロン/秒のトラップ速度が表示されています）、ホログラフィックに定義トラップは静止したままで。最高速度で、ビード全体の動きは、映像の1フレーム分の記録時に発生するので、極端なモーションブラーとして現れる。それは十分に速くビーズhだけトラップ電位から強制されるという従来トラップを移動させることができるydrodynamicドラッグ（図示せず）。

視野内の微小球体の数がフルアセンブリ（ 図2

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ディスカッション

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我々は、オブジェクトの操作および測定するための別々の捕捉機能を提供する異なるタイプ（ 図1）の二つの光学トラップを組み合わせた器具を構築した。 "従来"光学トラップは980 nmのダイオードレーザーを中心に構築されています。このビームは、拡大して操縦した後（ 図1の"光赤"ビーム）当社の倒立顕微鏡に注入される。ホログラフィック光学トラップは1,064 nmのDPSSレーザーを中心に構築されています。ビームは、空間光変調器（SLM）のサイズに合わせて拡大して低入射角でSLMから反射され、わずかに対物レンズの後焦点開口部を過剰充填を減らし、ダイクロイックを使用して、 "従来の"トラップラインと組み合わされるミラー、そして最終的に我々の顕微鏡に注入（ 図1の"暗赤色"ビーム）。 SLMは、光学的に客観の後焦点面に共役な平面に配置しなければならないことに注意してください。

プロトタイプでCOLセクションでは、私...

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開示事項

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著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

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資金はユタ大学によって提供されました。我々は有益な議論のために博士J.徐（UCマーセド）博士BJNレディ（UCアーバイン）に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
光学テーブルニューポート コーポレーションST-UT2-56-8カリフォルニア州アーバイン
顕微鏡、反転、日食 Tiニコン USAMEA53220ニューヨーク州メルビル
プラン apo 100X オイル対物レンズ (1.4 NA)ニコン USAMRD01901ニューヨーク州メルビル
オイルコンデンサー レンズ 1.4 NAニコンUSA MEL41410ニューヨーク州メル
ビル EMCCD カメラAndor テクノロジー米国Ixon DU897サウスウィンザー、コネチカット州
1/3" CCD IEEE1394カメラNET USA IncFoculus FO124SCHighland IN
レーザー、TEM00、SLM、1,064 nm 波長Klastech Laser TechnologiesSenza-1064-1000ドルトムント;ドイツ
レーザーダイオード、TEM00、SLM、980 nmAxcel PhotonicsBF-979-0300-P5Aマールボロ、MA
レーザーダイオードマウントILX LightwaveLDX-3545、LDT-5525、LDM-4984ズマン、MT
調整可能なファイバーポートThorlabsPAF-X-11-Bニュートン、ニュージャージー
ホログラフィックシステムArryxHOTKIT-ADV-1064、イリノ
イ州ホログラフィックミラーボルダー非線形システムこれは、HOTKIT-ADV-1064ラファイエット、CO
方解石偏光子ThorlabsGL10-Bニュートン、ニュージャージー
半波長板ThorlabsWPH05M-1064ニュートン、ニュージャージー
偏光子回転マウントThorlabsPRM1ニュートン、ニュージャージー
半波長板回転マウントThorlabsRSP1ニュートン、ニュージャージー州の一部です
シャッターThorlabsSH05ニュートン、ニュージャージー州
ダイクロイックミラー(DM2&DM3);45度;AOIChroma Technologyt750spxrxtベローズフォールズ、VT
ダイクロイックミラー(DM1)、45°;AOIThorlabsDMSP1000Rニュートン、ニュージャージー州
カスタムメカニカルアダプターThorlabsSM1A11およびAD12F、拡大インナーボアニュートン、ニュージャージー州ノ
ッチフィルターSemrockFF01-850 / 310-25ロチェスター、NY
音響光学ディフレクター(2軸)intraActionDTD-584CA28ウッド、イリノイ
州ゴニオメトリックステージニューフォーカス9081カリフォルニア州サンタクララ
60 mm ステアリング レンズThorlabsLA1134-Bニュートン、ニュージャージー州
16 mm 非球面エキスパンダー レンズThorlabsAC080-016-Cニュートン、ニュージャージー州
175 mm エキスパンダー レンズThorlabsLA1229-Cニュートン、ニュージャージー
スポット ブロッカー (カブロン鋼球)Bal-Tec直径 0.0100"ロサンゼルス、カリフォルニア州
マイクロスフィア (カルボキシルポリスチレン)SpherotechCP-45-10Lake Forest, IL
ボー州シカゴ州州 州ベル州

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23, 247-285 (1994).
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