カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる<sup&gt; 2 +</sup孔形成毒素の傷の修復&gt;とスフィンゴミエリナーゼ

サマリー

親油性色素FM1-43に曝露された細胞のライブイメージングは​​、孔形成毒素は原形質膜から除去されることにより、反応速度の正確な決定を可能にする。これは、Ca ^{2 +、}スフィンゴミエリナーゼおよび原形質膜の修復に関する他の要因のための要件を評価するために使用できる高感度のアッセイである。

要約

原形質膜の損傷が頻繁なイベントであり、創傷は急速に細胞の生存を確実にするために修復されなければならない。のCa ^{2 +}の流入は、30秒以内〜原形質膜上に機械的な創傷の修復をトリガする重要なシグナル伝達事象である。最近の研究では、哺乳動物細胞はまた、細孔が細孔エンドサイトーシスに続いてリソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼのエキソサイトーシスを伴うのCa ^{2 +}依存性プロセスでの毒素の形成に透過処理後に原形質膜を再シールすることを明らかにした。ここでは、毒素ストレプトリジンOにより透過性細胞の再シールは、Ca ^{2 +}流入にも迅速かつ依存していることを示すために使用される方法について説明します。アッセイデザインは、損傷事象および撮像により原形質膜の完全性を復元し、親油性色素FM1-43は細胞内膜に到達することによって程度を定量化する細胞の能力の正確な速度論的測定の同期を可能にする。このライブアッセイALSoは外因的能力の評価は、それらの感受性形質膜を修復する細胞の能力を反映して、FM1-43の流入を抑制するために、例えばスフィンゴミエリナーゼのような可溶性因子を添加することができる。このアッセイは、私たちは、酵素の細胞外のほかは、Ca ^{2 +}が存在しない場合に透過性細胞の再シールを促進するため、スフィンゴミエリナーゼは、カルシウム^{2 +}依存性エキソサイトーシスの下流で作用することを初めて示すことができました。

概要

これは、機械的損傷後の血漿膜修復は、Ca ^{2 +}依存性プロセスであること^1,2数十年前から知られている。その後の研究は、傷口を通してのCa ^{2 +流入}は^、3,4を再密封するために必要とされる傷害の部位で細胞内小胞のエキソサイトーシスの積極的なプロセスをトリガすることが示された。細胞の細胞質内にロード蛍光色素の損失の速度は、修復の速度を評価するために使用され、再封が損傷後⁵ <30秒以内に完了したと結論された。二つのモデルは、最初は、細胞膜修復にエキソサイトーシスのための要件を説明するために提案された。病変を通じてのCa ^{2 +}流入は、そのだろう大規模な「パッチ」を形成、細胞内小胞の最初に同型の融合を引き起こすことが示唆さ1）「パッチ」モデル、次いで、創傷⁶と、その膜を提案しADDE 2）張力低減モデルを再シールするために原形質膜に適用すること創傷の近傍におけるCa ^{2 +}依存性エキソサイトーシスによって⁷日間二重層の再封を容易にする、原形質膜の張力を減少させるであろう。原形質膜修復におけるCa ^{2 +} -誘発さエキソサイトーシスの役割は、リソソームが損傷菌におけるそれらのエキソサイトーシスおよび原形質膜の修復を促進するのCa ^{2 +}センサー分子、シナプトタグミンVIIを含有することを示す研究に....

