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方法論記事

前立腺発がんおよび良性前立腺過形成の評価のための腎皮膜異種移植および皮下ペレット移植

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DOI:

10.3791/50574

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2013年8月28日

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1Department of Urology, University of Wisconsin-Madison, 2Medical Scientist (MD/PhD) Training Program, University of Rochester School of Medicine & Dentistry, 3Molecular and Environmental Toxicology Center, University of Wisconsin-Madison

この記事について

サマリー

我々はマウスに圧縮されたホルモンペレットの製造だけでなく、皮下の外科的移植について説明します。この戦略は、ホルモン発癌および良性前立腺増殖の調節を評価するために、無胸腺ヌードマウスの腎被膜下に細胞および組織の異種移植片の増殖と組み合わせることができる。

要約

つの一般的な前立腺疾患、前立腺癌（PRCA）および良性前立腺肥大症（BPH）のための新しい治療は、それらのホルモン調節を評価する実験に決定的に依存する。性ステロイドホルモン（特にアンドロゲンおよびエストロゲン）がPRCAおよびBPHに重要である、私たちは、圧縮されたホルモンのペレットを用いた実験でマウスの前立腺の成長と発癌を誘導するそれぞれの役割を探る。ホルモンおよび/または薬物ペレットを容易にペレットプレスで製造され、外科的に雄マウス宿主の皮下組織に移植される。我々はまた、免疫不全マウスの腎臓被膜下前立腺細胞組換え体の異種移植皮下ホルモンペレット移植を組み合わせることにより、ホルモン発癌性の評価のためのプロトコルを記述します。また、皮下ホルモンペレット移植は、BPH組織の腎カプセル異種移植との組み合わせで、より良い良性プロストのホルモン調節を理解することが有用である成長を食べ、性ステロイドホルモン経路を標的新しい治療法をテストする。

概要

前立腺癌（PRCA）および良性前立腺肥大症（BPH）は、重大な健康上の負担である。 PRCAは、男性で二番目に普及して固形臓器癌および癌関連死1の主要な原因である。 BPHは、また高齢の男性の間で非常に流行している、そしてそれがBPHの臨床症状は、下部尿路症状（LUTS）、男性の2の50から90パーセントに影響を与えると推定されている。アンドロゲンおよびエストロゲンは、PRCAおよびBPHに重要であることが知られているが、発癌および成長ホルモンの根底にあるメカニズムの理解は不完全なままである3,4。シンプルかつ遺伝的に扱いやすい動物モデルは、前立腺の研究にこれらの優先順位に取り組む研究を支える。このようなPRCAおよびBPH、immunocompに単独で、または腎被膜の異種移植と組み合わせて、皮下、徐放ホルモンペレットの使用、（別のものに1種からの細胞、組織または臓器の譲渡）などのホルモン応答性の疾患におけるromisedマウス宿主、成長と発がんのホルモン調節を研究するための簡単​​で再現性のある方法を提供する。

皮下ホルモンペレット移植は、発癌や前立腺5良性成長ホルモン調節を研究するための簡単で再現性のある手法である。 25 mgのテストステロン（T）および2.5 mgの17β-エストラジオール（E2）の成人雄マウスの皮下移植は、加齢男性5,6のダイナミックなホルモン環境を再現し、血清中のE 2の増加とTが徐々に低下する。また、このモデルは、BPH-LUTS 5,7の臨床的特徴の多くを再現する。ホルモン投与の代替方法としては、経口/強制経口投与又は腹腔内注射を含む齧歯類に苦痛を引き起こす、時間をかけて同量の薬物を提供する上であまり一貫性があり、より多くの労働集約的な1回限りの外科的移植よりも。 Hのための他の皮下モードormoneおよび/ ​​または薬物送達は、シラスティックカプセル8が含まれています。我々はまた、シラスティックカプセルの使用経験がありますが、圧縮されたペレットを使用し、再現が容易であるため好まれている。また、圧縮されたホルモンペレットの放出速度は、より良好な老化、男性5,7で観察され、動的性ステロイドホルモン比を模倣する。

