フォワード遺伝的アプローチで<em&gt;クラミジアトラコマチス</em

サマリー

我々は、化学変異誘発および全ゲノムシーケンシングに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。さらに、感染細胞内のDNA交換のためのシステムは、遺伝子マッピングのために使用することができることについて説明する。この方法は、変換システムおよび分子遺伝学的ツールを欠く微生物システムに広く適用することができる。

要約

クラミジアトラコマチス 、性病と眼感染症の病原体は、組換えDNAで不完全に起因する実験的な変革へのその扱いにくさに特徴のままです。我々はCで遺伝子解析を実行するためのアプローチを開発分子遺伝学的ツールの不足にもかかわらず、 トラコマティス 。我々の方法は、関係する：i）急速に明確な表現型と遺伝的に定義された変異体の包括的なライブラリを生成するために、化学的突然変異誘発し、ii）の全ゲノムシーケンシング（WGS）は、基礎となる遺伝的病変をマッピングすると、変異遺伝子（群）との間の関連を見つけると。共通の表現型; iii）の変異体および野生型細菌と哺乳動物細胞の同時感染を介した組換え株の生成。そこで、遺伝子型と表現型の間の因果関係を確立することができました。相関遺伝子型 - 表現型の関連百鬼夜行を確立するために、化学的に誘発される遺伝子変異とWGSのカップリングldは遺伝子解析に現在難病医学的に、環境に重要な微生物の大規模なリストに広く適用される。

概要

関連付けられていると、米国では年間推定280万生殖路感染症（疾病管理センター）の後遺症などの骨盤内炎症性疾患、子宮外妊娠、および不妊症（1）などのための絶対細胞内細菌のクラミジアトラコマチスアカウント 。 クラミジア属はユニークを持っている感染が、非複製素体（EB）と非感染性はなく複製網状体（RB）：2つの形式で構成される二相性発達サイクルで生理。感染endoctyotosis（2）続いて上皮細胞へのEBのアタッチメントから始まります。膜結合液胞は、インクルージョンと呼ばれる中では、EBをその後二分裂によって複製RB形、に分化する。半ばサイクルで、RBの遷移当時感染の新しいラウンドを開始するために、細胞外空間に放出されているEBを、ときに宿主細胞溶解する（3）。

クラミジアですこのような細菌の遺伝学のほとんどの研究の中心となっている標的遺伝子の交換、トランスポゾン、および形質導入ファージ、などの標準的な分子遺伝学的ツールを使用してルーチン操作に耐火、それは個々のクラミジア遺伝子が自然免疫の回避に寄与する程度は不明である、栄養買収、発達トランジション、または真核生物宿主（4）内の病原体の生存のために重要な他のプロセス。したがって、この病原体はその臨床的重要性にもかかわらず、不十分な特徴のままです。

クラミジア属のゲノム。次世代シーケンシング技術を用いて配列決定、複数の種と生物型に（5）（〜1 MB）比較的小さい。 WGSによって比較ゲノム解析クラミジア種の進化にユニークな洞察を提供しており、ヒトの（6-8）へとある程度彼らの適応は病原因子のポテンシャル関数（9、10）のようないくつかの情報を提供してきました。 T臨床分離株で表示される、彼の遺伝的多様性は、このような遺伝子の変異を容易に対して選択されていたので、おそらく、体系的にほとんどの病原因子の機能をマッピングするために必要な解像度を提供していません。自然淘汰から交絡影響を与えることなく、病原性のメジャー欠陥その定義されたアッセイと相まって変異誘発の遺伝子変化は、調査することができる突然変異のスペクトルを拡張することができます。化学変異原は、特に、それらがnull、条件、hypomorphic（機能低下）を生成することができますとして有用、とhypermorphic（関数のゲイン）対立遺伝子である。堅牢な次世代のゲノム配列決定技術の到来により、そのような変異を容易に識別してマッピングすることができる。このように、強いアソシエーションが前方に遺伝的アプローチの適用を可能にする、遺伝子または遺伝子経路の変異および共通の表現型の間で行うことができる。

