ヒト腸管上皮細胞およびBALB / cマウスのマクロファージを用いた耐容脂肪酸とコレラ毒素の濃度の測定

サマリー

我々は大幅な悪影響脂肪酸と毒素を可溶化し、細胞生存率アッセイでそれらを使用することによって、細胞の生存に影響を及ぼさなかった3脂肪酸（オレインリノール酸およびリノレン酸）とコレラ毒素の許容濃度を決定するために設定してください。

要約

非ヒトとヒトの疾患の予防や緩和に脂肪酸の積極的な役割があっと広範囲に文書化され続けてきた。これらの役割は、炎症の予防だけでなく、感染症に対する粘膜免疫を含む感染と非感染性疾患への影響が含まれています。コレラは細菌コレラ菌によって引き起こされる急性の腸の病気です。それは発展途上国で発生し、放置すれば、死に至ることができます。コレラのためのワクチンは存在するが、それらは必ずしも有効と他の予防方法が必要とされているではありません。我々はそれぞれ、マウスBALB / Cマクロファージおよびヒト腸上皮細胞を使用して、3つの脂肪酸（オレインリノール酸およびリノレン酸）とコレラ毒素の許容濃度を決定するために設定してください。我々は、濃度範囲であると無脂肪酸の特定の濃度を決定するために、上記の脂肪酸および使用される細胞増殖アッセイを可溶化ヒト腸管上皮細胞の生存率に有害トン。我々は、コレラ毒素を可溶化し、統計的にBALB / Cマクロファージにおける細胞生存率を低下させない濃度範囲およびコレラ毒素の特定の濃度を決定するためのアッセイでそれを使用した。

我々は1-5 ngの/μlの間になるように最適な脂肪酸濃度を発見し、そして、それは、コレラ毒素の治療あたり<30 ngのように。このデータは、予防またはコレラ感染の緩和中の脂肪酸の保護粘膜の役割を見つけることを目指して今後の研究を支援することがあります。

概要

オレイン酸、リノール酸やリノレン酸などの脂肪酸の健康上の利点は、き、文書化され続けてきた。例えば、オレイン酸は、ボディ^1,2における親油性薬物の浸透を促進するのに役立ち飽和脂肪酸³に代入するとき24％冠状動脈性心臓病を低減し、X-連結されるよう副腎⁴などの代謝性疾患を治療するために使用される脂肪酸代謝の遺伝性疾患。 。哺乳類におけるアラキドン酸、リノール酸（オレイン酸とは異なります）のために必要な前駆体は、体内で合成されず、そのような亜麻の種子の消費などによって外部ソースを介して取得する必要がありますが^5つの研究は、次のようなリノール酸のいくつかの有益な健康への影響を示しています。肌のためのアンチエイジングの特性^、6抗炎症作用、大腸と前立腺癌細胞の増殖が減少^7、8、肥満と戦うための能力と昇進Ofの心臓血管の健康^。9 ​​リノレン酸が歯周炎症^、10および変調トロンボキサンとプロスタサイクリン合成を減少させる役割を果たしています¹¹

Arpita ¹² V.に胆汁脂肪酸とコレステロールの影響を検討病原因子と運動性のコレラ菌の表現。山崎^13は、赤唐辛子、およびその他の天然抽出物、メタノール抽出物から、潜在的にコレラ毒素産生を減少させることができることが示された。これは、粘膜免疫を提供する介して、例えばコレラなどの感染症の予防及び緩和上記脂肪酸（例えば、亜麻種子など）に富んだ食品の使用を検討することも考えられる。我々は、細胞増殖アッセイ、ヒト腸管上皮細胞は、セリウムに有害な影響を与えることなく許容できる脂肪酸の​​最大濃度を用いて、脂肪酸を可溶化し、決定するために検討を重ねLL生存能力。我々は、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸は、低濃度で細胞生存度に有益な効果を提供すると仮定したが、より高い濃度では、それらは細胞に対して毒性であること。我々はまた、コレラ毒素を可溶化し、BALB / Cマウスのマクロファージ細胞生存率の有意な減少なしに耐えることができるコレラ毒素の最大濃度を決定した。私たちも、非常に低レベルでの細胞生存率にコレラ毒素の毒性効果を仮定する。コレラ毒素を可溶化し、細胞の生存性を大幅に低下させることなく耐えることができる毒素の最大量を決定するためにそれを使用する方法は、将来の研究のための利点を提供する。例えば、上記の方法の組み合わせが脂肪酸がコレラ感染に対する粘膜免疫細胞を提供するかどうかを決定するために使用することができる。我々の知る限り、これは合理的手法が検討されていない。