プロトコル

1。 ASMの転写サイレンシング

1. シード1.5×10 35mmのガラスボトムディッシュ（MatTek社製）上のDMEM増殖培地（10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDMEM高グルコース、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン-ストレプトマイシン）2ml中の⁵ HeLa細胞および5％CO ₂インキュベーター内で37℃で一晩インキュベートする。
2. 翌日、増殖培地をオフ吸引し、siRNAトランスフェクション混合物を添加する前に2ミリリットルのDMEMを減少血清培地（4％FBSを含むDMEM）、少なくとも1時間に交換してください。
3. siRNAのオリゴトランスフェクション混合物のための4のチューブを準備します。チューブAとCに、トランスフェクトされる35mmディッシュあたり、血清および4μlのトランスフェRNAiMAXトランスを減少させた250μLのOptimemを追加。チューブBは、オプティメム250μlのを追加し、血清およびトランスフェクトされる35ミリメートル皿あたり制御メディアGC含量のオリゴ（対照siRNA）を8μlの（160ピコモル）、減少した。チューブDでは、追加のOptimem250μlの35ミリメートル皿Tあたり、SMPD1オリゴ（siASM）の血清および8μL（160ピコモル）を削減Oトランスフェクトする。室温で5分間チューブをインキュベートする。
4. チューブAおよびBは、トランスフェクションのためのコント....

結果

リソソーム酸性スフィンゴミエリナーゼで枯渇細胞における細菌スフィンゴミエリナーゼ（SM）レスキュー形質膜修復の低濃度。

FM1-43画像化アッセイを用いて、我々は、以前のCa ^{2 +}の存在下での創傷のリソソーム酵素ASM欠損とSLOに曝露された細胞は、原形質膜の欠陥は、組換えヒト酵素¹⁹の細胞外添加によりレスキューされていることを示した。ヒトリソソームASMは、最適な低pHを持っているので、我々は再密封も中性pHで完全にアクティブになっている、 セレウス菌 （シグマ）から精製されたSMの追加回復させることができたかどうかを調べた。以前に示されているように、セルコントロールsiRNAまたはASMのsiRNAオリゴで処理し、Ca ^{2 +}の（修理のための条件ではない許容）が存在しない場合にSLOにさらさ均等ASMの枯渇が毒素（ 図1Aに対する感度と干渉しないことを示し、透過処理した）。興味深いことに、完全な救助OSLOへの暴露後に再密封するためのASM欠損細胞の能力fをμU/.......

ディスカッション

機械的損傷と、細胞膜の修復に関する初期の研究では、ガラスビーズ、マイクロピペット、せん断、傷や削れを落とすに至るまで、負傷した細胞の多様なメカニズムに依存していました。すべてのこれらのアッセイの読み出しは、定性的ではなく定量的であり、修復機構の動力学に関する正確な情報を与えなかった。損傷のこれらの形態の後に原形質膜を再シールする細胞の能力は、細胞質内の細胞外液に添加トレーサーの有無によって、膜不浸透性色素、サイトゾル酵素の損失、ATPレベル、または長期の浸透を測定した細胞生存。これらのアッセイのいくつかは、定量的に行うことができるが急速に単一細胞レベルで再シールの動態を評価しながら、これらの研究における1つの大きな障害は、創傷イベントを同期させるのが困難であった。

筋線維のUV-レーザー傷害の開発および使用follo親油性色素FM1-43の流入を検出することによって結婚これらの研究^17,20における大きな進歩だった。代わりに削れやけがの類似の機械的手段によって、全細胞集団に与えた総ダメージのため、これらのアッセイは、単一細胞分析を可能にした細胞を創傷に複数の定.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Reagent
HeLa 229細胞株	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
リポフェクタミン RNAiMax	Invitrogen	13778
制御培地 GC含量 RNAi オリゴ	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi オリゴ		HSS143988
ウシ胎児血清 熱不活化	Gemini-Bioproducts	100-106
セレウス菌 Bacillus cereus	Sigma
35mmガラス底皿	MatTek	P35G-0-14
Material
>倒立顕微鏡	ニコン	エクリプス Ti
カメラ	浜松ホトニクス	C9100-50
スピニングディスク共焦点顕微鏡	PerkinElmer	UltraViewVoX
ソフトウェア解析ソフトウェア	PerkinElmer	Volocity Suite
環境チャンバー	病理学デバイス	LiveCell システムチャンバー

S7651 由来のスフィンゴミエリナーゼ