臨床株のゲノム配列は、モザイクBを明らかにしたetweenの血清型と頻繁な組み換えの軌跡（11）。組換えの経験的証拠は、2つの異なる抗生物質耐性株の両方株（12,13）からの遺伝的寄与を有することが判明した二重耐性子孫組換えの選択の同時感染により実証した。したがって、同時感染設定で野生型と変異株の間で遺伝子交換は、化学的に誘発される突然変異の偏析が観察された表現型につながる影響を受けた遺伝子を特定することができます。

ここでは、化学的突然変異誘発、WGS、および感染細胞内のDNA交換（14）（ 図1）のためのシステムに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。

プロトコル

1。化学変異

注意：我々は、複製RBフォームはEBフォームより化学的突然変異誘発をより従順であることがわかった。半ばサイクル（HPI 20から18の間）で、RBは、事前RB-EB遷移の最大の数字である。 クラミジアは偏性細胞内の病原体であるため、ホストの健全性に対する変異の効果は、細菌の回復を制限することができます。ベロ細胞は、試験した他の細胞株に比べEMSの高レベルの悪影響に対してより耐性であることがわかった。

組換えによる変異の分離は抗生物質耐性遺伝子組換え子孫のために選択する必要があります。我々は、組換え分析を実行すると、同質遺伝子系統を分離する能力のために変異体を生成するための薬剤耐性菌（ 例えばリファンピン、スペクチノマイシン、またはトリメトプリム）を使用することをお勧めします。抗生物質耐性株は、段階的な選択処理（15,16）によって生成された。

しないE： クラミジアトラコマチス （ひずみL2 / 434/Bu / ATCC VR902B）はBSL2病原体である。このような病原体を取り扱うための制度標準操作手順（SOP）を参照してください。

1. 培養細胞と感染の調製：
   1. シード約1×25 1cm ²当たり10 ⁶ Vero細胞（ATCC CCL-81）（T25）、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）3ml中フラスコ。 37℃、5％CO _2。細胞は24時間以内にコンフルエントな単層を形成すべきである。
   2. 培地を吸引。培地3ml（DMEM、200 ngの/ mlのシクロヘキシミド、10％FBS）の総容積の5の感染多重度（MOI）（〜14×10 ^6）でクラミジアとVero細胞のコンフルエントT25フラスコに感染。
2. 18時間感染後（HPI）に変異導入を開始します。
   1. リン酸20 mg / mlのEMS（エチルメタンスルホン酸）を準備生理食塩水（PBS）は、0.9 mMのカルシウムで緩衝EMSのような化学物質の安全フード内クロライドおよび0.49 mMの塩化マグネシウムは、揮発性の液体である。
      注：EMSは強力な変異と発癌物質である。 EMSは、1Mの水酸化ナトリウムで無駄に流出を除染、プラスチック、紙、ガラス中和する。
   2. 培地を吸引除去し、PBS /のMgCl ₂ / CaCl ₂を3mlで細胞を1回洗浄する。室温でのドラフトで1時間PBS /のMgCl ₂ / CaCl ₂を20 mg / mlのEMS 3mlで細胞をインキュベート。 Vero細胞は、短い期間のインキュベーター外EMSと条件のこの濃度を生き残ることができます。突然変異していない対照サンプルを含めることを忘れないでください。
   3. EMSを含む培地を取り出し、変異を不活性化するには、1 MのNaOHを容器に入れてください。残留変異を除去するために感染した細胞を3 mlのPBS +のMgCl ₂ / CaCl ₂を3回洗浄する。 200 ngの/ mlのシクロヘキシミド及び25μgの/ mlのゲンタマイシンとDMEM/10％FBS 6mlのを追加し、5％COでインキュベート_{の2、48〜72時間、37℃。介在物は変異誘発後36時間程度の細菌を欠いて表示されます。残りは空のままで72時間後に介在物の約10％が細菌で満たされている。}
   4. 低張溶解によってEBSを抽出：完全培地を吸引。 10分間、細胞を取り除くために1.0ミリリットルH ₂ Oとロックを追加します。少なくとも10回上下にピペッティングして細胞を溶解。微量でライセートと1X最終濃度にそれを持って来るために0.250ミリリットル5Xショリン酸グルタミン酸バッファ（SPG）を追加収集します。 -80℃で保存
      注：突然変異誘発のレベルはリファンピン耐性の誘導によって評価することができる。リファンピン耐性の検定頻度に、リファンピンの200 ngの/ mlの存在下での細菌のプラーク1×10 ⁸と7×10倍連続希釈。リファンピン耐性の周波数は、めっき細菌の総数で割っリファンピン耐性プラーク数として定義される。プラーク手順については、下記のセクションを参照してください。

