ランダムMicroseedマトリックススクリーニングによってタンパク質結晶化の成功率を向上させる

サマリー

ここでは、ランダムmicroseedマトリックススクリーニングのための一般的方法を記載する。この技術は、有意に、タンパク質結晶化スクリーニング実験の成功率を高める最適化の必要性を低減し、データ収集およびリガンド浸漬実験の結晶の安定供給を提供することが示されている。

要約

ランダムmicroseedマトリックススクリーニング（リスク管理措置）は、種結晶をランダム画面に付加されたタンパク質結晶化技術である。結晶は、タンパク質の相図の準安定域で成長し、余分な結晶化リードがしばしば得られる可能性を増加させることにより、製造された結晶の品質を向上させることができ、データ収集および浸漬実験のために、結晶の十分な供給が提供される。ここでは、手または96ウェルまたは24ウェルトレイ形式で、液体ハンドリングロボットを用いてのいずれか確立シッティングドロップまたはハンギングドロップ蒸気拡散実験のいずれかに適用することができるリスク管理措置のための一般的な方法を記載している。

概要

ヘモグロビンやミオグロビンの構造を決定する上でペールツ、ケンドルーとその共同研究者によって、その最初の適用から、構造ゲノムコンソーシアムのパイプラインを自動化された現代的なハイスループットに、巨大分子のX線結晶学は私たちに、タンパク質の世界に前例のない構造的な姿を与えている。この技術では、原子、または原子レベルの分解能（ すなわち、1〜3Åの範囲）付近のタンパク質構造の直接的な可視化を可能にする最も広く適用できる実験方法のままである。タンパク質に適用されるX線回折の前提条件は、それが最初に結晶化されなければならないことであり、それは回折法^1、2による構造決定における唯一最大の律速段階のままプロセスのこの段階である。タンパク質結晶化の過程の理解が大幅に進歩し、結晶化スクリーンの品質と可用性の大幅な改善にもかかわらず、トレイ、および関連技術は、確実に、結晶化の成功³の可能性を予測することは不可能のままである。生化学的および生物物理学的方法は、対象ディスプレイのタンパク質が結晶核生成と成長のための良好な特性、 すなわち、それがうまく折り、均質な単分散などであるかどうかを評価するために適用することができる、しかし、決して、これらの知見は、結晶化の決定的な予測を提供傾向。

播種は、既存の長い結晶または結晶性物質^4-7の数、サイズ、及び品質を向上させるための実行可能な方法であることが主張されている。このアプローチは、結晶核形成を支持する状態が続く結晶成長およびその逆のために最適ではないかもしれないことを前提としている。別の状態から核物質を転送することによって、人はまだ未踏の結晶空間として、このように新たにアクセスを与え、効果的にこれらのプロセスを分離しようとする場合があり、その結果、スクリーニング実験の全体​​的な成功率を増加させる。確立された方法は、（i）マクロシーディング、別の⁸ 1つの状態から、その全体が単結晶の転写、一般に、例えばした指向性圧力を加えることによって得られた（ii）のストリークシーディング、核物質の移動のために文書化されている猫の新しい結晶化ドロップ⁹を介してウィスカの後続の通過に続いて、既存の結晶の表面にウィスカ、および（iii）「古典的な」microseedingは、収穫することによって生成された結晶を「シード」の移動は、結晶（または結晶を砕いシード^10をもたらしたものと同様の条件への材料）、。注目すべきことに、これらの方法の3つのすべては、確かに近代的な液体処理結晶化ロボットを用いて達成可能であるものと比較して、時間がかかり、不十分スケーラブルです。これらの要因は、その種子知覚に、少なくともいくつかのレベルで、貢献してきましたINGは他のアプローチが実を結ぶことができなかった場合にのみ訪問する方法である。

ランダム行列microseeding（リスク管理措置）は、ハイスループットスクリーニングとスケーラビリティ^11月13日のものと伝統的なmicroseedingの利点を組み合わせた最新の方法論的革新です。このアプローチは、標準的な96の条件結晶化画面内の各sub-well/coverslip /上に分注しことが有核結晶質材料から製造シードストックの生成に依存している。この方法は、手動で、または24ウェルまたは96ウェルトレイ形式の液体取り扱いロボットを用いて、いずれかの確立されたドロップ蒸気拡散実験を、座ったりハングの両方に適用可能である。リスク管理措置が大幅に結晶化の成功率を高め、より大きな回折品質および量^11、13、14の結晶を生成するために実験的に証明、およびoにおけるアプローチの結晶学者'武器の中で革新的なツールを表すされている結晶化の成功に向けて努力をngoing。ここでは、リスク管理措置のための一般的な方法を説明し、この技術の有効性を示すサンプルデータを提供する。