私たちは、ジ我々の予備的データはオレインかどうかを判断するために後で調査で使用することができますscuss方法、リノール酸とリノレン酸がコレラ感染に対する粘膜免疫で細胞を提供する。

プロトコル

1。組織培養

1. コレラ毒素の測定にハツカネズミマクロファージ （BALB / cマウス）を使用します。当初は文化M.のすべてベンダーの指示に従って筋細胞 。
2. 10％ウシ胎児血清で完了L-グルタミンを有するダルベッコ変法イーグル培地中でBALB / cマウス細胞を伝播して、1％の抗生物質/抗真菌剤またはRPMI 1640ベース媒体は、10％ウシ胎児血清、5％L-グルタミン、および1で完了し％抗生物質/抗真菌剤試薬。
3. 37℃でベントキャップ付き75cm ^2のコーニングフラスコ中の細胞を増殖°C、95％空気および5％CO _2。
4. 脂肪酸の決定の決定のため、メーカーの指示に従って配信の24時間以内にヒト腸上皮細胞を持ち出す。
5. 37℃、10％FBSおよび30 ngの/ mlのヒトEGFで完了HybriCareメディアベントキャップ付75cm ^2のコーニングフラスコ、℃で人間の腸管上皮細胞を伝播抗生物質を使用しないでくださいメーカーの指示に従って、/抗真菌薬。
6. 密集度約70％で、すべてのセル（1:3）を分割します。
7. フリーズと標準凍結プロトコルを使用して研究を通して、すべてのセルを持ち出す。
8. 注：脂肪酸のより大規模な濃度決定のために、最初は速く成長し、保守が容易にマウスマクロファージを使用しています。細かいスケール脂肪酸濃度の決定のために、ヒト上皮細胞を使用しています。すべてのコレラ毒素治療（説明を参照してください）​​、マウスマクロファージを使用してください。

2。脂肪酸とコレラ毒素トリートメント

1. オレイン酸は、同社が提供するガラスアンプルから滅菌ガラスバイアルにリノール酸とリノレン酸を転送します。
2. 個別滅菌エッペンドルフチュー​​ブに各脂肪酸を転送し、1:6希釈で100％エタノールで最初にそれを溶解した後、10μgの/μlの最終濃度のためにRPMI 1640不完全なメディアである。
3. ボルテックス各ソリューションとTRANSFえーそれは冷凍庫内のストレージ用ガラスバイアル（-20°C）へ。
4. 96ウェル組織培養プレートでよく2,500細胞/皿で細胞。
5. MTTアッセイの準備のために脂肪酸と細胞の治療のために200μlに合計うまくボリュームを持って適切な完全なメディアを追加します。
6. 24時間増殖期間の後、メディアを取り出し、新鮮な培地と交換してください。
7. （結果を参照）ウェルにテストする各脂肪酸の適切な濃度を追加します。 200μlに合計うまくボリュームを持って完全なメディアを追加します。
8. MTTアッセイを開始する前に24時間処理プレートをインキュベートする。
9. クライオバイアルに1 mg / mlのアリコートと溶液の濃度でPBSでコレラ毒素を溶解し、2-8でクライオバイアルを保管℃に
10. 細胞治療のため、1 ngの/μLの最終作業濃度のどちら滅菌PBS（pH7.4）に、または不完全なDMEM中で毒素1:100に希釈する。
11. におけるコレラ毒素を持つ細胞を治療する上述したようにMTTアッセイプレート電池用製剤。
12. 24時間増殖期間の後、脂肪酸アプリケーション（上）で使用される手順に従って、ウェルにテストする（我々の濃度について、結果を参照）コレラ毒素の適切な濃度を追加します。
13. MTTアッセイを開始する前に24時間処理プレートをインキュベートする。
14. それぞれの脂肪酸及びコレラ毒素治療の両方のための正（紙全体に正c）および陰性対照（負c）は、完全培地および70％エタノールでインキュベートした細胞、など。
15. すべてのサンプルとトリートメントにはポジティブコントロールのためのより多くの複製（本研究ではn = 6）で、3反復（n = 3）での最小値を使用しています。