2。プラーク精製によってクラミジアトラコマチス変異株のクローン単離

1. ウェル当たり3ミリリットルDMEM/10％FBSでシード〜0.4×10 ⁶細胞：6ウェルプレートでVero細胞のコンフルエントな単層を設定します。細胞は、次の24時間にわたって均質な単層を形成することができます。
2. 氷の上で突然変異クラミジアの原液を解凍。 DMEM/10％FBSで希釈当たり200μlの総体積で6×10倍連続希釈を行い、氷の上に設定してください。
   注：インクルージョン形成単位の細菌力価は（IFU）プラーク形成単位（P​​FU）の良い推定値である。プラーク10、100を目指して、1000 PFU。
3. ウェル当たり3ミリリットルPBSで2回Vero細胞を洗ってください。
4. 6ウェルプレートと重複の細菌希釈液100μlを各ウェルに3ミリリットルDMEMを追加。渦巻さえ混合を確保するためのプレート。
5. 15で30分間2,700 xgで感染したプレートスピン°Cその後加湿で37℃でインキュベートし、1〜2時間、5％CO ₂インキュベーター。
6. ：DMEM中アガロース（6井戸用）0.54パーセントを準備
   1. 18.9ミリリットル冷たい倍DMEM、4.2ミリリットルFBS、0.42ミリリットル100倍NEAA、0.042ミリリットルは200μg/ mlのシクロヘキシミド、0.021ミリリットル50mg/mlでゲンタマイシン：以下の成分を追加します。よく混ぜる。
   2. 塊を防止するために攪拌、ホット滅菌1.2％アガロース/ H ₂ Oの18.9ミリリットルで混ぜる。混合物が触れないように暖かくする必要があります。感染した細胞に添加する前に55℃の温水浴してください。
7. 皿から細菌懸濁液を吸引し、ウェルあたり6ミリリットル0.54パーセントアガロース/ DMEMを適用します。アガロースが15分間フード外室温で完全に固化することができます。 15分間バイオセーフティフードで、取り外し蓋とプレートを乾燥させる。
   注：生物学的封じ込めのフードからの振動が固化アガロースを歪めることができます。
8. 7-10日間CO ₂インキュベーター内で37℃でインキュベートする。プラークは解剖顕微鏡の助けを借りて見えるはずです。 （REプラークの典型的なイメージのために、図3を FER。）
9. 96ウェルプレートにウェル当たり100μlの中で前に隔離する変異の前日、シード1×10 ⁴ Vero細胞。細胞は24時間以内にコンフルエントになります。
10. 解剖顕微鏡を用いて、マークプラークを採取する。滅菌1.0ミリリットルバリアピペットチップを使用してプラークのプラグを収集します。
11. DMEM100μlの中で再懸濁しプラークは10％FBS、400 ngの/ mlのシクロヘキシミド、50μgの/ mlのゲンタマイシンを補った。
12. 変異株を展開するには、Vero細胞のコンフルエントな単層上にサスペンションをオーバーレイ。 2,700×gで、15℃で30分間でプレートスピン。
13. 加湿インキュベーター中で37℃/ 5％CO ₂でインキュベートする。 48 HPI、早ければ、14日ほど遅く発生する可能性がある細胞の> 50％が感染している収穫EBを、。感染した細胞の量は十分な生菌が格納されることを可能にする。変異株は、成長率と感染性が異なる。ナチュラに成長の遅い株を許可する十分な細胞が感染されるまでLLY隣接セルに再感染する。
14. 感染細胞の低張溶解によってEBSを抽出します。
    1. 完全培地を吸引。
    2. 滅菌水160μlのを追加します。 10分間室温でインキュベートする。
    3. 完全な溶解を確実にするために上下に数回ピペッティングして細胞を破砕、交差汚染を回避するために、バリアのヒントを使用しています。
    4. マイクロチューブに溶解物160μLを移します。
    5. 5倍のSPG40μlのに混ぜる。 -80℃で保存
15. 関心の表現型（S）のためのアッセイおよび画面変異。