プロトコル

1。戦略的な考慮事項

1. microseeding実験のために使用するシード結晶の選択は、実験の目的に依存して変化する。プロジェクトの開始時に、結晶の最適化のための代替出発点を提供することができるいくつかの結晶化ヒットを見つけることは有用である。良好な品質の結晶が乱れ、すなわち以下または平衡システムに戻る核生成領域において、相図の準安定域で成長する可能性が高いため、リスク管理措置が大きく、結晶の最適化の必要性を低減する。そこで我々は、日常とすぐに最初の結晶が（とすぐに最初の結晶が成長を止めたように、より正確に、または）が得られるようにリスク管理措置を使用してお勧めします。
2. リスク管理措置の最初のラウンドのため、シードストックは、可能な限り多くの結晶性の材料で作られるべきである。一つだけでなく、結晶が含まれて提供されていたり、結晶が小さい場合、それは、複数の繰り返しを設定するために役立つ可能性がある場合結晶の供給を増加させる（シーディングなし）オリジナ​​ルヒット。しかし、いくつかの異なるヒットが得られた場合、種結晶は、いくつかの条件から収集し、一緒に混合することができる。
3. 相分離を回避するために、高塩条件で成長した結晶は、高PEG条件において成長した結晶とは別個に収穫されるべきである。いくつかのウェルから結晶が混在している場合、塩の結晶を得にくくなるリザーバー溶液は、種子懸濁液のために選択されるべきである。例えば、リン酸塩、硫酸塩、カルシウムおよびマグネシウムの高濃度は避けるべきである。
4. 後でプロジェクト内には、回折を改善双晶を回避し、リガンドと結合するのに適した結晶を得るために、異なるユニットセルを有する結晶を探すために重要であり得る。この段階で（ 例えば最善を回折するもの）は、最も適した結晶は、種ストックを作るために使用されるべきである。 microseedingの時々繰り返さラウンドはここだけ "最高の、必要とされる「結晶は、その後のラウンドのためのシードストックを作製するために使用される。可能な場合は、「例えばPEG 3000などの中性「沈殿剤は、新規な結晶接触を促進するために、高で不安定であり得る複合体を結晶化シード結晶を懸濁するために使用されるべき-塩溶液^12。
5. 単結晶化条件が使用されている古典的なmicroseeding実験は、多くの場合、有望な状態のとその後の最適化中の識別以下の役に立ちます。これは、液滴当たりの結晶の所望の数を得るために、種ストックを希釈することがしばしば必要である。 （増加希釈のシードストックを一連の結晶化条件に追加される）「コンビナトリアル」microseeding実験は、シードストックの最適希釈を見つけるための迅速な方法である。このアプローチは、以下に説明する。

