ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します

サマリー

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、GTPアーゼおよびキナーゼドメインの両方をコードし、細胞内でリン酸化されたマルチドメインタンパク質である。ここでは、それによってその全体的なセルラphophorylationレベルを測定する手段を提供する^、32 Pオルトリン酸を用いて細胞内LRRK1とLRRK2を標識するためのプロトコルを提示する。

要約

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、セリン - スレオニンキナーゼドメイン、複合タンパク質ドメインのラス（ROC）、ROCドメイン（COR）のC-末端を含め、同様のドメイン構成を共有パラログであるおよびロイシンリッチとN末端にアンキリン様​​リピート。 LRRK2は、パーキンソン病^3,4の病因に関与している間LRRK1およびLRRK2の正確な細胞の役割は、しかしLRRK1は^{、1,2シグナリング}チロシンキナーゼ受容体に関与しているまだ解明されてきた。本稿では、それによって細胞におけるこれら2タンパク質の全体的なリン酸化レベルを測定する手段を提供し^、32 Pオルトリンを持つ細胞にLRRK1とLRRK2タンパク質を標識するためのプロトコルを提示する。簡潔には、親和性はLRRKタ ​​ンパク質は³² P-オルトリン酸を含有する培地に曝露されたHEK293T細胞において発現されるタグ付き。 ³² P-オルトリンはわずか後の細胞に同化されているインキュベーション時間およびリン酸塩を含有する細胞内の全ての分子は、それによって放射性標識されている。親和性タグを介して（3XFLAG）LRRKタンパク質は免疫沈降により、他の細胞成分から単離される。免疫沈降物をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜および組み込まれたリン酸塩の分析にブロットは、ブロット上のタンパク質のオートラジオグラフィー^（32 P信号）およびウエスタン検出（タンパク質シグナル）によって行われる。プロトコルは、容易に細胞内で発現され、免疫沈降によって単離することができる任意の他のタンパク質のリン酸化を監視するように適合させることができる。

概要

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、同様のドメイン構成を共有するマルチドメインパラログである。両タンパク質は、効果的ROCOタンパク質ファミリー^5,6に両方のタンパク質を分類、分子量GTPase（複合体タンパク質のRasは、またはROC）のRasファミリーだけでなく、ROCドメイン（COR）のC末端に似アーゼ配列をコードする。 ROC-CORドメインタンデムのN末端 ​​のみLRRK2は、余分なアルマジロdomein ^6-8をコードしている間、両 ​​方のタンパク質は、ロイシンリッチリピートドメインだけでなく、アンキリン様ドメインをコードする。 ROC-CORのC末端のみLRRK2がC末端領域⁸のWD40ドメインをコードしながら、両方のタンパク質は、セリン-トレオニンキナーゼドメインを共有する。 LRRK1およびLRRK2の正確な細胞の役割は、しかしLRRK1 ^{1,2シグナリング}チロシンキナーゼ受容体に関係している、解明されていたが、パーキンソン病^の3,4の病因にLRRK2の役割への遺伝的証拠を指しています。

タンパク質のリン酸化は、細胞内での一般的な制御機構である。例えば、リン酸化は、酵素の活性化またはシグナル伝達複合体へのタンパク質の動員に必須であることができる。 LRRK2の細胞のリン酸化は広範に特徴付けされており、phos....

プロトコル

この議定書は、LRRK2の細胞のリン酸化に従うことを放射性³² P標識オルトリンを使用しています。これは、放射性の試薬ですべての操作は、オペレータおよび環境への放射性放射線の被ばくを最小限にするために、適切な保護措置を使用して実行する必要があることを念頭に置くことが重要です。電離放射線は、制度的、国家レベルで人の健康と厳格なライセンスおよび規制に害を及ぼす可能性が発する同位元素を含む化合物は、その使用を制御します。このプロトコルでの実験は、カトリック大学ルーベン（KUルーベン）でのオープンソースの放射線使用中の訓練に従い、大学の健康、安全、環境部門が提供する優れた実験室での実践ガイドラインに従って実施した。我々のプロトコルのいくつかのステップが広く、細胞培養、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティングとして展開され、ここで与えられている私たちの研究室で適用されるプロトコルの詳細です。それは、Shouldは、正確な実験条件は、実験室からの研究室ごとに異なる​​ことに注意されているため、放射性物質の適正な取扱いを確保するための具体的な対策は、それぞれの新しい実験室環境に適合させる必要があります。

オープンソースの放射線の使用は、従来、規制当局の承認の対象であり、実験室での研究におけるオープンソースの放射線を担当する規制機関は国によって異なります。ユーザーは、そのプロシージャがローカルルールや規制に準拠していることを確認するために、その制度上の放射線安全管理者....

結果

細胞においてLRRK1とLRRK2全体のリン酸化レベルを比較するために、3XFLAGはLRRK1タグとLRRK2をHEK293T細胞で発現させた^15。細胞を、6ウェルプレートで培養し^、32 Pで標識し、プロトコル·テキストで上記のように分析した。 図1は、HEK293T細胞におけるLRRK1およびLRRK2の代謝標識のための代表的な結果を示す。放射性リン酸取り込みはLRRK1およびLRRK2の両方で観察される。抗flag抗体を用いた免疫検出のデンシトメトリー分析によって測定された³² Pレベルの定量の際にタンパク質レベルに対して正規化し、それは統計的有意であるがLRRK1は、試験した条件下でLRRK2よりも低い平均リン酸化レベルを有していることが見出された（P> 0.05）に達していない。

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図1。LRRK1およびLRRK2の代謝標識。 A. LRRK1とLRRK2がHEK293T細胞.......

ディスカッション

本論文では^、32 P-オルトリンで代謝標識を使用した細胞株において、LRRK1とLRRK2の一般的なリン酸化レベルを測定するための基本的なプロトコルを提供します。全体的な戦略は簡単です。親和性はLRRKタ ​​ンパク質は³² P-オルトリン酸を含有する培地に曝露されたHEK293T細胞において発現されるタグ付き。 ³² P-オルトリンインキュベーションのわずか数時間後に細胞に同化され、リン酸塩を含有する細胞内の全ての分子は、それによって放射性標識されている。親和性タグ（3XFLAG）を次に免疫沈降によって他の細胞成分からLRRKタンパク質を単離するために使用される。免疫沈降物をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜および組み込まれたリン酸塩の分析にブロットは、ブロット上のタンパク質のオートラジオグラフィー^（32 P信号）およびウエスタン検出（タンパク質シグナル）によって行われる。このプロトコルは、LRRK2 AUを測定するためのプロトコルとは区別すべきであるLRRK1またはLRRK2の標識は、細胞培養ではなく、精製タンパク質を用.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン-32放射性核種、1 mCi、1 ml水中の緩衝リン酸二ナトリウム	Perkin Elmer	NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose)	Invitrogen	11971-025	This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel	Sigma	A2220	赤色のゲルを含む同等の製品(ビーズをより簡単に視覚化するのに便利)には、cat.番号F2426。
バイオ	・ラッド	1703965
Ponceau S solution	Sigma	P7170