遺伝的に免疫不全マウスの開発以来、異種移植技術を組み込む多数のin vivoモデル系は、正常および疾患組織の多種多様な研究のために開発されてきた。異種移植のいくつかの基本的なカテゴリがあります。組織異種移植片は正常な構造、悪性腫瘍、良性成長することができ、無傷の組織の小片で構成されています。 Szot ら （2007）は最近、膵島9の腎カプセル異種移植を照らしています。 Aamdal ら （1985）は、筋肉中の27のヒト癌細胞株の異種移植腎カプセルを記載munocompromisedマウスが10を開催しています。移植片はまた、単一の不死化細胞株（癌性または非腫瘍形成性）から構成することができる、または間葉（組換え細胞移植）から単離された細胞と組み合わせて不死化細胞株からなることができる。

私たちは、PRCAとBPHの開発の間質および上皮のそれぞれの役割を調べるために、細胞の組換え体の異種移植を支持する。クーニャら （1980）は、成人のマウス膀胱上皮が雄マウスホストの腎被膜下に胚性生殖洞間充織（UGM）と異種移植さと組み合わせた場合、組織が ​​前立腺腺房11に似た構造へと発展していることを初めて報告した。ノーマンら （1986）は、組織の組換え体に結合したとき、成体マウスの前立腺管上皮とUGMは、乳管の成長と形態形成12分枝を受けることを示した。ヘイワードら （1988）は、ヒト前立腺上皮胎児mは誘導性に応答することが示された同様の方法で13 esenchyme。前立腺における発癌のホルモンモデルは、UGMで不死化したヒト前立腺上皮細胞株BPH-1を組み合わせることにより、第Wang らによって報告された。14（2001）、我々の研究室15で広く使用されている。良性前立腺上皮がヒト5で高度なPRCAをモデル化し、転移性疾患への変換ので、このモデルでは、PRCAの進行を理解するために適しています。特定の成分が遺伝的に操作することができるので、組換え細胞移植は、間質 - 上皮相互作用を評価するためのアプローチとして特に有用である。

異種移植に適した他のサイトでは、皮内、皮下および同所場所16である。目的の組織および疾患プロセスに応じて、これらは適切な代替アプローチであってもよい。前立腺ホルモン発癌および良性の成長調節の研究のために、我々は腎被膜を選択そのより高いグラフトに異種移植するための部位は、速度、豊富な血液供給、一部位16内に閉じ込められた異種移植片のより多くを注入する能力を取る。また、前立腺の萎縮をもたらし宿主マウスのホルモン操作は、前立腺同所移植16の使用を制限する。

このプロトコルは、圧縮されたホルモン/薬剤ペレット製造、外科的移植、ならびにヒト前立腺細胞および組織移植片の腎カプセル異種移植の技術の概要を説明します。一緒に、これらの技術は、遺伝的に改変されたマウスは、PRCAおよび/または対照株よりBPH開始に対してより感受性であるかどうかを決定するための高感度アッセイを提供する。異種移植は、組織学的悪性度および分子の特徴、ならびに良性および悪性疾患の多種多様な新規治療戦略のためのアッセイを開発するために実験細胞の電位のインビボ評価のための強力な技術である。

