肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

サマリー

肺炎球菌によるマウス鼻咽頭のコロニー形成および後の付着またはリクルートされた細胞の抽出について説明する。この技術は、ナアレスを通して鼻咽頭および流体の収集を洗い流し、その場所でのmRNA発現の差動細胞定量および分析を含む様々な読み出しに適応可能である。

要約

肺炎球菌による鼻咽頭コロニー形成は、肺^{または血流1}に侵入する前提条件である。この生物は、鼻咽頭の粘膜表面を植民地化することができ、宿主の他の組織に侵入するために宿主防御を克服し、増殖し、最終的に克服することができる。通常下気道に感染を起こすと肺炎が生じる。あるいは、細菌は、高い死亡率²に関連する細菌血症を引き起こす血流に広がり得るか、またはそれ以外の場合は肺炎球菌性髄膜炎の発症に直接導く。鼻咽頭コロニー形成の運動学および免疫応答を理解することは、S.肺炎感染モデルの重要な側面である。

我々の鼻腔内コロニー形成のマウスモデルは、ヒトモデル³ から適応され、鼻咽頭^4-7における宿主病原体応答の研究において複数の研究グループによって使用されている。モデルの最初の部分では 、S.肺炎 の臨床的分離株を使用して、ヒト成人のキャリッジイベントに似た自己制限細菌コロニー形成を確立する。本明細書で詳述される手順は、細菌接種の調製を含み、続いて鼻腔内投与経路を介して接種を送達することによってコロニー形成事象を確立する。居住マクロファージは、定常状態の間に鼻咽頭の主要な細胞型である。典型的には、未感染マウス⁸に存在するリンパ球はほとんど存在しないが、粘膜コロニー形成は、免疫応答とその後の宿主免疫細胞の動員をもたらす低位から高等級の炎症(細菌種および株の病原性に応じて)をもたらす。これらの細胞は、ナレスを通して気管内容物の洗浄によって単離され、感染の動態をよりよく理解するためにコロニー形成細菌の密度と相関することができる。

プロトコル

開始する前に:特に明記されていない限り、すべてのステップはバイオハザードレベル2(BSL2)生物学的安全キャビネット(BSC)で行われます。実験開始前に、感染性細菌病原体の使用に関する適切なバイオハザード承認を、施設ガイドラインに従って取得していることを確認してください。また、事前に準備した手順を実施するために必要な材料と試薬をすべて用意してください。これらの実験で使用されたマウスには、ジャクソン研究所、チャールズ川またはタコニックの雌C57BL/6マウスが含まれており、10〜14週齢であった(鼻コロニー形成クリアランスまたは感染の運動学に性別依存的有意な差は見つかっていない)。これらの実験で使用されたすべてのマウスは、特異的病原体の自由な条件下で飼育および維持され、一般的なウイルス(LCMV、MNV、MPV、レオウイルスECTV、およびその他の)細菌(例えば、ピロリ菌)および寄生虫(例えば、ピノリ、エクトパラサイト)を、便サンプル検査およびセンチネルコド内の頻繁な解剖学的評価によって含まなかった。これらの実験を行う際には、10~12週未満で、6ヶ月未満のマウスを使用することをお勧めします。この年齢範囲より若いまたは古いマウスは、より長い鼻咽頭のキャリッジ期間に影響を受けやすく、感染を広める可能性が高くなります。マウスの背景は、異なる遺伝的背景のマウスがS.肺炎D39(血清型2)株^9,10に異なる感受性を有することを示しているので、コロニー形成実験の結果に影響を与える可能性のあるもう一つの重要な考慮事項である。S. 肺炎は天然のネズミ病原体ではなく、その唯一の天然貯水池はヒト鼻咽頭である。伝達は呼吸液滴を介して起こり、マウスは呼吸分泌を産生しなくて、個々のマウスは他のマウスに細菌を伝達することができないので、マウスからマウスへの伝達^に関する懸念はない。この原稿に記載されている手順の概要については、図1を参照してください。

