同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する

Summary

二色蛍光顕微鏡用のデュアルカメラ発光分割システムは、優れた光学的および時間的解像度、パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを含む特定の生細胞アッセイの要件にリアルタイム画像シーケンスを生成する。ソフトウェアは同時に取得放出チャネルからの画像を合成するために使用された場合、疑似色画像シーケンスが生成される。

Abstract

細胞膜に特異的な分子を検出するための多色免疫蛍光顕微鏡は、動的流動条件下での細胞接着を支配するメカニズムを調べるために平行プレートフローチャンバーアッセイと結合することができる。例えば、複数のフルオロフォアで標識された癌細胞は、癌転移のメカニズムをモデル化するために潜在的に反応性の基板上に灌流することができる。しかしながら、リアルタイムの生細胞分析のための画像取得におけるマルチチャネル単一カメラシステムとカラーカメラの欠点を呈する。これらの制限を克服するために、我々は同時に、フローチャンバー内の蛍光標識された細胞のリアルタイム画像シーケンスをキャプチャするために、デュアルカメラ発光分割システムを使用した。デュアルカメラ発光分割システムフィルタ定義された波長は、それによって、同時に2つの空間的に同一であるが、フルオロフォア固有の画像を取り込む2のモノクロCCDカメラ、にわたる。続いて、1チャンネルの画像を単一に統合されpsuedocoloredリアルタイムは、関心領域を横切って急速に移動する細胞上の複数の標的分子を明らかにすることができる配列をマージ。

Introduction

例えば、免疫染色、細胞表面上の分子の分析のための方法、化学的標的分子の検出を可能にする、フルオロフォアにコンジュゲートされたプローブを用いる。生細胞イメージングおよび流体力学的フローベースの細胞接着アッセイは、典型的には、細胞および/ ​​または分子レベル^1、2で生理学的プロセスを捕捉するように設計されたモノクロCCDカメラで記録される。これらのカメラは、高速フレームレート（1秒あたりのより大きい30フレーム）を提供し、（原因速いフレームレートと短い露光時間に）非常に優れた時間分解能を提供する、非常に敏感である。しかし、モノクロカメラは、画像のみを収集するために（シングル蛍光体を検出する）、単一の放出チャネルをキャプチャすることができます。単一のカメラ発光分割システムは、複数の放射チャネルを捕捉するために組み込まれたが、多くの場合、視野を低減し、全チャンネルを画像化するために同じ露光時間を必要とすることができる。 multipで標識した細胞から完全なカラースペクトラムをキャプチャするにはルフルオロフォア、カラーカメラは、代替として使用することができる。しかしながら、カラーカメラは、一般に、特定の用途において生細胞イメージングのために所望の時間分解能を提供することができない。別の撮像装置は、高時間分解能を維持しながら、複数の波長で画像生細胞に有利である用途のために必要とされる。プライミング実験のアプリケーションは、細胞が潜在的に反応性の基板^1,3の上に生理学的に関連する条件下で灌流された平行板フローチャンバー接着アッセイである。このような接着分子または表面に吸着細胞外マトリックスタンパク^4,5を発現する細胞単層のような特定の細胞表面分子を発現する細胞をフロー内の基板上に付着し、ロールよい。ローリング細胞は、第二の画分に回転および並進運動を受けることができる。このような細胞表面分子のクラスターとしてローリングおよび接着細胞上の分子の機能も、ポテンショを有する細胞表面上で活性の再編成を受けるらこれにより、撮像システムは^、6,7の圧延セルのステップバイステップの進行を示す画像シーケンスを生成するために、例外的な時間分解能（秒以上と露光時間「ゼロに近い」毎秒30フレーム）を提供しなければならない。デュアルカメラ発光分割システムは、複数のフルオロフォアで標識された細胞を画像化するためのこれらの要求を満たすことができる。

デュアルカメラ発光分割システムは、全視野を維持しながら、同時に2つの空間的に同一であるが、フルオロフォア固有の画像を捕捉するつの類似のカメラに蛍光チャネルを分割し、フィルタ。この技術は、各チャネルの実時間で撮像した画像の直接比較を可能にし、ユーザが迅速に異なる撮像機能を備えたカメラモデルの間で切り替えることができる。この特徴は、より良いシステムをキャプチャすることを可能にする1つのカメラで画像キャプチャ設定を調整する場合に有用である異なる強度、寿命、および吸光係数⁸と蛍光団。イメージングソフトウェアと相まって、二重カメラ放出分割システムは、複数の波長の生細胞イメージングアッセイのリアルタイム記録を可能にし、細胞の挙動を研究するために蛍光を使用するin vitroアッセイを高めることができる。