3。 MTTアッセイ

1. 2.5 mg / mlの濃度にMTT原液を作る。
2. テストする、96ウェルプレートの各ウェル中の溶液を取り除き、新鮮な完全なメディア溶液200μlと交換してください。
3. 広告各ウェルにMTT溶液を10μlのD。
4. 37℃で3-4時間、プレートをインキュベートする。
5. メディアソリューションを捨て、各ウェルにイソプロパノールで0.04 M HClを100μlのを追加します。
6. 5分間室温でプレートをインキュベートする。
7. 各ウェルから新しい遠心管にソリューションを移す。
8. 1分間、またはペレットが形成されるまで、室温で、20,000×gで遠心分離します。
9. 各サンプルの20〜40μlの間にマイクロプレートリーダーへの転送。
10. 分光光度計を用いて570nmで吸光度を読み取る。

結果

脂肪酸の最適濃度の決定

脂肪酸の最適な濃度は、細胞増殖に匹敵するか、または結果のばらつきが比較的低いと、コントロール細胞とを超えた最大濃度として定義される。オレイン酸の最適濃度を決定するために、リノール酸およびリノレン酸の細胞は、最初は少しずつで大きな増分以降では、各脂肪酸の濃度を変化させることで処理した。 図1は、使用する処置のための陽性対照の関数として示されている細胞の生存を示してい脂肪酸の濃度を増加させる。それは、細胞が脂肪酸のいずれかの上記100ngの/μlの濃度を許容しないことが明らかである。一つの方法は、ANOVAは、治療の各々について、手段の一つ又はそれ以上が他た（p <0.001）とは異なることを示した。事後検定（Tukeyのは）を示したことを除いて、オレイン酸のすべての治療をするため1 ngの/μL、ポジティブコントロールとは異なっていた。興味深いことに、高い変動に起因し、この治療法のいずれかわずかにネガティブコントロールと有意差はなかった。リノール酸およびリノレン酸の両方について、一方向ANOVAは、少なくとも1...

ディスカッション

脂肪酸とコレラ毒素の濃度の提案

脂肪酸は粘膜免疫を高める方法の正確なメカニズムは不明であるが、いくつかの研究は、それらの有益な効果を調べることを試みた。我々の研究は、細胞が細胞は細胞の生存に重要な影響を及ぼすことなく耐えることができるだけでなく、コレラ毒素の最大濃度に耐えることができる脂肪酸の​​最大濃度を決定する方法を提供することを目的とする。

だけでなく、我々は異なるに脂肪酸とコレラ毒素と処理組織培養細胞を可溶化し、細胞の生存率に非常に重大な悪影響を及ぼすことなく、細胞の治療のためのコレラ毒素のものと3脂肪酸（オレインリノール酸およびリノレン酸）の濃度を決定するために、濃度は、生存率を評価するMTTアッセイを行った。我々の手法とその結果に基づいて、我々は脂肪酸およびコレラ毒素有用な範囲を提供する（下記参照）は、これらの脂肪酸またはコレラ毒素を使用することを目指して将来の調査のために。我々は、ヒトの腸上皮細胞を使用するため、それぞれ、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸に対して1 384-768、および384-768（ng /μ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Cells/Reagent
Mus musculus マクロファージ	ATCC	ATCC RAW 264.7
ダルベッコ改変鷲の培地	ATCC	30-2002
L-グルタミン	ATCC	30-2115
ウシ胎児血清	Bio-west	S0250
抗生物質/抗真菌性	Hyclone	SV3007901
ヒト腸上皮細胞	ATCC	ATTC CCL-241
HybriCare 培地	ATCC	46-X
オレイン酸	Sigma-Aldrich	O1008
リノール酸	Sigma-Aldrich	L-1376
リノレン酸	Sigma-Aldrich	L-2376
コレラ毒素	Sigma-Aldrich	C8052
Equipment
>BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates	BD Biosciences	351172
Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software	Dynex	91000101