1. S. 肺炎文化の 準備

1. 肺炎球菌の懸濁成長のためのトリプティック大豆寒天の5 mlを接種する。
2. 5%CO2の37°Cでの静条件下での培養は、600nmに設定された走行距離計で決定された10⁸ CFU/mlの対応する液体密度で、細菌の接種が対数相成長に達する。このCFUに対応する正確な読み取り値は、特定の選択された細菌株によって異なります。肺炎のS.肺炎のほとんどの株のために、これは0.45-0.55のOD₆₀₀範囲に対応する。典型的には、液体培養中のS.肺炎株は、サブキュリングを必要としない推奨条件下で1.5〜2.5時間以内にこの密度に成長する。これは、細菌がもはや対数相成長ではなく、広範な自己起合を受けている点を表すので、培養物が過剰増殖(0.75のOD読み取り値を超えて)許されるべきではない。
3. 各マウスは約¹⁰⁷ 個の細菌を接種する。したがって、9匹のマウスがコロニー形成されるたびに、ピペット1mlの接種液をエッペンドルフ管に入れ、15,000xgで1分間回転させる。白っぽいペレットが見えるはずです。上清を取り除き、ペレットを乱さないよう気をつけて、100μlのリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で細菌を再懸濁し、濃度を10⁹ CFU/mlに増加させます。この段階では、細菌は生存可能であり続けるべきであるが、容易に複製されない。
4. 複数のアリコートを使用する場合は、1つのチューブに組み合わせて、細菌密度のわずかなサンプル間変動を制御します。
5. 細菌を接種の準備ができるまで氷の上に置いておき、最大1時間保管してください。
6. 正確な細菌数を得るために、きちんとした細菌接種から始まる対数的な連続希釈シリーズを行う。連続して10倍に希釈し、10 μlを90 μlの無菌PBSに加えます。
7. 希釈液の10 μlサンプルの3滴をプレートアウト 10^{-5 -} 10^-9、プラスPBSのみの汚染制御、トリプティック大豆寒天(TSA)プレートの5%の羊の血液を補った別々にラベル付けされたセクションに(図2)。ピペットチップは、余分な細菌を持ち越し、結果のばらつきを避けるために、より高いCFU濃度から低いCFU濃度に希釈する各ステップに対して変更されることを確認してください。ヒト血寒天(HBA)プレートもTSAの代わりに使用することができる。 S.肺炎 の多くの株はネオマイシン(5〜20 μg/mlから)に耐性があるので、この抗生物質はプレート調製段階で選択した寒天培地に添加することもできる。これは、非耐性細菌を排除するので、列挙を容易にします.各株の抗生物質感受性は、各細菌株に使用する抗生物質の最適濃度を決定するために事前にテストする必要があります。
8. 15〜30分間乾燥させ、プレートを覆い、37°Cと5%CO2に設定した細菌インキュベーターに逆さまに置きます。24時間プレート上の細菌コロニーを育てる。
9. コロニー形成ユニットの数とそれに対応する濃度を決定します。OD₆₀₀値の決定に基づいて、濃度は1-4 x 10⁹ CFU/ml.S.の範囲内にあるべきであり、肺炎のコロニーは黄色がかった小さなコロニーとして現れ、中央に小さなくぼみがドーナツのような外観を与える(図3)。

