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方法論記事

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DOI:

10.3791/50522

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2013年7月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery and Traumatology, Ghent University Hospital, 2Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent University, 3Department of Virology, Parasitology, and Immunology, Ghent University, 4Pathlicon

この記事について

サマリー

ザ卵で絨毛尿膜（CAM）は、新たな肉腫由来の腫瘍組織、それらの単一細胞懸濁液、および恒久および一時蛍光標識された確立された肉腫細胞株でグラフトされている。モデルは、移植片（生存能力、Ki67の増殖指数、壊死、浸潤）とホスト（線維芽細胞の浸潤、血管内殖）挙動を研究するために使用されます。

要約

肉腫は、すべての新しい治療法の開発を妨げ、自然の中で異質である非常にまれな疾患である。肉腫患者がこの病気のために再現性と低コストの異種移植モデルの開発で現在の関心を説明、成層後のオーダーメイド医療のための理想的な候補です。ニワトリ漿尿膜は、種特異的な制限なしにグラフトされた組織や細胞を維持することのできる自然な免疫不全宿主である。また、容易にアクセス、操作及び光と蛍光実体顕微鏡を用いて撮像される。組織学はさらに異型細胞間相互作用の詳細な分析を可能にします。

このプロトコルは、新鮮な肉腫由来の腫瘍組織、それらの単一細胞懸濁液と、恒久的かつ一時的な蛍光標識確立肉腫細胞株（SAOS-2、SW1353）と絨毛尿膜のグラフト卵で詳細に説明しています。ひよこ生存ラットESは75％アップしている。モデルは、移植片（生存能力、Ki67の増殖指数、壊死、浸潤）とホスト（線維芽細胞の浸潤、血管内殖）挙動を研究するために使用されます。単一細胞懸濁液の移植ローカライズについては、ECMゲルは不活性封じ込め材に比べて大きな利点を提供します。 Ki67の増殖指数は、CAMの表面からの細胞の距離とCAM、治療製品の添加の時間枠を決定し、後者上のアプリケーションの継続期間に関連する。

概要

肉腫は、治療抵抗1,2による高い死亡率と結合組織のまれな腫瘍である。患者の生存率の進歩は、その低い年間発生率、彼らの幅広い多様性、および肉腫細胞をin vitroで 3,4 での培養には難しいことがあると報告されているという事実によって妨げられている。

前臨床治療の評価のための培養細胞の使用は、 インビトロで新しい、明らかに活性な分子が常に臨床に結果を反映していないことを明らかにした。さらに、遺伝子発現アレイによって明らかにされたゲノム収差は常に5-7個々の患者の腫瘍の行動特性に相関はありません。これらの問題を試してみて、解決するために、パーソナライズされた薬は異種移植モデル8-12のために増加し、検索に反映されている重要で得ています。

インビボアッセイにおけるcの間の複雑な相互作用を反映するという利点を有する癌の増殖と浸潤13のために必要なアンサー細胞および固形腫瘍における宿主組織環境。現在、我々は肉腫14,15のため再現性の異種移植モデルとしてChorioの-尿膜アッセイ（CAMアッセイ）の使用を検討する。このアッセイは、広く腫瘍の血管新生16,17の研究のために使用される。他の研究では、異なるプロトコル18,19に従って成長や血管新生の著しい違いを観察しながら、文献で ​​は、しかし、我々は、このアッセイのために、異なるプロトコルを発見した。

本稿では、腫瘍移植片、腫瘍由来の単一細胞懸濁液と確立された肉腫細胞培養物を用いた細胞の挙動にCAMアッセイの条件を変化させる効果を調べる。

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プロトコル

概要については、図1を参照してください

腫瘍材料

1。腫瘍サンプルの取得と準備

患者材料の使用については、倫理委員会の承認が必要であり、インフォームドコンセントは、患者から得られなければならない。

  1. 介入時の収穫代表材（最小1センチメートル3）、生検または肉腫の切除のどちらか。生検の適切な部位は、ダイナミックコントラストMRIを使用して定義されます。
  2. 1,000 Uペニシリン及び1 mg / mlのストレプトマイシンを補充したDMEMを含む滅菌バイアルにすぐに材料を置きます。
  3. ラボに - 直ちにバイアルを輸送（90分30）。