Protocol

1。ソフトウェアのインストール

1. 購入StreamPix SimulPixモジュールまたはモノクロCCDカメラで撮影した画像を収集し、組み合わせることのできる他のイメージングソフトウェアを使用して5マルチカメラソフトウェア。
2. StreamPix 5の最小要件は次のとおりです。2ギガバイト以上のRAMと2.4 GHz以上でのCore 2 Duoを搭載したパソコン。サポートIEEEデジタルまたはアナログのカメラと互換性のあるフレームグラバー。 Windowsは、32ビットまたは64ビットをXP/7/Vista。解像度102​​4×768以上をサポートするモニタ。優れた2D性能を備えたグラフィックアダプタ（OCUは16倍以上が推奨されて発現する）と7,200 RPMのRAID-0構成で記録するためのハードディスクドライブ。

2。 2色同時リアルタイムイメージングが可能なデュアルカメラシステムの設置

1. MICRのビデオポートにDC2 Cマウントアダプターをスライドさせて顕微鏡に、DC2フォトメトリック放射スプリッタ、または同様のデュアルカメラ発光分割装置を接続デバイス上の二色性の筐体がアクセス可能であることなどOSCOPE。
2. 女性Cマウント1に2のモノクロCCDカメラを挿入し、女性2 Cマウント。同一のカメラが好ましい。同様のカメラを用いることができるが、互換性は、CCDイメージセンサ、最も重要なのは、内部ハードウェアに依存する。
3. 両方のカメラからの画像を表示するには、画像処理ソフトウェアを使用してください。次の手順（2.3.1 - 2.3.4）SimulPixモジュールとStreamPix 5に適用され、他のマルチカメラ画像処理ソフトウェアに適応しなければならない。
   1. オープンStreamPix 5とタスクリボンの「ワークスペース」を選択します。
   2. 開いた「ワークスペース·マネージャ」画面の右端に位置しており、「新しいワークスペース」を選択します。
   3. カメラに名前を付けた後、ソフトウェアがあらかじめ入力リストからグラバーを選択するように指示に従います。カメラモデルと一致グラバーを選択し、第2のカメラワークスペースの繰り返し。マージされたワークスペースには、もう一度繰り返しますが、エラーM "すべてのカメラが使用されている」essageが表示されます。このメッセージは正常です。
   4. マージされたワークスペースがロードされると、視聴画面の右側に配置され、ドッキングパネルでマージされたワークスペースにワークスペース1とワークスペース2からカメラを割り当てます。
4. デュアルカメラの排出分割システムでカメラの位置を合わせます。
   1. 明視野またはPlanApo対物レンズ40倍（またはそれ以上）を使用して、メーカーが提供するキャリブレーショングリッド位相コントラストにカメラの位置を合わせます。
   2. 顕微鏡ステージ上で、製造業者によって提供された金属でコーティングされたキャリブレーショングリッドを配置し、顕微鏡の接眼レンズに光を送信し、顕微鏡ステージ上のグリッドを二乗。
   3. 焦点にグリッドを持参してください。
   4. 変位が、カメラ1（バイパスカメラ）を整列させるために、ダイクロイックハウジングを削除しないでください。ビニングなしで自動スケーリングせずにグリッドを表示します。 Cマウントポート1に焦点調整ダイヤルを使用して画像の焦点を合わせる。
   5. デュアルchanneにダイクロ住宅をプッシュ完全リットル取得装置、画像が両方のカメラにダイクロによって分割されるようになっている。
   6. 3 64分の5」のネジを設定し、グリッドの向きが両方のイメージで同じになるまで、女性のCマウント2に第2のカメラを回転させます。Cマウントポート2上で焦点調整ダイヤルで、カメラからの画像を持って緩め焦点に2。
   7. イメージングソフトウェアのマージされたワークスペースに合成された画像を使用して配置を完成させる。これは1キャリブレーショングリッドの二つの画像をリアルタイムで疑似カラーオーバーレイを見ることができます。 DC2の右側にのみ、R / Lのノブを使用して合成された画像位置を調整します。画像の左/右の縦の境界を正確に整列されるまで、このノブを調整します。
   8. 水平格子棒が適切に整列されるまで、第2の画像のアップ/ダウンの配置を調整するために、U / Dノブを使用してください。
   9. 上/下の位置合わせの際に若干のカメラの回転は3 64分の5 "インチSCREを緩めて、正しいこの問題が発生した場合カメラ2のためのWSと表示された画像が適切に整列されるまで回転させます。