2. ネズミの鼻腔内コロニー形成

1. マウスをマウスの抑制装置(先端を切り取って絞りを作る修正された50mlファルコンチューブ)に置いて拘束し、鼻が拘束装置の先細りの端から出てくるように親指で体の付け根で固定する(図4)。この装置の使用は動きを最小にする方法でマウスの頭部の固定化およびナレスの分離を可能にするだけでなく、ピペット先端を咀嚼する動物からの試みを妨げる、接種の完全な送達を可能にする。あるいは、マウスは首での擦り傷および手動拘束によって固定することができる。鼻腔内接種前の動物の麻酔は推奨しません。麻酔下で動物に接種を管理すると、肺に広がる接種の一部が生じる^。
2. P10またはP20ピペットを使用して、調製した培養物の10μlを堆積させて各マウスを接種し、両ナレス間で均等に分配する(接種を徐々に脈動させて鼻に滴り落ちるようにし、マウスが接種に時間を取る)。接種の完全な送達を達成するために、マウスが鼻を過度に動かし始める任意の時点で投与を一時停止する。マウスは呼気中に鼻から一部を排出する可能性があるため、接種全体をナレスに注入することはできません。しかし、排出量はマイナスになる傾向があり、接種量は非常に多くの細菌を含むため、これはコロニー形成細菌負荷に大きな影響を与えません。さらに、鼻咽頭粘膜のコロニー形成に利用可能な表面積は限られており、その結果、我々および他の人々は、推奨される¹⁰⁷ 用量が全てのマウスにおいて一貫したレベルの細菌を得るのに十分であることを発見し、その結果、コロニー形成細菌^14,15 の初期量の変動が最小限となる。
3. エンドポイントモニタリングの一環として体重インジケーターを使用する場合は、マウスの重量を量ります。無気力、フリルファー、体重減少などの臨床症状について、12〜24時間ごとにマウスを監視します。マウスは通常、植民地化後3〜5日まで病気の症状を示さないが、これらは1日平均体重の約5%の体重の体重減少が先行する。マウスがますます病気になるにつれて、彼らはハンチング姿勢を想定し、活動の減少と刺激に対する応答性の低下を示します。この段階では、病気は通常敗血症および/または肺炎を示し、終末期である可能性が高いが、マウスは結果を改善するために毎日1mlの皮下生理食音で治療される可能性がある。生き残ったマウスは、体重の安定化と体重増加の後に証明されるように、7日後に改善を示し始めるべきであるが 、S.肺炎 の異なる株はより迅速に病気を誘発し、異なる時系列に沿って臨床症状の進行をもたらす可能性がある。P1547株でコロニー形成されたマウスで追跡された体重の代表的な結果については 、図5 を参照してください。

3. 鼻洗浄サンプルコレクション

開始する前に:26 3/8 Gベベリング針でキャップされた1 mlの注射器を使用してカニューレ針を準備します。内径0.38mmのPE20ポリエチレンチューブ2.5cmをカットし、各端部にベベリングチップがあることを確認します。鉗子を使用して、長さ2.5cmのPE20ポリエチレンチューブ(内径0.38mm)を針先にスライドさせ、チューブ側の穿刺を避けます。カニューレツ針は必要になるまで70%エタノールに保つことができます。