2。シードストックの調製

1. ブンゼン炎を用いたガラスパスツールピペットから丸みを帯びたガラスプローブを作る。
   1. それが柔らかくなるまで中央付近ピペットを加熱し、その後すぐに炎からそれを削除して、端を離れて引っ張って、それを引き出す。ダウン0.25ミリメートル以下の直径にガラスを引っ張ることを目指しています。
   2. それは周りの0.25ミリメートルである点でガラスを割って簡単に炎に分割端を急落。 〜0.75ミリメートルの直径が端部に形成されたガラスの半球までこれを繰り返します。このプローブは、それが適切に0.01〜1.0ミリメートルスケールで固体物体に衝突するための大きさで、それを結晶化トレーサブウェルまたはカバースリップのプラスチック表面を損傷しないような結晶材料を粉砕するために有用である。結晶がガラスとプラスチックの間に閉じ込められているので、より大きなプローブ（〜1.0ミリメートル）がより効果的に小さな結晶を押しつぶすことがあります。
2. 氷上のシードビーズを含む1.5 mlのマイクロチューブを配置します。
3. 双眼顕微鏡又は結晶イメージングシステムを用いて事前に確立された結晶化トレイを検査し、一つ以上のAPを選択する種ストックを生成するための結晶材料を収穫する、そこからトレイから井戸をpropriate。どのような材料は、微細な針、球晶、微結晶と不規則な、不完全に形成された結晶を含むことができます。結晶が成長を止めた後に古い資料は、このように播種実験における使用のためのその適合性を低下させる、部分的に架橋されやすくなるようにシードストックは、できるだけ早くなされるべきである。疑義を回収する結晶性物質が塩またはタンパク質であるかどうかについて存在しない場合だけでなく、従来の開口にUV蛍光顕微鏡または撮像システムを用いて視覚化することができる、または結晶材料は、 その場 X線回折分析に供され得るトレイに。 UV照射下で蛍光を発する前者のタンパク質結晶を使用する場合、塩結晶は、無色に見えるであろう。
4. うまく選択された結晶化トレイを開きます。 96ウェルを中心に、上側プラスチック封止シートを切断ドロップトレイを座ってするためのUSIでなく、選択しメスの刃ngの。 24ウェルハンギングドロップトレイ用ピンセットを使用してカバースリップを削除します。カバースリップを反転させ、安定したクリーンな面に置きます。リザーバー溶液50μlを取り外し、チューブを通して氷の上に残っていることを確実にシードビーズを含むマイクロ遠心チューブにこの液体を移す。
5. 徹底的に、顕微鏡下での結果を見て、セクション2.1で作製したガラスプローブを使用して、subwell（96ウェルトレイ）やカバーガラス（24穴トレイ）滴結晶をつぶす。小さな結晶を徹底的に鎮圧するのに数分かかることがあります。このステップは、彼らは塩の結晶ではないことも実験者は結晶がつぶすのは簡単であるため、架橋されていないことをチェックすることを可能にし、。塩の結晶は、聞いたこと、それらが破砕されたとき感じることができる独特のクリックを生成します。結晶は、新鮮な材料を入手し、使用しようと潰すのは難しいが困難である場合。
6. シードビーズ管からリザーバー溶液5μlを取り外し、T同等のサブウェルに順伝達（ドロップ実験を行っ座って）、またはカバースリップ（落下実験をぶら下げ）収穫される結晶性物質を含む。可能な限り、サブウェルまたはカバースリップの内容をできるだけ多く再懸濁するためにこの液体を上下に5〜6回ピペット。シードビーズチューブにサスペンションを返し、さらに2回、この手順を繰り返して、できるだけ多くの結晶性物質は可能な限り収穫されることを保証する。
7. 氷上でチューブを冷却するために、30秒毎に停止する、2分間のシードビーズをボルテックスする。
8. 各段階で4から10倍にリザーバー溶液中の種ストックを希釈、希釈系列を作る。典型的には、あまりにも多くの結晶が希釈されていないシードストックを用いたときに得られたので、ウェルあたりの結晶の数を制御するために希釈された種子ストックを使用することができる。種子の濃度よりも大きい結晶化ヒットが得られるため、リスク管理措置の最初のラウンドでは、シードストック溶液を希釈しないことが重要である。
9. それは直ちに使用しない場合ately、ストレージのためのCの冷凍庫-20℃にシードストック懸濁液と希釈種ストックを転送、または-80。少量ずつ、 すなわち 10〜20μlの中で、この物質を保管、シードストックの有効性を低下させるかもしれない、凍結融解の繰り返しを防止します。凍結したら、必要になるまで、種子ストックは、無期限に保持することができる。

3。結晶化トレイの設置

1. 結晶化設備、実験者の好みの可用性に応じて、リスク管理措置結晶化スクリーニングは、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いたハンギングドロップ蒸気拡散法、または96ウェルトレイを用いた24ウェルトレーのいずれかを用いて行うことができる。リスク管理措置のための結晶化トレーは、ロボットディスペンサー液体処理、またはその2つの組み合わせを使用して、どちらの手によって確立することができる。
2. 手で設定され、典型的なリスク管理措置の実験は、タンパク質溶液、1.0μlの結晶化条件μL1.0を含むであろうし、0.5μLシードストック。結晶化ロボットを使用して設定典型的な実験では、0.3μlのタンパク質溶液、0.2μlの結晶化条件、および0.1μlの種ストックを含む。
3. 24ウェルドロップトレイをぶら下げにリスク管理措置のスクリーニングを行うためには、まず、手動ピペットを用いて、4×24ウェルpregreased結晶の各ウェルに10ミリリットル単一チューブ形式で96ウェル条件晶画面から各条件を300μlを転送トレー。
   1. 前面と背面保護用バッキング·ストリップの両方が除去された、対応するプラスチックカバースリップの表面にそれぞれ300μLリザーバから各結晶化条件の転送1μL。
   2. 各結晶化条件の1μlに結晶シードストックの0.5μLに続くタンパク質溶液1μlを加える。液体の滴が適切でなく、上記を下向きにし、位置になるように、各カバースリップを反転します。
   3. カバーガラス上で下方向に押して、sealiを圧縮グリースngの、安全なシールを形成する。一旦全て96滴が確立されて、トレイは通常、ストレージの範囲は4から18℃の中で、保育器や恒温室に転送する必要があります。
4. 96ウェルシッティングドロップトレイにリスク管理措置のスクリーニングを行うためには、まず、結晶化トレーの対応するウェルそれぞれに深いウェルブロックフォーマットの96ウェル条件晶画面から各条件の20から50μLを転送します。この転写工程は、8チャンネルピペットを用いて結晶化ロボット、または手動のいずれかにより転写を用いて行うことができる。
   1. 手または3.1に詳述されたボリュームを使用してロボットと滴の貯水池、タンパク質と種の原液を転送します。いくつかの市販結晶化ロボットがディスペンス接触しない、そのようなシステムを用いてシードストック転送を行うことにより分注チップの閉塞または関連する管類をもたらし得る。ディスペンシングの順序は可変である：いくつかのロボットが同時にすべてのソリューションを分注する。もしこれは不可能ですし、株式をシードし、貯水池、第一のタンパク質を分注する。
   2. ロボットを分配接触が鈍い針を装着し、低容量ガラス製注射器を用いて、種子利用でき、転送されていない場合。各ドロップに種ストックを分配リザーバー溶液を通過させることにより、針を洗浄します。
   3. 透明封止シートを使用して、トレイを密封し、インキュベーターや保管のための恒温室に移す。