3。平行板フローチャンバー接着アッセイのためのがん細胞の調製

1. 最小必須培地（MEM）中で培養BT-20乳癌細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン、37℃で、およびCO _2は 、先^2に記載5.0％で媒体を完了するために補充した。
2. 希薄トリプシン処理で収穫癌細胞および血球計算板を用いて細胞を数える。
3. 洗浄とカルシウムとマグネシウム（DPBS +）とのDPBS中ウシ血清（BSA）、0.1％のアルブミン中の10 ⁷細胞/ mlで細胞を懸濁。
4. 0.1％BSA、DPBS +での所定の最適濃度に、一次抗体、精製マウス抗ヒトCD24および精製ラットHECA-452（抗シアロフコシル化抗原）希薄。 30分^9、10のために細胞をインキュベートします。
5. 1,200 rpmで遠心分離細胞は、細胞ペレットを得た。 ASPI一次抗体を評価し、0.1％BSAをDBPS +で細胞を2回洗浄します。
6. 0.1％BSA DPBS +で所定の最適濃度は、二次抗体、ヤギ抗マウスIgGのAlexaFluor 568（発光最大値、603ナノメートル）、およびヤギ抗ラットIgM抗体のAlexaFluor 488（発光最大519 nm）を、希釈する。 30分間、細胞をインキュベートします。
7. 細胞を2回洗浄し、0.1％BSA、DPBS +で10 ⁶細胞/ mlで、0.1％のBSA、DPBS +で一時停止。

4。平行板フローチャンバー接着アッセイのための反応基質の調製

1. 35mm組織培養皿内に収まるパラレルプレートフローチャンバーの入口および出口ポートにチューブを2つの別々の長さを接続する。 Oneチューブを所定の流量で流体を撤退するシリンジポンプに0.1％BSA DPBS +およびその他の中に懸濁標識細胞のリザーバに接続します。
2. フローチャンバー¹に真空ラインを接続します。
3. 35ミリメートルの組織培養ディ経由でフローチャンバーを配置するshのE-セレクチン（CHO-E）を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞の単層を含有する。 CHO-E細胞を、37℃でMEM完全培地中で増殖させ、5.0％CO ^₂れた。
4. 適切な真空シール^1を確保するために、フローチャンバーおよび/ ​​またはフローチャンバーガスケットを調整します。
5. 適切なシール及び気泡の発生¹の視覚的な証拠なしのフローチャンバアセンブリを監視する、リザーバから流体を引き出す。
6. 顕微鏡（ライカDMI 6000B）のフローチャンバアセンブリを配置する^1。