すべての次の手順は、層流の下で実行されます。

  1. 無菌のペトリ皿にバイアルの内容物を注ぐ。
  2. 最大1メートルの小さな部分に腫瘍サンプルを入れて滅菌メスを用いてm 3である。彼らは組織の更なる処理を損なう傾向があるように、すべての石灰化部分を削除。
  3. ランダムCAM上のアプリケーションのための10の腫瘍移植片を取る。

2。腫瘍由来の単一細胞懸濁液の調製

おおよその時間：3時間

  1. サンプルの残りの組織を量る。
  2. 入り、2 - 解離チューブ内の組織を4g、複数のチューブが残りのすべての腫瘍組織を消化するために必要とされてもよい。
  3. 2の消化のために - 組織の4グラム、2.5ミリリットルコラゲナーゼ2溶液（500 U / mlのRPMI 1640）と2.5ミリリットルのDNase溶液（22 KU / mlのRPMI 1640）を追加します。
  4. 解離h_tumorプロトコルに従って組織を処理します。管を30分間穏やかに振盪しながら37℃でCO 2インキュベーター内℃でのインキュベーションの2サイクルを含む。
  5. 150μmのセルストレーナーを通して、残りの懸濁物をろ過する。
  6. 5マイル、1,000 rpmでライセートを遠心N。
  7. 上清を取り除きます。
  8. 正規懸濁液とのインキュベーションの10分を可能にする、赤血球溶解バッファー（ELB）10mlにペレットを再懸濁する。

注：赤血球溶解緩衝液は、以下のように製造される：0.037グラムのEDTA、0.99グラムK 2 HPO 4、千ミリリットル水に8.29グラムの NH 4 Clをを追加し、0.22μmの減圧フィルタ、7.3にpHを調整するために10 N水酸化ナトリウムを使用フィルタ。 4℃で保存

  1. 反応を停止さ培地（DMEM、10％ウシ胎児血清、100 U / mlのペニシリン、および100μg/ml/ mlのストレプトマイシンを補充した）25 mlを加える。
  2. 5分間1,000 rpmでサスペンションを遠心分離。ペレットの色は今白でなければなりません。
  3. 上清を取り除きます。
  4. ペレットに培地5mlを追加します。 70μmのセルストレーナーを通してサスペンションをフィルタリング。
  5. 自動セルカウンターを用いて生細胞/ mlの数を数える。

3。 C言語アンサー細胞株

SAOS2骨肉腫細胞（​​ATCC番号：HTB-85）強化緑色蛍光タンパク質を発現し、製造業者のプロトコルに従って細胞株ヌクレオキットVを用いたpEGFP-C1ベクターによってエレクトロポレーションした。安定な細胞株を確立するために、トランスフェクトされた細胞は、以前に確立プロトコル20に沿って、4週間のG418（1 mg / ml）で選択した。加えて、ソートは、製造業者の指示に従って、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって行った。

SW1353軟骨肉腫細胞株（ATCC番号：HTB-94）からの細胞または作りたて腫瘍単一細胞懸濁液は、赤色蛍光親油性膜染色を用いて標識されています。

  1. 溶液;トリプシン（0.5％重量/体積）エチレンジアミン四酢酸（0.2％重量/容量EDTA）を使用して古典的な方法で培養フラスコから細胞を取り出します。
  2. 1,000 rpmで5分間、細胞懸濁液を遠心分離する。
  3. supernを削除atant。
  4. 無血清培地1mlと5μlのDiIを（Vybrant赤）/ 10 6個の細胞を追加します。
  5. アルミホイルでバイアルを包み、37℃で10分のためにCO 2インキュベーターに入れて
  6. 1,000 rpmで5分間、再び遠心し、上清を除去します。