1. 実験マウスを安楽死させる。頸部脱臼は気管を損傷する可能性がありますので、安楽死のこの方法は避けなければなりません。私たちの好ましい方法は、イソフルラン麻酔に続いて排泄ですが、安楽死モードを選択する際に制度ガイドラインに従うことを確認してください。
2. 70%水エタノールを使用して、動物、特に首のスーパーアンテリオールファーを殺菌し、エタノールがナレスにアクセスするのを防ぐように注意する。
3. 動物の首の正中線に沿って単一の縦方向のカットを行い、両端に2つの水平カットを行い、気管を想像する開口部を作成します。
4. 慎重に両側に皮膚を剥がし、下の首の組織を明らかにする。
5. 気管は、両側の縦方向の筋肉に囲まれて、目に見えるはずです。慎重に気管自体の明確なビューを提供するためにこれらを切り取ります, 周囲の血管系を切断しないように注意してください.
6. 血管系を切断し、血液が存在する場合は、進行する前に、出血を停止させ、滅菌PBSを分配し、滅菌ガーゼを使用して領域内の余分な水分を穏やかに浸漬することによって、領域を数回浄化します。
7. 気管が正しく露出したら、気管の横方向の半月切りを半方向に切り取ります(図6)。
8. 以前に調製したカニューレート針に1,000 μlの滅菌PBSを引き出します。
9. 鼻に向かって気管にカニューレを挿入し、ベバの端を下向きにして挿入を容易にします(図7)。針を所定の位置に置いたら、180°回転させ、耐光性が感じるまで優しく上向きにプローブします。
10. サンプルコレクション用に指定されたエペンドルフをマウスの鼻のすぐ下に置きます。
11. PBS洗浄液の最小(〜20 μl)量を分配することによって針の正しい配置をテストする - 流体の滴は、マウスのナレスの周りに形成する必要があります。この場合は、ステップ 3.13 に進みます。
12. テストPBSが動物の口から直接出てきた場合は、カニューレを後ろに引き戻し、非常にわずかな抵抗が感じられるまで再び穏やかに前方に探査することによって再配置する - 鼻口蓋を越えて口腔に移動するので、この抵抗を超えてカニューレを押し過ぎないように注意してください。
13. 細胞の最大量を置き換え、収集するのを助けるために針の内容を迅速に分配する - 内容物は、マウスのナレスを介して、コレクションチューブに流れ出る必要があります。すぐに氷の上にサンプルを置きます。
14. RNA分析用のサンプルを収集するには、同じマウス上のRNAリシスバッファーの500 μlを含むカニューレート針を使用して、ステップ3.8~3.13)を繰り返します。これは、初期のPBS洗浄に続いて非接着細胞を除去するはずであったため、主に鼻咽頭粘膜上皮で構成される残りの細胞集団からの溶菌サンプルの収集を可能にする。RNAのリシスバッファーは上皮を脱皮し、周囲の組織を破壊することに注意してください、 これらの組織の保持が望まれる場合は、肺などの器官との接触を避けるために注意する必要があります。採取したら、RNAのリシスバッファーに直接ドライアイスの上にサンプルを置き、凍結をスナップします。一度のリシスバッファーに、サンプルは、メーカーの指示に従って保存することができ、そして、典型的には数ヶ月間-70°Cで安定しています。

4. 鼻咽頭における細菌負荷の測定

1. 各マウス鼻溶岩サンプル用のシリアル希釈シリーズを調製して細菌を定量化します。一般に、細菌負荷は0-10⁴ CFUの間であると予想され、したがって3つの10倍の連続希釈を行う。1番目のチューブに10μlの清い鼻洗浄サンプル(100 CFU/ml)を加える。
2. 細菌学プレートを象限に分割し、希釈系列(10⁰-10^-3 CFU/ml)のメンバーを持つ各領域をラベル付けします。 図2のように、3つの希釈液の10μlサンプルと、5%の羊の血液を補ったトリプティック大豆寒天プレートのきちんとしたサンプルを3滴プレートアウト。
3. 15〜30分間乾燥させ、プレートを覆い、細菌増殖に最適な条件(通常37°Cおよび_5%CO2)の細菌インキュベーターに逆さまに置きます。
4. 18-24時間プレート上の細菌コロニーを育てる。
5. 各希釈についてプレート上に形成されたコロニーを平均化してコロニー形成細菌の数を決定する(図3)。図8は、異なるタイムポイントの間の細菌密度を示し、鼻洗浄物の培養によって決定されるように、最大21日間のS.肺炎の3つの異なる株で植民地化されたマウスにおいて。

5. フローサイトメータのサンプルの調製

開始する前に: 抗体の混合を準備します。白血球の個体数の定量化については、指定された希釈液で以下の混合を推奨します: PE-Ly6G (クローン1A8、 1 μg/ml)、FITC-Ly6C(クローンAL-21,1 μg/ml)、eFluor 450-CD45(クローン30-F11、2.67 μg/ml)、APC-F4/80(クローンPM8 RUO、0.67 μg/ml)、PerCP-Cy5.5-CD11c(クローンN418、RUO 0.5 μg/ml)、PE-Cy7-CD11b(クローンM1/70、0.33 μg/ml)、アレクサフルオール700-CD3(クローン1782、4 μg/ml)、eFluor 605NC-CD4(クローンGK1.5、6.67 μg/ml)。このミックスは2倍の濃度であることに注意してください(ステップ5.5を参照)。すべての抗体は、FACsウォッシュバッファー(0.5%胎児の子牛血清、2mM EDTA、PBS中の0.1%ナトリウムアジド)で希釈する必要があります。アイソタイプ一致対照抗体の混合物において、理想的には標識抗体と同じサプライヤーから、および特異的抗体と同じ濃度で、調製されるべきである。アイソタイプ対照抗体で処理されたサンプルは、陰性対照として機能する。アイソタイプ対照抗体で処理されたサンプルで観察される蛍光は、背景と考えるべきである。