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プロトコル

1。圧縮されたホルモン/薬剤ペレットの調製

  1. 白衣、手袋、マスク、保護メガネ、ボンネットを装着したままこ​​の手順では、化学物質安全フード内で行う必要があります。交差汚染を防止するためには、ペレット製造設備が十分に先立って70％エタノールで、ペレットの各タイプの製造後に洗浄されることが重要である。
  2. 分析スケールを使用して、紙の重さ、ホルモン/薬剤粉末の所望の量を測定する。約5％の追加材料はプレス時の損失を受け入れることをお勧めします。
  3. いくつかのホルモン/薬は、製造をペレット化する前に混合され、結合剤または充填剤を必要とする。例えば、25mgのペレットをもたらすコレステロール22.5mgのでホルモンを組み合わせ、17β-エストラジオール2.5mgのペレットを製造した。
  4. 慎重に押して、下のダイセット、所定の場所に転送して、ペレットを圧縮するためにしっかりと下のレバーを押してください。ある一定の表面を維持するために一貫性の圧力を使用して、体積比。
  5. 次のダイホルダーを逆にして、ペレットを解放し、再びダウンして、レバーを押します。
  6. 整合性のために、ペレットを検査し、最終質量が所望の範囲内にあるかどうかを決定。許容範囲（例えば、25 mgのペレットの許容範囲は23.8から26.3ミリグラム）で、最終的な質量の±5％の差である。
  7. ペレットは、手術前に作られ、（条件および貯蔵の長さは、ペレット製造に使用されるホルモンまた​​は薬物の安定性に依存して）記憶することができる。ホルモンペレットは、ペレット製造の代替として購入することができる。それらは配合​​され、配合されるので、ペレットを購入する非医薬品グレードの薬物の使用を回避する。

2。携帯組換え異種移植片の作製

  1. 4週間未満のため、収穫し、培養一次マウスの泌尿生殖器の間葉（UGM）間質細胞の計数のために収集される前に。
  2. 文化はいつも悩ますの前立腺上皮細胞株を不死化イオンとカウントのために収集します。この例では、懸濁液中の移植25万UGM間質細胞を移植100,000 BPH-1上皮細胞を混合することにより、細胞の組換え移植片を準備します。
  3. ペレット細胞を一緒に50μlに25μLの容量で移植片の望ましい数、それぞれを行うのに十分な中和タイプ1ラット尾コラーゲンで再懸濁。
  4. 15分間37℃で、組換えグラフトを設定し、グラフト前に48時間まで37℃で貯蔵のために増殖培地で覆う。

3。組織異種移植片の準備

  1. 組織の調達や、外科手術中に血液媒介病原体について普遍的予防策を維持する。施設内倫理委員会の承認とインフォームドコンセントの後、外科的切除から新鮮な前立腺組織を得る。 BPH成長の研究のために、組織は、前立腺や簡単な前立腺切除手順の経尿道的切除から収穫することができます。 PRCAまたは良性プロストの一次異種移植食べた組織は、根治的前立腺切除術の標本から得ることができる。
  2. ストアは氷上で等張緩衝細胞培地または生理食塩水で組織を採取した。組織及び貯蔵条件に応じて、検体の前組織移植片の調製に24時間まで保存することができる。一般的な方法は、1セクションをホルマリンで固定し、定期的に組織学的に処理して、3個に標本を分割するために1ピースが分子解析のために急速凍結し、さらなる組織の異種移植片（大きさ1〜3 mm）の分かれワンピースです。

4。ガラスピペットポリッシュ火の調製

  1. 起動には約60°の角度でブンゼンバーナーの炎に目の保護、実験室のコートと耐熱手袋、場所ガラスパスツールピペットの先端を身に着けている。
  2. ホットスポットを避けるために、ピペットに一定の、わずかな動きを保つ。
  3. 目標は、丸みを帯びた、閉じられた先端がわずかに湾曲した状態で終わり薄く先端と火ポリッシュを描く。

5。楽器の準備と手術室

  1. すべての楽器をオートクレーブ。手術前に、無菌領域を維持するために注意しながら、すべての機器を点検します。
  2. 吸収性パッド、解剖スコープ、麻酔ノーズコーン、手術器具や作業領域に向かう加熱ランプ無菌手術領域を設定します。マウス、予熱したビーズ滅菌器の間でツールを殺菌する。
  3. 組み立て、検査麻酔器、ガススカベンジャーの重量を量る。
  4. 全てのワックスが均一に溶融するまで、70〜80％の電力で（未溶融および溶融したワックスを結合するために、ワックスパッドを混練し、1分刻みで）最大5分間、マイクロ波、熱ワックスパッドの使用。タッチすることで、パッドが熱すぎると空の齧歯類回復ケージの下の場所ではありませんことを確認してください。
  5. 外科手術用マスク、ボンネット、手袋、ガウンなどの齧歯類の外科的処置のためのドン·個人用保護具。