漿尿膜アッセイ

1。卵のインキュベーション

  1. 卵の95％の受精を保証する地元商業孵化場から受精卵が必要となります。
  2. 受精卵は10日まで室温で、最大保存することができます。

注：インキュベーションを開始する前に、汚れ、羽や排泄物を慎重にむしろ柔らかい表面構造よりもラフを持って紙タオルと乾拭きで機械的に卵の殻から削除されます。 70％変性エタノールまたは他の洗浄試薬で卵をふくと、大幅にニワトリ胚の生存率を低減します。

  1. incubに卵を入れて片側にator、上面のマーキング。卵はインキュベーターに入れられた日は、胚発生の0日に指定されます。
  2. 37.8℃のインキュベーション温度、および47％と湿度を設定する。自動回転オプションがオフになっていることを確認してください。

2。卵のオープニング

長さ：25卵は±60分

開発3日目、卵は層流の下で開かれます。膜は殻に固執する傾向があるように、CAMへのダメージがさらに発達段階の結果で卵を開く。赤外線ランプは、手順の間に卵を暖かく保つために使用されます。無菌性を改善するために、我々は手の手袋の使用をお勧めします。

  1. 上向きに顕著な側面と、ゆで卵を置きます。
  2. 卵の先端に挿入された18 G針を卵白の2ミリリットルを除去することにより、CAMのレベルを下げます。針は、複数の穿孔後鈍である場合卵の殻には、針を交換してください。そうでない場合は、あまりにも力が卵黄またはシェルの破壊への損傷、その結果、発揮されなければならない。時には、針はchalazae、卵白に卵黄を中断2スパイラルバンドの一つによってブロックされています。これは、ブロックが解決されるまで穏やかに戻ってプランジャを押し下げることによって解決することができる。卵黄をシリンジ内に吸引されている場合は、注射針と同様に注射器を交換してください。時には、胚は、このイベントの後に死ぬ。卵白の不十分な量が除去されると、シェルが除去されると、CAMが破損します。
  3. ウィンドウを削減しながらCAM上にシェル粒子がこぼれるのを防ぐためにシェルのマークされた上側の半透性接着フィルムを適用する。
  4. 卵の表面に小さな千枚通しと導入孔を作る。
  5. 無菌先鋭外科はさみのペアを使用して、シェルが1cm 2の窓をカットします。
  6. 胚の脈動心臓や隣接血管が目で観察することができます卵黄の電子表面。非受精卵または死んだ胚を削除します。血管の中断された態様は、死んだ胚を特徴付ける。
  7. 半透性接着フィルムでウィンドウを封印。シェルは、針の挿入中に割れていない場合、それは、穿刺部位をカバーする必要はない。

3。接種手順

時間：細胞株当たり±1時間

ニワトリ胚発生の9日目、卵は層流の下に接種する。

CAMに広がる癌細胞の評価は、接種時に限られた表面への細胞の封じ込めを必要とします。マトリゲルは、しばしば実験的な細胞培養条件下で使用されるEngelbreth-ホルム - 群れマウス肉腫から細胞外マトリックス（ECM）ゲルである。それが冷却する流体であるが、20に運ばとき熱的に活性化して重合を受ける - 40°C、従って安定なゲルを形成する。間に実験は、マトリゲルは、氷の融解を含むボックスに保持される。

注：私たちは、穴あきカバーガラスを使用しないよう主張している。我々は、膜自体の細胞のプラスチックディスクこうしてバイアス成長性にグラフト癌細胞の付着と成長を観察した。

  1. 10 6 cells/100μlのECMゲルの濃度で冷却ECMゲルで細胞ペレットを再懸濁します。溶ける氷の上でこのソリューションを保つ。
  2. 層流の下で無菌手術一対の半透膜の切除部分。接着フィルムが完全に除去されている場合、これは汚染による胚の死の割合が大きいことになる。
  3. 上皮細胞層を除去するために、滅菌したガラス棒で軽くシェルウィンドウ下CAM右をタッチします。滅菌したガラス棒でCAMに触れると、より扱いやすさと経験を必要とするメスN°11を使用して、より少ない外傷であることが分かる。小さな出血が発生することがあります。
  4. A腫瘍物質dding。
  5. 腫瘍移植の場合：滅菌ピンセットのペアでCAMへの組織の一つでそっと下片、それを圧迫せずに。
  6. ECMゲル手順について：ECMゲルは、アプリケーション間で重合することができ、互いの上に、CAMに細胞-ECMゲル懸濁液を4倍25μLを加える。このようにして癌細胞を含有する接着性プラークが作成される。
  7. 半透接着フィルムでもう一度シェルウィンドウをシールします。