1. プレチルは、1.5mlのエペンドルフ管を4°Cに紡糸することができる遠心分離機である。
2. 遠心分離器の鼻洗浄サンプルを2,000 x gで4°Cで10分間用いた。 上清と予備を慎重にピペットアウト。注: 鼻咽頭内の細胞の量が少ないため、望ましくない赤血球汚染が存在しない限り、細胞ペレットは見えません。これが見られた場合、サンプルは破棄されるべきです。
3. Fcの50 μlでサンプルを再中断しますか?4 μg/mlの濃度でのFACsウォッシュバッファーにおけるRIIb/CD16-2(2.4G2)抗体(Fc受容体に結合し、非特異的抗体結合を減少させる)。
4. 氷上で30分間サンプルをインキュベートします。
5. 調製済みの2x濃縮蛍光抗体ミックスを50 μl加えて、サンプルにします。各実験グループの代表的なサンプルを、アイソタイプコントロールとして機能するように脇に置きます。このサンプルにアイソタイプ抗体ミックスを加えて、染色ミックスの代わりに使用します。
6. 氷上でサンプルを1時間インキュベートする。
7. 遠心分離機サンプルを2,000 x gで4°Cで10分間用いた。 上清を捨て、PBSの200 μlで再中断します。
8. ステップ 5.7 を繰り返します。
9. 2回目の洗浄後、4°Cで10分間2,000xgで再び遠心分離サンプルを採取した。
10. PBS(サンプルを直ちに実行している場合)または2%パラホルムアルデヒド(染色後1〜3日間サンプルを実行している場合)のいずれかで再中断します。
11. フローサイトメトリーを行う場合、サンプル当たりの最大事象量を収集するか、サンプル全体が吸引されるまで収集します。感染していない健康な若いマウスでは、これはわずか1,000-2,000のイベントになります。細菌コロニー形成イベント中に、この数は、動物の疾患の状態および年齢および遺伝的背景などの要因に依存して2〜5倍以上増加する可能性がある。 図9 は、450の前方散乱と300の側面散乱を使用して3レーザーベクトンディケンソンLSRIIフローサイトメーターから収集された代表的なフローサイトメトリーの結果を示していますが、サンプル採取前に使用する予定の特定のフローサイトメーターのパラメータを最適化することをお勧めします。注: サンプルに微量の血液汚染が含まれている場合、収集されたイベントの総数は予想よりも大幅に高くなり、サンプルは分析から割引する必要があります。

6. 鼻溶岩の定量PCR(qPCR)分析

1. ステップ3.14室温から細胞ライセートを解凍する。
2. 選択の好ましいRNA抽出で提供される推奨されるプロトコルに従ってください。
3. 指示に従ってRNA抽出手順を完了した後、分光光度計または電気泳動ベースの方法を用いてRNAの量を定量する(図10)。我々は、サンプルあたり975〜3,250 ngの総RNAを、260/280 nm比>1.7またはRNA完全性(RIN)の周り(8.1±0.13)で日常的に得ています。
4. 1,000 ng の RNA (最大 13 μl) を使用するメーカーのプロトコルに従って M-MULV 逆転写酵素を使用して cDNA を書き起こします。
5. 得られたcDNAサンプル8倍を希釈し、アリコートを4つの別々のチューブに均等にして-20または-80°Cで長期保存する。
6. qPCRによる遺伝子発現を測定するには、氷またはコールドブロック上のトリクリケートで25 μlサンプル反応を調製します:お好みのqPCRキットから2倍qPCRマスターミックスの12.5 μl、0.25 μlの参照色素、希釈cDNAの2 μl(ステップ7.5)、1 μlの前方および逆プライマー(400 nM最終)、9.25μlの水の自由な水中のμlを含む。このプロトコルは、以前に公開されたメソッド¹⁶を適応したものです。
7. 一般に、2段階のqPCR増幅(10分間95°C、それに続く最大40サイクルx[95°C x 15秒、60°C x 1分])が有効であることがわかります(図11a)。ただし、各プライマーペアは最適化する必要があります。非特異的増幅が発生しないように、解離(融解)曲線は増幅後に実行する必要があります。増幅(図11b)
8. 分析された各遺伝子の標準曲線と、分析された各96ウェルプレートの標準的な校正器(肺または脾臓ホモゲンに由来する)を日常的に実行しています。相対転写量は、まず基準色素によって生周期閾値(Ct)値を正規化し、それぞれの標準曲線を通して結果の値を変換することによって得られる。これらの相対量は、その後、標準キャリブレーターおよびハウスキーピング遺伝子に対して、該当する場合に正規化される。

