合成、細胞の配送およびインビボデンドリマーベースのpHセンサの応用

サマリー

蛍光センサーは、生命科学の強力なツールです。ここでは、生細胞およびin vivoでのpHを測定するために、デンドリマー系蛍光センサーを合成し、使用する方法を記載している。樹状足場が改善検知特性につながる共役蛍光色素の特性を高める。

要約

蛍光指示薬の開発は、生命科学のための革命を表していた。遺伝的にコードされたと検知能力を持つ合成フルオロフォアは、高い空間分解能と時間分解能との生物学的に関連の種の可視化を可能にした。合成染料は、その高い同調性と測定可能な分析物の広い範囲に特に関心のおかげである。しかし、これらの分子は、低分子の挙動（溶解度が低い、ターゲット設定の難しさ、許可された多くの場合、無レシオイメージング）に関連するいくつかの制限を受ける。本研究では、デンドリマーベースのセンサの開発を紹介し、生細胞及びin vivoで、in vitroで pH測定のための手順を提示する。我々はそれらのいくつかの生物医学機器に広く使用される足場た彼らの多くの望ましい特性（単分散性、波長可変特性、多価性）のために私たちのセンサーのための理想的なプラットフォームとしてデンドリマーを選択します。蛍光のpHの抱合デンドリマー骨格にインジケータが彼らのセンシング性能の向上につながった。特に、デンドリマーの展示は、セルの漏れを低減し、細胞内ターゲティングを改善し、レシオメトリック測定が可能です。これらの新規なセンサは正常マウス脳におけるHeLa細胞を生体内及び生体内の pHを測定するために使用した。

概要

特定の生体関連分子を標識するための蛍光分子の使用は完全に我々は生物学的システムを研究方法を変更しました。広視野と共焦点顕微鏡は、生物学的プロセスをリアルタイムで高解像度の可視化のために許可されたと、最近の細胞およびin vivoでのin vitroでの生物学的事象を研究するための最も人気のあるテクニックの一つです^。1関連の改善は、蛍光指標の開発で表したその蛍光の特定の分子実体の濃度に依存する、 すなわち染料。 pHとカルシウムの指標は特に起因する生物学において、H ⁺およびCa ^{2 +}イオンの膨大な関連性に細胞生理学の研究に大きな影響を与えた^。2,3

細胞内のtargetiにおけるI）難しさ：ただし、本センシング染料のほとんどいくつかの固有の制限は、次のような彼らの低分子行動に関連NGと、ii）水への溶解度が低い、その結果、貧困層、生体適合性、およびiii）細胞漏れ、したがって長期タイムラプスイメージング能力の欠如^4はさらに、多くのプローブの信号は色素濃度への依存のために補正することができない（非。レシオメトリックイメージング）、したがって、細胞またはin vivoで絶対的な測定は不可能である。

我々は最近、デンドリマー骨格上の感知色素のコンジュゲーションに基づき、これらの制限を克服するための簡単で効果的な方法論を説明した図⁵デンドリマーは、生物学的用途のための非常に魅力的な特性を有する単分散ハイパーブランチポリマーであり、特に^6は、複数の樹状アーキテクチャが開発され、使用されている薬剤⁷および遺伝子送達のために^。8ごく最近になっていくつかのグループは、センシングデバイス用の足場として、これらの分子の可能性を探求し始めた^。9,10,11

私たちは、以前にNHS-活性化エステルに基づく異なるポリアミドアミンの官能化に向けて容易に合成経路（PAMAM）足場を説明したコンジュゲート¹²のみを精製などの透析により単一工程で得ることができる。興味深いことに、このアプローチは容易に樹枝状またはポリマー足場、種々に適用することができる^。13,14

i）のpH指示薬（ すなわち、フルオレセイン）およびii）pH依存性蛍光部分（ すなわち、ローダミン）：レシオメトリックイメージングデンドリマーを達成するために二重標識色素の2セットであった。これは、フルオレセインおよびローダミンとの比はpHにし、これ以上のプローブの濃度にのみ依存しているように我々に正確なpHの撮影を行うことができました。寿命は、その測定値が、レシオメトリック補正を必要としないプローブ濃度に依存しないように、この問題へのもう一つの興味深いアプローチは寿命ベースのプローブを使用する^。15で表されます。しかし、LIFetimeの測定は、より複雑な楽器のセットアップを必要とし、それらの時間分解能は、従って、それらの潜在的用途を限定する、高速な生理的プロセスのために準最適である。