4。 CAMのイメージングと収穫

長さ：25卵のために2時間

ニワトリ胚発生の16日目で、カムが収穫されます。層流の下で作業する必要はありません。

  1. 手術用はさみでウィンドウを拡大する。負傷した血管の出血で、その結果、そうでなければCAMが損傷されますが、低すぎると切らないようにしてください。
  2. 300を追加- PBS Dの500μlのCAMの宗派へのピペットで接種材料を含むイオンである。まだ蛍光プローブを使用しないときは、この膜が硬くなるように、緩衝ホルムアルデヒドは、膜の切断を容易に使用することができる。
  3. GFPまたはDSRフィルタ、フィルタなしの両方を使用してデジタルカラーカメラを搭載したステレオ蛍光顕微鏡を通して卵におけるCAMの写真を、作る。腫瘍移植の場合は、すべての写真はフィルターなしで作られています。 LED照明によって、上記からの照明が強く（ 図2）撮影時をお勧めします。
  4. 標識された細胞のレコード腫瘍細胞遊走。腫瘍の境界が不規則で擦り切れたかもしれません。散乱した細胞は、腫瘍の境界付近に存在してもよい。いくつかの標本では、腫瘍細胞の行（ 図3）を観察することができる。
  5. シェルに対して嘘国境で滅菌はさみのペアを持つ膜をカットします。
  6. PBS Dで埋めたりのためにバッファリング滅菌ペトリ皿で収穫されたCAMを置きmaldehyde。
  7. 上側とし、フィルタなしの両方のCAMの下側、両方の写真を作成します。
  8. 少なくとも72時間のためにバッファリングされたホルムアルデヒドとラベルされた容器内に膜を置く。
  9. パラフィンでカム埋め込み、組織学的検査のためにそれらを準備します。切断面は、カセットの底に平行であることを確認し、結節の中心に腫瘍移植片をカットするように注意してください。そうでない場合は、CAMと腫瘍移植片の間の相互作用は表示されません。同戦略は、ECMゲルプラークに適用されます。切刃との対向面にはプラークに垂直でなければなりません。

5。組織学的評価

必要に応じて、ヘマトキシリン​​ - エオシン染色およびKi-67免疫組織化学は、さらに明確化のために行った。免疫組織化学係る自動化されたスライド染色を用いて、厚さ3.5μmでホルマリン固定パラフィン包埋組織切片上で実施した製造元の指示である。のKi-67（クローンMIB-1、希釈1/100）にマウスモノクローナル一次抗体を用いた。熱誘導エピトープ検索は、Cellコンディショニング1を用いて行った、可視化は、製造業者の指示に従って、ユニバーサルDAB検出キットで達成された。組織切片のDehydratationは、自動化されたカバーガラスを用いて行った。

SAOS2とSW1353細胞株、Ki67の陽性数とKi67の陰性細胞nuclei/100μmの2は 3つのゾーンで計数した場合：1近いCAMの国境に、一面との中央に1を閉じるECMゲルプラーク。この手順は、それぞれのKi-67染色したスライドの6倍速繰り返した。増殖の指標をカウントした細胞の総数であるKi67陽性細胞の数を割っスライドごとに決定した。

壊死はファディ伴う細胞核内クロマチンの微細分散の損失によって定義され個別のセルの余白のNG。異種移植の場合、壊死が、完全な（しばしば表面で）部分的、または欠席として記録されています。 CAMへの腫瘍細胞の浸潤は、CAMの中胚葉内の腫瘍細胞の観察により定義され、有無であると採点される。

三項目は、ホストの動作のために採点されます。線維芽細胞の浸潤は、細長い細胞がCAMを残して、腫瘍移植片/プラークを侵略として定義され、有無であると採点される。血管の内部成長は核ニワトリ赤血球の存在によって特徴付けひよこ血管を、増殖の内部成長として観察することができます。