5。 2色画像を取得

1. 光ガイド内に高強度の光と結合する、それを生成するために電力ライカEL-6000小型の光源、又は同様の装置。所望の色/輝度の蛍光プローブを励起するため、フィルターキューブコンビネーションフィルターキューブ、 すなわち G / R（緑/赤）を介して、この光を通過させるように倒立顕微鏡を使用してください。
2. ダイクロハウジング（押し下げ）が正しい動作位置にあることを確認し、バイパス·モードではありません。
3. 蛍光モードで顕微鏡を操作して、適切な蛍光フィルターキューブ（緑/赤）を選択します。
4. カメラ1の露光時間、ゲイン決定（赤、620±60 nm）であり、カメラ2（緑; 535±40nmで）。
   1. 両方の赤と緑の発光チャンネルの画像を取得するために、ダイクロイックを押し下げる。赤色のみフルオロフォアで標識された細胞を用いたフローチャンバーアッセイを使用して、イメージングソフトウェアの「ライブ設定」にカメラ1の露光時間を調整することにより、赤のチャネル画像を得る。
   2. カメラ1の露光時間にカメラ2の露光時間と一致する。画像は緑チャネルにおいて観察された場合、ブリー​​ドスルーアーチファクトが存在し、両方のカメラの露光時間を短縮する必要がある。
   3. ブリードスルーアーチファクトが緑色チャネルに見えなくなるまで、露光時間を短縮せず、カメラ1とカメラ2の露光時間と同等に保つ。イメージを改善するために、カメラ1の利得を調整visibilit必要に応じて、赤チャンネルのY。
   4. 唯一の緑の蛍光体で標識した細胞で5.4.3が、カメラ1が収集し、赤のチャンネルでのブリードスルーのアーティファクトなしに緑のチャンネルで画像セルにカメラ2で露光時間を定義する - を繰り返して、5.4.1を繰り返します。
   5. ブリードスルー場合アーチファクトRetitrate抗体が^11を除去することができない、又は、カメラ1とカメラ2の露光時間は、マージされた画像が時間的にずれてもよいように、実質的に異なっている場合。
5. 同時にフローチャンバー実験における2モノクロCCDカメラから撮影した画像を表示するには、画像処理ソフトウェアを使用してください。
6. Streampix 5のSimulPixモジュールまたは代替ソフトウェアパッケージを使用して両方のカメラから収集された画像を合成。
7. 必要に応じて、空間的にマージされた画像を位置合わせするためにSimulPixにおけるデジタル補正の調整や別のソフトウェアを使用してください。画像は、水平、垂直のためSimulPixモジュールを補正することができる、および回転の調整。

Results

パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイは、同時に2つの発光チャネル（ 図1）内のリアルタイム画像シーケンスをキャプチャし、デュアルカメラ放出分割システムを実証するために使用した。デュアルカメラの排出分割システムは、蛍光抗ヒトCD24およびHECA-452（シアロフコシル化抗原を検出する）モノクローナル抗体および適切な二次抗体（ 図2）で標識したBT-20細胞を検出した。赤信号（CD24）まだ検出できない緑信号（HECA-452）を表示し、いくつかのローリング細胞は、他の人は、緑信号と検出できない赤の信号を表示し、さらに他の細胞（ 図2）赤と緑の両方の信号を示した。マージされた放出チャネルは、BT-20細胞の表面上でローリングし、CHO-E単層（ 図3及び図4）に付着した上でCD24とシアロフコシル化分子の分布と共局在を明らかにした。デュアルカメラの排出SPLI準備システムは、もともとにより、カメラの位置合わせに若干の画像の位置合わせの誤差を持っていましたが、このエ...

Discussion

デュアルカメラ発光分割システムは、細胞または分子の動きが速い用途で高品質の画像をキャプチャするために必要な空間的、時間的、および光学的分解能を有する。代表的な結果を生成する際に、ソフトウェアの設定やカメラ設定を含むデュアルカメラ発光分割システム、のパラメータは、ローリングおよび接着細胞は、空間的および時間的に整列されたマージされた画像シーケンスを得るために最適化した。ミスアライメントが適切に両方の緑と赤のチャネルで展開することが観察さ例えば 、単一のセルがマージされたワークスペースで2ローリングのセルとして表示されることがあり、調査中の物理現象を伝えていないイメージになることができるように、この最適化ステップは、非常に重要です。プロトコールのステップ2.4​​で説明したようにカメラが物理的に並んでいるとき、空間的な位置合わせは、デュアルカメラエミッション分割システムのセットアップで達成されるべきである。画像CAPTの空間配置にデジタル修正カメラによるuredは、イメージングソフトウェア（工程5.7および図5）におけるデジタルアライメント設定を介して（複数の）水平、垂直、または回転オフセ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料
BT-20細胞	ATCC	HTB-19
CHO-E細胞	R.サックスタイン博士(ブリガム・アンド・ウィメンズ)からの贈り物ハーバード大学医学部病院)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
ペニシリン-ストレプトマイシン	Thermo Scientific	SV30010
0.25% トリプシン / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 モノクローナル抗体	BD Biosciences	555946
抗ヒト CD24 モノクローナル抗体	BD Biosciences	555426
抗ラット IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
抗マウス IgGAlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
[header]
Equipment
EXi 青色蛍光顕微鏡 デジタルCCDカメラ	Qイメージング	EXI-BLU-R-F-M-14-C
レティガ EXi FAST 1394 デジタルCCDカメラ	Qイメージング	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 エミッションスプリッター	フォトメトリクス	DC2
倒立型蛍光顕微鏡	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix