我々は、生きた酵母細胞における細胞内解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを監視するために、GFPをもとにしている2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用が記載されている。
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方法論記事
リビング酵母細胞におけるミトコンドリア酸化還元状態とATPを測定レシオメトリックバイオセンサー
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
ミトコンドリアはエネルギー代謝や細胞の寿命とプログラム細胞死を制御するカルシウムの恒常性から、多くの細胞プロセスで役割を持っている。これらのプロセスには影響を与え、ミトコンドリアでの酸化還元状態とATP産生の影響を受けている。ここでは、酵母細胞を生きた細胞内での解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを検出できる2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用を記載している。ミトコンドリアの酸化還元状態は、ミトコンドリアマトリックスを標的とレドックス感受性緑色蛍光タンパク質（roGFP）を用いて測定される。水戸roGFPは、順番に、タンパク質の励起スペクトルを変えるリバーシブルと環境依存の酸化還元を受ける位置が147とGFPの204でシステインを含んでいます。 MitGO-ATeam F O F 1-ATPシンターゼのεサブユニットとの間に挟まれたフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）プローブはドナー及びアクセプター蛍光のFRETされているrescentタンパク質。もたらすタンパク質における立体構造変化εサブユニット結果にATPの結合は近接ドナーとアクセプターとのFRETドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動を可能にする。
概要
ミトコンドリアは、アミノ酸、脂肪酸、ヘム鉄硫黄クラスターおよびピリミジンのATP産生合成に必須の細胞小器官である。ミトコンドリアはまた、カルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている、とアポトーシスの制御インチパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、およびハンチントン病を含む老化や加齢に伴う疾患にミトコンドリア1増やす証拠リンクしています。2個人がで彼らの全体の生活をしながら神経変性疾患に関連付けられているミトコンドリアタンパク質の変異は、病気の症状だけでその後の人生で起こる。これは、その変化が出現する疾患は病理許す年齢とともにミトコンドリアで発生することを示します。確かに、ミトコンドリアの適性が全体細胞の健康と寿命酵母および哺乳類細胞と相関している。ここ3,4、我々はmitocの2つの重要な機能を評価するために、遺伝的にコード化され、レシオメトリック蛍光バイオセンサーを使用する方法について説明します酵母細胞を生体内でhondria：レドックス状態とATPレベル。
有酸素エネルギー動員におけるミトコンドリア機能が十分に確立されている。ミトコンドリアの酸化還元状態は、NAD + / NADH、FAD / FADH 2、NADP + / NADPH、グルタチオン/グルタチオンジスルフィド（GSH / GSSG）と活性酸素種（ROS）....
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プロトコル
1。バイオセンサーと酵母細胞の形質転換
- 酢酸リチウム法27を用いたプラスミドベアリング水戸roGFPまたはmitGO-ATeam2で希望の酵母株を変換します。
- プラスミド媒介バイオセンサーとの変換を確認するために、プラスミドの損失を防ぐために、選択し、適切な選択的な合成完全培地（水戸roGFP用SC-浦、またはmitGo-ATeam2用SC-レイ）で形質転換体を維持します。蛍光プローブは、ここで説明したものとは異なるプラスミドにサブクローニングされている場合は、適切な選択培地を使用する。彼らは蛍光バイオセンサーを表現していることを確認し、正常なミトコンドリアの形態を示すように、蛍光顕微鏡で形質転換体を可視化する。
2。イメージングのための細胞および準備の成長
細胞機能および薬物治療に対する応答は、細胞密度および代謝活性に大きく依存している。最良の結果が得られた場合細胞（ - 1×10 7細胞/ ml半ば対数期、〜0.5）活発に分裂している。一貫性のある密度の中間対数期文化を生成するための最も信頼性の高い方法は、定常期前培養から接種することです。
- 定常期前培養の準備：プレートから形質転換細胞の単一コロニーを選択し、選択的な液体培地（50ミリリットルコニカルボトムチューブ5 ml）を接種。 600nmの（OD <....
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結果
水戸roGFPとミトコンドリアの酸化還元状態を測定
ここでは、ミト-roGFP1は、酵母細胞増殖またはミトコンドリアの形態に影響を与えることなく、生きた酵母細胞を低減するために完全に酸化からミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出するためにダイナミックレンジを有することを示す。まず、ミトコンドリアを標的とGFPとroGFP1を発現する細胞は、通常料金（ 図1A）で成長を見つける。最大成長速度は、対数増殖期と最大成長速度に達するまでの時間の間に成長曲線の最大傾斜によって測定される、ミト-GFPおよびミト-roGFP1を発現する細胞で類似している。さらに、水戸roGFP1展示野生型形態（ 図1B）を発現する酵母におけるミトコンドリア。具体的には、管状のですが、母の芽軸に沿って整列し、そして母と娘細胞の先端に蓄積されます。ミトコンドリアの機能不全は、しばしば断片化を誘発するので、通常の形態では、水戸roGFP1が行うという考えをサポートしていますしない摂動ミトコンドリア機能。
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ディスカッション
ここでは、酵母細胞を生体内でミトコンドリアの酸化還元状態とATPのレベルを評価するためのバイオセンサーとして水戸roGFP1とmitGO-ATeam2を使用する方法について説明します。私たちは、定量的なミトコンドリアの形態や分布や細胞の成長率に明らかな影響を与えることなく、ミトコンドリアを標的にプラスミド媒介水戸roGFP1またはmitGO-ATeam結果の発現を見つける。3水戸roGFP1は高度からミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出することができます高度に低下した状態に酸化する。同様に、mitGO-ATeamは、呼吸阻害剤で処理呼吸ドリブン成長および酵母を受ける酵母で発生するミトコンドリアATPレベルの変化を測定することができる。両方のバイオセンサーは、細胞内の分解能を提供しますので、また、彼らは、酸化還元状態や個々の細胞内のミトコンドリアのATPレベルの不均一性を検出することができます。両方のバイオセンサーは、レシオメトリックプローブであるので、最後に、それらは試料の厚さや病気中の濃度や変動性の変化によって影響を受けることはありませんumination。これらのプローブは、生きている細胞では細胞内の解像度.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されていない。
謝辞
この作品はHHMI 56006760から（GM45735、JDV、DMAWに国立衛生研究所（NIH）（2 TL1 RR 24158から6）、およびエリソン医療財団（AG-SS-2465）およびNIHからの賞によってサポートされていましたLPへGM45735S1とGM096445）。 GM45735S1は、2009年のアメリカの回復と再投資法の下でNIHから発行されました。これらの研究に用いられる顕微鏡はNIH / NCIの助成金（5 P30 CA13696）を通して部分的にサポートされていた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 1397-94-0 | エタノールに溶解して2 mg/mLのストック溶液に溶解 |
| SGlyc(合成グリセロール系)酵母増殖培地 ※SGlyc-Ura は省略 ※SGlyc-Leu | H2Oに溶解 NaHCO3でpHを5.5に調整します。オートクレーブ 成分: 0.67% アミノ酸を含まない酵母窒素塩基 3% グリセロール 0.05% グルコース 2mg/ml アデニン 2mg/ml ウラシル* 1mg/ml L-アルギニン 1mg/ml L-ヒスチジン 1mg/ml L-ロイシン** 3mg/mlL-リジン 2 mg/ml L-メチオニン 4 mg/ml L-フェニルアラニン 2 mg/ml L-トリプトファン 3 mg/ml L-チロシン | ||
| SC (合成完全グルコースベース) 酵母増殖培地 *SGlyc-Ura は省略 **SGlyc-Leu | H2O に溶解します。NaHCO3で pH を 5.5 に調整します。オートクレーブ。成分: 0.67% 酵母窒素塩基 (アミノ酸なし) 3% グルコース 2 mg/ml アデニン 2 mg/ml ウラシル* 1 mg/ml L-アルギニン 1 mg/ml L-ヒスチジン 1 mg/ml L-ロイシン** 3 mg/ml L-リジン 2 mg/ml L-メチオニン 4mg/ml L-フェニルアラニン 2 mg/ml L-トリプトファン 3 mg/ml L-チロシン | ||
| バラップ | 材料を 1:1:1 (w:w:w) の比率で組み合わせます。70°Cに沈めて溶かします。C H2Oバス。ガラスのシャーレにアリコートします。室温で保存してください。原材料: ワセリンワセリン、ハードパラフィン、ラノリン | ||
| Equipment and Software | |||
| >事前にクリーニングされたゴールドシールライトオンマイクロスライドトーマス | サイエンティフィック(ニュージャージー州スウェーデン) | 3050 | サイズ:25 x 75 mm;厚さ:0.93〜1.05 mm |
| カバースリップ、No.1.5、18x18 mm | ツァイス(ソーンウッド、NY) | 474030-9000-000これらは | 厚さの変動が少ない(170±5 μm) 標準的なカバースリップよりも、球面収差を低減し、3Dイメージング性能を向上させる |
| フィッシャーブランド顕微鏡カバーガラス、No.1.5 | フィッシャーサイエンティフィック(ペンシルベニア州ピッツバーグ) | 12-545E | サイズ:22 x 22 mm、厚さ1.5号(170 μm) |
| スペクトル検出器と100倍/1.49 NA Apo-TIRF対物レンズを備えたA1レーザー走査型共焦点顕微鏡 | ニコン(ニューヨーク州メルビル) | ||
| 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar対物レンズ(Zeiss)とOrca ER冷却CCDカメラ(浜松)を装備し、Axiovisionソフトウェア | Zeiss(ニューヨーク州ソーンウッド)で制御するAxioObserver.Z1顕微鏡。浜松(日本・浜松市) | ||
| Volocity 3D画像解析ソフトウェア | Perkin Elmer(マサチューセッツ州ウォルサム) | デコンボリューション用修復モジュール。比計算および測定用定量モジュール | |
| ImageJソフトウェア 国立 | 衛生研究所(メリーランド州ベセスダ) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
参考文献
- Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6),....
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再版と許可