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結果

CAMの評価

腫瘍移植片はCAM（ 図2A）に付着なる。患者材料からの単一細胞懸濁液は、頻繁に干し、やや隆起したプラーク（ 図2D）が表示されます。 CAMの切除後、膜のしわ（2Eと2Fの図 ）が発生をマーク。

商業細胞株についてプラークは細胞増殖を示す時間より不透明になる。 ECMゲル中の異なる細胞株は、CAM上で異なる成長パターンを持っている。 GFPシグナルが強いままSAOS2は生存細胞を示す、接種後7日目から、表面の異なる増加とともに、拡散プラークを形成している。 SAOS2細胞の移動は、CAMの船舶への可視化と平行（ 図3）することができます。フィルタが使用されないときに実体顕微鏡で観察したときに、血管を見ることができる。ないときにfを腫瘍細胞は識別することができませんILTERが使用されます。 GFPフィルタが挿入されたときには、血管を可視化することがで...

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ディスカッション

接種と収穫時

接種の日はECMゲル（36カム）でSAOS2を使用して実行し、胚発生の5日目と10の間で変化させたタイミング。

インキュベーション9日の前に、CAMは一貫して私たちが適用されたECMゲルをサポートするのに十分な大きさではなかった。収穫では、腫瘍細胞は時々深いCAMから取得しなければならなかった、といくつかのECMゲルサンプルは、卵白やCAMで緩い横たわっていた。日と6日には、ひよこ奇形や死、その結果、ニワトリ胚で腫瘍細胞を入れて回避するために大変でした。 9日目から、CAMは完全にほとんどの卵の窓下に表面を覆っていた、とECMゲルプラークは収穫の瞬間にCAMに付着を証明した。したがって、我々は、胚発生の日9なるように接種するための理想的な時間を見つけました。

収穫の理想的な時間の決定のために、SAOS2とSW1353はrespectivel後に回収したyは1、2（SAOS2-GFPのみ）、4、5、6、7、8日間接種後、または胚発生の10日目と17の間である。これらの...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

SW1353軟骨肉腫細胞株由来の細胞を親切に教授PCW Hogendoornとライデン大学、オランダの教授J.Bovéeによって提供された。私たちは、プロトコルの概要の専門描画にJ. MestachとG. Wagemans優れた技術支援のために、そしてG.デBruyneに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Cell Line Nucleofector Kit VAmaxaVCA-1003
コラゲナーゼ 2 溶液 (500 U/ml RPMI 1640)Sigma AldrichC6885
DMEMInvitrogen41965-039
DMSOSigmaD8418
Dnase solutionSigma AldrichDN25
G418Invitrogen11811031
マトリゲルSigma-AldrichE1270
マウス一次モノクローナル抗体 Ki67デンマーク Dako デンマークMIB-1
パラホルムアルデヒドフルーカD76240
PBSInvitrogen20012019
PBSDInvitrogen14040083
peGFP-C1 ベクターClontech632470
ペニシリン/ストレプトマイシンInvitrogen 15140163
RPMI22409-015
トリプシン-EDTA溶液Invitrogen25300054
Vybrant cell-labeling DiILifetechnologies22885
Countess Automated Cell CounterInvitrogenC10227
デジタルカラーカメラライカDFC 340 FX
デジタル エッグ インキュベーターオート エレックス CoR-COM 50
FACSBD バイオサイエンスFACSAriaIII
Gentlemacs C-TubeMiltenyi Biotech130-093-237
Gentlemacs DissociatorMiltenyi Biotech130-093-235
Gentlemacs Dissociator ユーザーマニュアルh_tumorプロトコルMiltenyi Biotech
[header]
半透性接着剤フィルム(Suprasorb F)Lohmann&を含む。Rauscher20468
実体蛍光顕微鏡ライカM205 FA
Tissue-Tek フィルム自動カバースリッパーさくら6400
ultraView ユニバーサル DAB 検出キットベンタナ メディカル システムズ インク760-500
ベンタナ 自動スライド ステイナーベンタナ メディカル システムベンチマーク XT

参考文献

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