細胞内イメージングを行うために、プローブは、サイトゾルに原形質膜を横切って配信する必要がある。デンドリマーは、それらの大きさおよび親水性のために、膜透過されないように、細胞内送達は、エレクトロポレーションを介して達成することができる。この技術により、トランスフェクションのために広く使用される生物学において、標識された巨大分子を効果的に高品質のイメージングを行うために細胞内に送達することができる。巨大分子が直接細胞質に送達されるようにまた、エレクトロポレーションによりデンドリマーエンドサイトーシスに関連した合併症を回避することができる。興味深いことにエレクトロポ異なるデンドリマーの後でもシーケンスを対象とした全ての特定の非存在下では細胞内の個別のローカライズを示しています^。5このPASSIVEのみによりデンドリマーの物理化学的特性のために、ターゲットに、オルガネラ特異なpHイメージングを実現するために悪用される可能性があります。

レシオメトリックイメージング、共焦点顕微鏡を用いて行うことができる。共有結合した樹状足場に結合させ、フルオレセインおよびローダミンは、別々に画像化したと画素ごとの比マップが作成されました。イオノフォアを用いて生細胞における細胞内pHを制御するために、いくつかの手順が報告された。イオノフォアは、原形質膜を横切ってイオンを輸送することができる小さな疎水性分子であり、H ⁺イオンに対するイオノフォア、例えば、ナイジェリシンとして、入手可能であり、デンドリマーベースのセンサを較正するために使用することができる¹⁶これらの測定値を観察したものに同様にpHに線形応答を明らかにした。 in vitroで 。較正細胞内のpHに基づいて正確に測定することができる。これらの測定は、デンドリマーベースのセンサーは、研究H ⁺ homeost貴重なツールになり得ることを示し生きた細胞およびpH調整の誤動作を伴う病理学的プロセスにおいてASIS。

我々は最近、デンドリマーベースのpHセンサーは、麻酔したマウスの脳におけるpHの撮影を行う、 生体内でも適用することができることを実証した^。17により生体組織の複雑な環境へのインビボ検出の高い品質が技術的に困難である。ここでは、脳内の正確なpHイメージングを実行するために取り組むべき重要な課題の重点を置いて、生体内のpHイメージングのための実験手順の詳細な説明を表示。二光子顕微鏡法は、2つの主な理由のために使用されている：i）の赤外光の使用は、標準的な共焦点顕微鏡の組織浸透性の欠如を克服することを可能にすること、ii）フルオレセインおよびローダミンの広い二光子吸収は、それらの同時励起を回避することを可能励起用2波長の使用に関連する合併症。マウス脳におけるpH測定であった正常に実行、センサーが容易に脳細胞外空間中のpHの変化を誘導する低酸素状態に応答します。これらの測定は、デンドリマーベースのインディケータが正常動物モデルにおけるin vivoでのpHの生理学的および病理学的変化を強調するために使用できることを実証している。

プロトコル

1。センサーの合成

1. 次のセクションでは、PAMAMデンドリマーにpH指示薬の結合のための手順を提供する。同一のプロトコルは、代替のアミン含有デンドリマーに最少の改変を適用することができる^{。5,17,13,14、}市販のデンドリマーおよび染料をさらに精製することなく使用することができる。
2. 無水DMSO（50μM最終濃度）にデンドリマーを溶かす。無水DMSOフルオレセインNHSおよびテトラメチルローダミン-NHS（TMR）の10mMのストック溶液を準備します。
3. デンドリマー溶液にフルオレセインとTMRの所望の量を追加します。混合物中のモル比は、デンドリマー上にロード染料の量を反映する。通常、マイクロチューブ内のG4 PAMAMデンドリマー溶液1mlは、フルオレセインとTMRの8 EQ（40μL）の8 EQ（40μL）と反応させる。 12時間室温で溶液を撹拌した。
4. 脱イオン水で1:10に希釈し、反応を読み込む透析バッグ（MWCO = 10kDaの）中の混合物。リザーバ内に頻繁に水を交換し、脱イオン水に対して24時間透析。
5. 24時間バイアル凍結乾燥の解決策を転送します。紫色の粉末が得られるはずである。重量が得られた固体および10μMの最終濃度でミリQ水に溶かす。 -20℃でのソリューションや店舗を分取

2 インビトロ pH測定

1. in vitroでのキャリブレーションのために石英キュベット中のPBS中デンドリマーの溶液500nMの（2 mMリン）を準備します。滴定中のpHの急激な変化を避けるために、非常に希薄PBS緩衝液（2mMの）の使用を推奨します。
2. フルオレセインの発光スペクトル（488nmで販売）及びTMR（大口550 nm）を測定し、良好な信号対雑音比を達成するために、蛍光光度計の光学設定を最適化する。
3. すべての添加がキュベットを振った後、NaOHを0.1 N及びHCl 0.1 Nの小さなボリュームを追加することにより、pH滴定を行う混合するため、平衡化のために1分待ってからpHの微小電極を用いてpHを測定します。フルオレセインおよびTMRの発光スペクトルは、光の設定を変更せずにステップごとに記録されるべきである。
4. 滴定のためのpH対蛍光強度をプロットします。ローダミン信号は、pH（<10％）による影響を受けなければなりません。フルオレセイン信号はS字状曲線でなければならず、主キー= 6.4のシングル結合モデルを装備する必要があります。

3。細胞培養およびエレクトロポレーション

1. 10％ウシ胎児血清および100 U / mlのペニシリンおよび100 mg / mlのストレプトマイシン（Invitrogen）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHeLa細胞を養う。加湿した5％CO ₂雰囲気中37℃で細胞培養を維持する。
2. デンドリマーエレクトロポレーションのために、細胞がコンフルエントされている場合、メディアを取り出し、DPBS（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）を用いて細胞を洗浄します。 DPBSを削除し、トリプシン-EDTAを追加します。トリップを中和血清を含む培地ではなく、抗生物質を添加することによって罪。室温で2分間900-1,200 rpmで遠心分離する。メディアを取り外し、DPBSを使用してペレットをすすぐ。
3. 細胞をカウントし、4 * 10 ^6個の細胞を取る。室温で2分間1,200-1,500 rpmで遠心分離する。
4. （microporatorの製造元から提供されている）マイク​​ロポ緩衝液200μl中で細胞ペレットを再懸濁し、1.5 mlのマイクロチューブに細胞を移す。
5. 再懸濁細胞へのデンドリマーの水溶液を加える。サンプルごとに必要なデンドリマーの量は、PAMAMタイプ（カチオンと中性デンドリマーのために2μMのため、通常250 nM）を依存しています。
6. マイクロポチューブに（microporatorの製造元から提供されている）エレクトロポレーション緩衝液を追加します。 100μl容量サイズのエレクトロチップで細胞やデンドリマーの混合物をピペット。ピペットステーションにmicroporatorピペットを挿入します。パルス電圧= 1005 V、パルスWID：マイクロポのためのパルス条件を設定する目= 35ミリ秒、パルス数= 2。
7. 1,200 rpmで5分間の1.5mlマイクロ遠心チューブに細胞を遠心パルス伝達細胞は、培地中の過剰なデンドリマーを除去した後。新鮮な培地でプレート35ミリメートルのガラスボトムディッシュ上にエレクトロポレーションした細胞を10μl（WillCo皿GWSt-3522）W / O抗生物質。

4。リビングHeLa細胞内のpHセンシング

1. エレクトロポレーション後、共焦点顕微鏡を12時間と画像セル。
2. フルオレセインおよびローダミンのための標準的なフィルタセットを使用することができる。チューナブルフィルタが使用可能な場合は500から緑のチャネルを設定する - 550 nmおよび650 nmの580 nmのから赤チャンネル。ローダミンはどちら543nmのか561レーザーラインで画像化することができますが488での励起は、フルオレセインに最適です。
3. 試料に焦点を当て、信号対雑音比を最大にするレーザパワーと検出器の利得を調整する。エレクトロポレーションが成功した場合、細胞は、両方のチャネルで明るく蛍光である必要があります。ザ·ローカライズが使用デンドリマーの大きさおよび電荷に依存します。多くの場合、いくつかのリソソーム局在性（小核周囲小胞）が原因エンドサイトーシスまたは区画に存在している。リソソーム局在化が支配的である場合、 すなわち 、蛍光の大部分がベシクル内部に不良信号局在化される細胞質ゾルにおいて観察され、これは、毒性および測定が廃棄されるべきである意味する。取得複数の画像を必要に応じて、順次、2つのチャネルを取得し、画像品質を向上させるために画像を平均化する。
4. 異なるpHでイオノフォアを有する緩衝液を用いて較正クランプセルのためのpHは、上記のようにpHをあたり少なくとも20細胞を獲得する。手順の詳細な説明およびバッファーの成分のためBizzarriや同僚を参照してください^。16私たちは、pH = 5.5のpH = 7.5、少なくとも5点を測定することをお勧めします。 6未満のpHは、細胞に対して毒性ではなく、短い時間のために許容され、我々は可能な限り迅速に画像を取得することを示唆している。もし細胞アポトーシスの兆候を示さ、セルを廃棄し、再起動してください。
5. データ分析のためのImageJまたは類似のソフトウェアを使用してください。緑と赤のチャンネルの画像をインポートし、バックグラウンドを減算し、ツールの「画像電卓」の画素比イメージングによってピクセルを作成します。
6. 所望のセルを選択する関心領域（ROI）を描画し、細胞内の緑から赤色の比率を測定します。取得したすべての画像を分析し、次にpHに対する比率をプロットします。 5.5から7.5の範囲での傾向は直線的である必要があります。得られた点の線形フィットは、pHに緑色〜赤色の比率を変換するために使用される較正曲線を与える。
7. さらに対照として、いくつかの未処理細胞（NOイオノフォア）を取得し、得られた検量線を用いてpHを計算してみてください。 7.2と7.4の間の値​​を取得する必要があります。

5。 インビボサンプル調製

1. 実験は、出生後のDとのC57BL/6J（雄と雌）を実施したAY 28と70。ウレタンの腹腔内注射（ すなわちエチルカーバメート）（20％生理食塩水中のW / V、20 mg / kgのウレタン）でマウスを麻酔し。動物は、同じ麻酔薬の心臓内注射したウレタンの過剰摂取を用いた実験後に屠殺した。
2. 手術中に皮質ストレス反応および脳浮腫を減少させるためにリン酸デキサメタゾンナトリウム（2 mg / kg体重）の筋肉内注射を行う。
3. 動物の頭を剃ると頭皮に2.5％リドカインゲルを適用します。
4. 両半球の頭蓋骨をカバーする皮膚のフラップをカットするはさみを使用して、
5. 生理食塩水を用いて露光骨を洗い、軽くピンセットを用いて骨膜を削除します。これは、接着剤とを接着するための歯科用セメントのためのより良い基盤を提供します。
6. 中央イメージング室とカスタムメイドのスチールヘッドポストを適用し、平面上にシアノアクリレートとそれを接着し、約私の皮質領域の上の頭蓋骨に平行なnterestと白の歯科用セメント（Paladur）で所定の位置に固定します。
7. 関心のある領域にわたって掘削直径2〜mmで開頭を実行するために、マウスの頭部を固定します。
8. 手術、硬膜涙、または出血の際に皮質の加熱を最小限に抑えるようにしてください。
9. 無菌ACSF（126のNaCl、3のKCl、1.2mMのKH ₂ PO _4、1.3のMgSO _4、26 mMの_炭酸水素ナトリウム、2.4のCaCl _2、15 mMグルコース、蒸留H ₂ O中1.2のHEPESで灌流皮質を保つ液、pH = 7.4）。

6。マウス脳におけるpHイメージング

1. O ₂富化空気を提供する実験援助動物呼吸の間。酸素は80％まで濃縮される。 O ₂分圧および流量は、しばしば、適切な呼吸補助を得るために調整される。フィードバック制御された加熱ブランケットを37℃の体温を一定に保つ。
2. 2 - 写真の目的の下に鋼製のポストを通して動物を修正しました。n個のイメージングセットアップ。
3. 大脳皮質にセンサーを注入するためにデンドリマー溶液（1μM）とAgCl電極（先端径4ミリメートル）を含むガラスピペットをロードします。電極は細胞外電場電位を記録することができるようになります。
4. マイクロインジェクションのセットアップを150μm程度の深さで皮質にピペットを挿入します。 0.5 psiの圧力で1〜2分間注入する。
5. イメージング用の光学セットアップを最適化します。レーザー出力は光退色と光損傷を最小化するように調整する必要があります。典型的に用いられるレーザパワーが以前の校正がこの電圧は、最良のS / N比が得られることが示されたのでミリワットおよびPMTゲインは667 Vで一定に保った約20である。
6. イメージングのために820 nmでセンサーを励起し、標準FITC及びTRITCフィルターを通して、フルオレセインおよびローダミンの蛍光を同時に検出。
7. 時間分解測定は、2 Hzで、タイムラプスシリーズを獲得。
8. バックグラウンド補正のためにLASEとダークフレームを取得するRシャッターは通常、電子回路によって追加された光電子増倍管と台座に発生する平均熱ノイズを測定するために閉鎖。
9. データ解析のために第4章で報告されたのと同じ手順に従ってください。

結果

図1は、異なる樹状足場に染料を感知するのコンジュゲーションの概略図を示す。得られた指標は、市販品から1つの合成工程で容易に得ることができる。アミン含有デンドリマーはDMSO中のNHS-活性化色素と反応させ、透析によって精製される。この一般的な手順は、すでに成功して、いくつかのデンドリマーの標識に使用されました。I）PAMAMデンドリマー世代^{2、4、6、12、}ペグ化PAMAMデンドリマー¹⁷及びPEG-樹状雑種^18。としての明確なデンドリマーは、樹枝状構造の選択が強く、目的のアプリケーションに、目的の試料に関連している細胞や組織（ローカリゼーション、毒性、浸透性、拡散）との異なる相互作用を示している。

ⅰ）pH指示薬と内部標準として働くII）pH非感受性部分：センサーは、蛍光色素の2セットを備える。 ALTH指標と参照の多種多様ウワーッ利用できる、最良の結果は、フルオレセインおよびテトラメチルローダミンで得られている。つの色素の比は、反応において異なるモル当量を使用して簡単に調整す...

ディスカッション

デンドリマーベースのセンサとの正常なpHイメージングのための重要なステップは次のとおりです。I）正しい樹状足場の選択と、それに結合させ指標の数や細胞内や生体内でのセンサ配信プロトコルのII）は、最適化。

合成手順は非常に簡単であり、すべてのアミン持つハイパーブランチポリマーに仮想的に適用することができます。センサは、単一のステップにおいて市販のデンドリマーおよびNHS-活性化染料から得ることができる。我々は、このモジュール式で簡単な手順では、生物学のさまざまな問題のためにそのようなセンサの更なるアプリケーションのために有益であると考えています。精製は、効果的にコンジュゲートしていない色素を除去するために透析することによって達成することができる。樹状足場の選択は非常に重要であり、所望の特定のアプリケーションに依存します。異なるデンドリマーは、sとの特異的相互作用に起因し、細胞内の特有の局在を有することが示されているubcellular構造。 （PAMAM G4のアセチル化など）ニュートラルデンドリマーは、細胞内の任意の相互作用を示し、びまん性局在を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	ライフテクノロジー	C-1311
TMR NHS エステル	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
ウレタン	Sigma-Aldrich	U2500