6。外科的手技：腎被膜異種移植

  1. 研究動物に関わるすべての手順は、施設内動物のケアと使用委員会の承認を得て行われるべきである。麻酔の導入に先立ち、健康と幸福を確保するために、マウスを観察します。
  2. 百分の3から5にイソフルラン麻酔を誘導するためのチャンバー内にマウスを置きます。動物が移動を停止しており、呼吸数が減少した場合、腹臥位でノーズコーンに移し、1〜3％に麻酔を維持。
  3. 必要であれば、マウスの背中を剃るためにバリカンを使用しています。無胸腺ヌード（nu / nu）マウスを利用する場合、これは必要ありません。
  4. 麻酔の妥当性を評価するために拡張された後足のウェビングにしっかりと圧力をかける。マウスは圧力に応答した場合、より多くの時間を有効にするには、麻酔のために必要とされる。必要に応じて、適切な麻酔を達成するために、わずかに麻酔の流れを調整します。
  5. マウスが適切に麻酔をされたときに、続い外科ヨウ素（ベタジン）溶液を用いて手術部位を消毒70％アルコール。
  6. ドン·滅菌手袋やガウン、手術部位に無菌ドレープを適用します。歯ピンセットで背中の皮膚を持ち上げ、粗ハサミを使用して、2〜3センチ背側正中切開を行います。
  7. 鈍ハサミやプローブを使用して、（二国間の移植のための切開の両側または一方的な移植のための一方の側に）体壁から根底にある真皮を分離する。
  8. 横方向の位置にマウスの位置を変更し、筋肉の壁を貫通して腎臓のプロフィールを見ることによって、腎臓の位置を特定する。腹部上の親指と人差し指で穏やかな手動の圧力を適用すると、内部器官を可視化を助けることができる。
  9. 細かいアイリスはさみを使用しており、主要な血管や脊髄神経を避けるように注意しながら、脊椎に体壁と平行に1cmの切開を行います。そっと最初の切開でそれらを配置した後、ハ​​サミを広く開くことで（腎臓の長軸よりも少し長い）1.5〜2.0センチメートルにこの切開を広げる。
  10. 人差し指と親指を用いて、腎臓の両側の筋肉壁の外側に穏やかな圧力を適用することによって、腎臓を体外に。タックは、皮膚は、体壁に載るれる、体外腎臓の下方縁。腎臓を体外に出している間に、滅菌生理食塩水を適用することにより、腎被膜の水和を維持する。
  11. 細かい＃5鉗子を使用すると、静かに腎臓の実質から腎臓被膜を持ち上げ、細いメスで、カプセル内の2 -4 mmの切開を行います。切開部の大きさは、移植片のサイズによって決定されるが、カプセルの完全性を維持するために最小化されるべきである。
  12. 腎臓の表面に対して接線方向に被膜下に丸められ、閉鎖端で薄く、熱加工描画されているガラスパスツールピペットを操作します。優しく腎実質を損​​傷しないように細心の注意を使用して、移植片のための小さなカプセルポケットを開きます。
  13. 腎臓被膜の切り口は、細かい鉗子で持ち上げ、および移植片IであるSは、ファイアーポリッシュガラスピペットを用いて、被膜下のポケットの中に挿入。いくつかの移植片は腎臓被膜下に置き、均一に腎臓面に離間させることができる。
  14. グラフト化の過程で、カプセルは、脱水となり、場合には、滅菌生理食塩水を適用することによって湿らされるべきである。
  15. グラフト化が完了したら、静かに体腔内に腎臓を交換する筋肉壁の切開部の側部を持ち上げ。移植片はカプセルの下から滑らないことを確認します。
  16. 単一の縫合糸（4-0、FS-2ビクリル縫合糸）で筋肉壁を閉じます。外科的処置は、マウスを再配置することによって反対側の腎臓に繰り返すことができる。
  17. グラフト化が完了すると、マウスは同じ外科手順（プロトコルステップ7を参照）の間に皮下ペレット移植を受けることができる。
  18. 歯付き鉗子を使用して、皮膚切開の端を揃え、切開を閉じるために、2〜3手術創クリップを適用します。鎮痛を管理する（我々が使用する5月10日mg / kgのcarprof皮下注射を使用したエン）と回復ケージに側臥位にマウスを置きます。ランプや加熱パッドからの熱で体温の維持を確認してください。 15分以内に発生したマウスの完全な回復のために守ってください。
  19. マウスは出血および/またはその他の合併症、術後の痛みの兆候については、次の24時間、観察されるべきである。定期的に感染の兆候が外科的切開を点検。
  20. 7〜14日手術後手術創クリップ除去装置と創傷クリップを取り外します。

7。外科的手技：皮下ペレット移植

  1. 繰り返して外科手術を異種移植腎カプセルから6.1から6.5を繰り返します。
  2. 皮膚ピンセットで背中の皮膚を持ち上げ、粗ハサミを使用して、1〜2センチ背側正中切開を行います。
  3. 鈍ハサミやプローブを使用して、頭蓋方向に体壁から基礎となる真皮を分離する。
  4. 皮膚の鉗子を使用して、優しく皮膚切開の頭蓋側面を持ち上げ、ストレート、鋸歯状の鉗子で軽くホルモンペレットを保持し、ペレットを挿入し、鈍いプローブを用いて作成されたポケットに、首筋にリリースする。
  5. 繰り返して外科手術を異種移植腎カプセルから6.18から6.20を繰り返します。皮下ペレット注入を行う場合にのみ、外科的切開を閉じるために1手術創クリップを使用しています。

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結果

試験すべき仮説に応じて、組織または細胞の組換え体の腎カプセル異種移植は単独で、または皮下ホルモンペレット移植と組み合わせて行うことができる。皮下ホルモンペレット移植と腎被膜の異種移植実験を組み合わせた仮想的な実験の概略図を図1に示す。粉末及び/又は結晶性物質には、様々なペレットプレスで圧縮されたペレットの製造に使用することができる。 図2は、25ミリグラム、12ミリグラム、および6mgの圧縮されたホルモンのペレットを示す。

図3は、外科手術中に使用される火仕上げガラスピペットの例を示しています。ブンゼンバーナーの炎を介してガラスパスツールピペットの複数のパスは、腎被膜下に移植片のためのポケットを作成し、腎被膜下に移植片を操作するために使用されているファイアーポリッシュ、丸い先端になる。

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ディスカッション

この紙と概説したプロトコルは、ここに圧縮され、ホルモンおよび/または薬物のペレットを製造し、マウスの皮下ペレット移植のための外科的処置について説明します。対処すべき研究課題に応じて、この技術は、単独で、又は前立腺広く研究17-19で使用される技術である前立腺細胞組換え移植片または前立腺組織異種移植片の腎カプセル異種移植と組み合わせて行うことができる。まとめると、これらの技術は、ヒトおよびマウスの前立腺に良性の成長ホルモン発癌および制御を研究するための強力なアプローチを提供します。

ペレット製造が容易に再現、実施が簡単であり、かつ限定された装置を必要とする。それは、種々のホルモン及び薬物製剤に適用することができる。これは、化学物質安全フード内でこの手法を実行するために重要であり、適切な保護具を着用してください。前立腺発癌aを評価する実験のためにND我々は25mgのTおよび2.5 mgのE 2 5,7,15を使用してマウス膀胱出口閉塞の誘導。これらは生体応答に希望を生成するので、彼らが関心6<...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