結果

図 1 は、プロトコルの主要な手順を要約した概略図を示しています。 図2〜3は 、本明細書に記載されたプロトコルに固有の微生物学的方法論の可視化を提供する。 図4 は、鼻腔内コロニー形成を行うマウスの適切な位置を示し、図 5 は典型的に S.肺炎株 P1547でコロニー形成されたマウスの体重の変化を示している。 図6〜7は 、プロセスの鼻洗浄部の特定段階を表し、これら2つの技術の補助可視化を図示する。 図8-11 は、鼻洗浄後のマウスの鼻咽頭から採取したサンプルに対して行われた分析の代表的な結果で構成されています。具体的には、 図8 は、鼻咽頭における細菌負荷の代表的な結果であり 、S.肺炎株 P1121、P1547またはP1542のいずれかで植民地化されたマウスから得られた鼻洗浄液の培養を通じて決定される。 図9 は、フローサイトメ...

ディスカッション

本研究では、 肺炎球菌 の臨床単離株を用いたマウスの鼻腔内浸着の詳細な方法と、その後の細菌に応答して鼻咽頭に採用された免疫細胞の単離および特徴付けについて明記した。我々は、細菌接種物を栄養豊富な培地で培養し、マウスの植民地化イベントを確立するために使用する方法を実証した。次に、鼻咽頭に採用された免疫細胞型の応答が、口蓋暴露、切開および鼻洗浄に続いて、カニュード針を使用してどのように分離できるかを示した。鼻洗浄サンプルは、PBSで回収して、無傷で軽く接着された細胞を分離することができます。RNAは、より強固に接着性の細胞および周囲の上皮粘膜層からのRNAを、RNAライシスバッファーからなる二次洗浄を施すことによって単離することができる。これらのサンプルの前者は、フローサイトメトリー技術を介してコロニー形成の文脈で採用された特定の細胞を表現するために使用することができ、後者はQ-PCR分析に適用することができ、対象となる免疫調節因子の転写発現を見てこれらの求動細胞のエフェクター機能を決定する。鼻溶岩サンプルは、特定の研究問題に対処するために、異なる実験群を比較する細菌コロニー形成イベントのクリアランスの運動を決定するために...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗マウス Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
抗マウス Ly6G PE	BD Pharmingen
反マウス CD45.1 eFluor 450	eBioscience	48-0453-82
抗マウス F4/80 抗原 APC	eBioscience	17-4801-82
抗マウス CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
抗マウスCD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
抗マウスCD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
抗マウスCD4 eFluor 605NC	eBioscience	93-0041-42
Intramedic ポリエチレンチューブ - PE20	Becton Dickinson	427406
BD 1 ml シリンジ	Becton Dickinson	309659
BD 26G 3/8 皮内ベベル	ベクトン ディキンソン	305110
バッファー RLT 溶解バッファー	Qiagen	79216
Difco トリプシン大豆寒天	ベクトン ディキンソン	236950
除細動羊血液	PML 微生物	A0404
RNAqueous-Micro キット	アンビオン	AM1931
M-MuLV 逆転写酵素	ニューイングランドバイオラボ	M0253L
GoTaq qPCRマスターミックス	プロメガ	A6001