4。結晶化トレーの検査

1. 双眼顕微鏡や結晶イメージング·システムのいずれかを使用して、すべての結晶化実験を視覚化する。前者は一般的に、ビューの深さ以上のユーザーより詳細に制御し、後者よりも拡大率が得られるが、より多くの時間がかかります。
2. シーケンス内の各sub-well/coverslipを検査し、結晶形成の証拠を記録します。実験は、設立後5日間に一度、24時間点検されるべきであるNその後に一度7日までの4週間。
3. 最適回折品質の結晶が生成される前に、リスク管理措置の複数のサイクルが頻繁に必要とされる。

結果

RMMS実験の（A）実施例

リスク管理措置のスクリーニングの有効性を実証するために、我々はニワトリ卵白リゾチーム（HEWL）およびウシ肝臓カタラーゼ（BLC）の結晶化にこの方法を適用する。これらの酵素は極めて結晶性であり、構造的によくターゲット^15,16の両方を特徴とする。このような両方のリスク管理措置で達成可能な強化された結晶化の成功率を説明するために、優れた被検者に提供したよう。結晶化実験は96ウェルの液体処理ロボット工学を使用して、ドロップトレイフォーマットを座って設立された。 HEWLとBLCの溶液は、それぞれ100ミリグラム/ mlおよび20 mg / mlの最終濃度を20mMのトリス-HCl、150mMのNaCl、pH7.5の中の各々の凍結乾燥粉末を溶解することによって製造した。各タンパク質の3の96の条件結晶化スクリーンが使用された。JCSG、PACTとモーフィアス。 microseedingずに結晶化スクリーニングは、リザーバ50μLのボリューム、2μLを用いて行ったタンパク質溶液とリザーバー溶液の1μLの1μLを含有するシッティングドロップ。 6枚...

ディスカッション

本論文では、リスク管理措置のタンパク質結晶化スクリーニングのための一般的な方法を記載している。我々は、このメソッドを使用して、2つの試験タンパク質の結晶化の成功率の著しい増強を用いて実証した。リスク管理措置及び非リスク管理措置法を用いて作製した結晶のサブセットの放射光を用いた回折分析は^、以前の著者らは良質の結晶がRMMS実験¹¹で増殖する可能性が高いことを報告しているが、いずれの方法を用いて成長した結晶との間の回折品質にほとんど変化を明らかにした^13。彼らは結晶化し、異常に容易であるためHEWL及びBLCは非定型な結果を与えている可能性があります。また、リスク管理措置実験で使用結晶シードストックの濃度を最適化することの重要性を示しており、これは、回折品質結晶の最適な数が生成されることを保証するために希釈することによって調整することができる方法を示す。

リスク管理措置は非常に単純な、高スループットである伝統的なスクリーニング方法を補完するために使用することができるスケーラブルな方法。実験は、96ウェルまたは24ウェルト...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	非UV対応、ロボットClearViewシーリングシートによって確立されたスクリーン用
	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
鶏卵白リゾチーム	Sigma-Aldrich	L6876	~95% 純度
ウシ肝臓カチラーゼ	Sigma-Aldrich	C9322	純度95%
キシラナーゼ	ハンプトンリサーチ	HR7-104
Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Bacillus thermoproteolyticus 六甲からのサーモリシン	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 スクリーン	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	によって確立されたスクリーン用
スクリーン	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	ロボットによって確立されたスクリーン用
Morpheus HT-96 スクリーン	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	ロボットによって設立されたスクリーン用
Crystal Ph–nix液体処理システム	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
双眼実体顕微鏡	Leica	M165C
メスブレード	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μlピペット	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μlピペット	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl ピペット	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	手作業で確立されたスクリーン用
PACT プレミアスクリーン	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	手で確立されたスクリーン用
Morpheus スクリーン	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	手作業で確立されたスクリーン用
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml ガラス パスツールピペット	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	手
作業で確立されたスクリーン用30% (w/v) PEG 8000、0.2 M 硫酸アンモニウム、0.1 M カコジル酸ナトリウム pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000、0.2 M 酢酸マグネシウム、0.1 M カコジル酸ナトリウム pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000、100 mM クエン酸 pH 5.0