著者らは、過去と現在Rickeラボのすべてのメンバーに感謝したいと思います。私たちは、プロトコルに関する有益なコメントを、カルバン·パッテン、ジュニア、DVMとブリジット·ラーベ、DVMに感謝します。 R01DK093690、R01CA123199、RC2ESO18764：我々は、これらの研究のための彼らの財政支援のためのNIDDK、NCIとNIEHSを承認したいと思います。 TMNは、NIH T32 GM07356によって資金を供給ロチェスター大学の医学者養成プログラムでの受講者で、ルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞F30DK093173下NIHはまた、このプロジェクトをサポートしています。 CDVは、ウィスコンシン大学マディソン校でT32ES007015でサポートされていT32CA157322とABTでサポートされています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも一般的な医学やNIHの国立研究所の公式見解を示すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ペレットプレスPARR Industries28153mm パンチ &ダイセット
分析天びんOhaus1918302Voyager or other
Bunsen burnerFisher Scientific03-962Q
解剖顕微鏡LeicaL2
Deltaphase Pad Kit (reheatable wax)Braintree Scientific39DP電気加熱パッドの代替品
ホットビーズ滅菌器F.S.T.18000-45
イソフルラン気化器Supera Anesthesia InnovVAP3000
Induction ChamberSupera Anesthesia InnovRES644
F/AIR CanisterSupera Anesthesia Innov80120
4 ポート マニホールドSupera Anesthesia InnovRES536
Rebreathing CircuitsSupera Anesthesia InnovCIR529
インレット/アウトレットフィッティングスーパー麻酔 InnovVAP203/4
圧力規制/ゲージスーパー麻酔 InnovOXY508
酸素流量計スーパーA麻酔 InnovOXY660
21mm クリアチューブスーパーA麻酔 Innov301-150
スモールマウス ノーズコーンスーパーA麻酔 InnovACC526
滅菌手術用ガウン中西部獣医供給350.79866.2
サージカルマスク中西部獣医供給350.50111.22層w /イヤーループ滅菌
ガーゼ中西部獣医供給001.14100.22 x 2インチ
滅菌手袋キンバリークラーク55092
ファン中西部獣医供給001.27100.2
コットンチップアプリケーター中西部獣医用品001.06220.2
外科用スクラブウォッシュ中西部獣医用品733.80010.3
滅菌フィールド (窓付き)General Econopak, Inc88VCSTF
REAGENTS
CholesterolSigma-AldrichC-3292
Testosterone ProprionateSigma-AldrichT-1875
17β-エストラジオールSigma-AldrichE-2758
イソフルラン中西部獣医供給193.33161.3
Carprofen中西部獣医供給193.70200.3注射剤 (リマジル)
ベタジンウェブスター獣医07-836-3379
滅菌生理食塩水中西部獣医供給193.74504.3NaCl 0.9%, Injectable
SURGICAL INSTRUMENTS
Straight Sharp/Blunt ScissorsFine Scientific Tools (F.S.T.)14054-13
グレーフ鉗子(鋸歯状、歯状、湾曲型)F.S.T.11055-10
ファインアイリスはさみF.S.T.14090-09
グレーフメスF.S.T.10071-12
デュモン #5 鉗子F.S.T.11251-20
ガラスパスツールピペットフィッシャーサイエンティフィックS670505 "長さ
グレーフ鉗子(鋸歯状、湾曲)FST11052-10
グレーフ鉗子(鋸歯状、ストレート)F.S.T.11050-10
Vicryl 縫合糸中西部獣医供給295-92100.24-0、FS-2、吸収性
ニードルホルダー、シザーアクション付き F.S.T.
傷口クリップBraintree ScientificACS CS7mmまたは9mmクリップを使用できます
反射創傷クリッパーF.S.T.12031-09傷付きクリップサイズ
クリップリムーバーF.S.T.12033-00ユニバーサル
滅菌コンテナFST20810-01任意のオートクレーブ可能な容器は
、注射器の針BD148292C1cc、25Gx1
耳タグアプリケーターナショナルバンドタグ株式会社を行います。1005s1ノッチングの代替品
小動物の耳タグバンドタグ株式会社1005年1
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参考文献

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