3。選択されたクラミジアの変異体の全ゲノムシーケンシング

1. 宿主DNAを汚染の大部分は自由である勾配精製EBを、からゲノムDNAを抽出します。 EBをのクラミジアと精製の ​​大規模培養のためのプロトコルは、REFで見つけることができます。 （17）。内線に商業ゲノムDNA精製キット（ 例えばキアゲン猫。69504）を使用しメーカーの指示に従って2×10 ⁹細菌からDNAをRACT。
2. 正確にDNA量を測定する蛍光（量子ビット、インビトロジェン猫。Q32866）を使用します。 DNAの精製1-5μgのイルミナシーケンシングプラットフォームのために必要です。
   注：いくつかのプラットフォームがIllumina/Solexa-とソリッドベースシステムを含むシーケンス細菌ゲノムに使用することができます。我々は、それが短いの高密度を生成としてHiSeq（イルミナ）を使用することを選択したが、高品質のシーケンシングを読み取り。このようなIonTorrent（Life Technologies社）とMySeq（イルミナ）など小規模なゲノムシーケンサは、あまりにも適しており、十分なゲノムアセンブリのため25Xの最小限の範囲を超えた時、少なくとも4 クラミジアゲノムまで、これらのシングを多重化するための十分以上。イルミナプラットフォームのためのDNAシークエンシングライブラリーの調製を以下に説明する。
3. でS220アダプティブ集束音響を使用して適切なサイズにフラグメントDNA（イルミナシーケンシングのための300-400塩基対）製造元が推奨する設定に従ってインストゥルメント（Covaris）。注意：サンプルのエアロゾル化のために、サンプルの大きな損失で噴霧の結果DNA断片。
4. メーカーの指示に従って、商業建築·キット（イルミナFC-102-1001）を使用して、ゲノムシーケンシングライブラリを準備します。ライブラリは、複数のサンプルを同時にプールし、配列決定することができるようにバーコードプライマー（イルミナFC-121-1003）を用いて索引付けすることができる。
5. シークエンシングのサンプルを実行します。このステップは通常の商用サービスや専用の技術スタッフが運営する中核施設によって実行されます。彼らの手順と推奨事項に従ってください。
6. イルミナ読み取りが（FASTQ形式）は、またSNP /変異を同定するために使用することができるGeneious（Biomatters）など、ユーザーフレンドリーなグラフィックユーザーインターフェースのソフトウェアを使用して、基準ゲノムに組み立てることができる。マップ変異に、最小バリアント周波数と最小の適用範囲のための50倍、90％までのパラメータを設定します。オープン同一レベルこのようなMAQ（18）とBWA（19）として電子ゲノムアセンブラを用いることもできる。
7. サンガー配列決定により変異の確認：サンガー配列決定により同定された変異とシーケンス精製または希釈（1：20）PCR産物に隣接300-500 bpの領域をPCR増幅のための鋳型としてゲノムDNAを使用しています。

4。 クラミジア組換え体の生成

注： クラミジアは感染時にDNAを交換することができ、どれが組換え株の世代（12、13、20）を可能にします。 2つのユニークな抗生物質耐性株による細胞の同時感染の後、組換え "子孫"は、デュアル抗生物質耐性（12,13）のために選択することができる。我々は、突然変異を分離し、共同質遺伝子系統を生成するために、この現象を利​​用した。したがって、変異株は抗生物質耐性の背景（CTL0567（rpoB）で例えばリファンピン耐性（RIF ^R）H471Y）彼らは野生型株bearinに交差することができるように生成された著異なる抗生物質耐性対立遺伝子（ 例えば、スペクチノマイシン耐性（SPC ^{R）、r01/r02}でG1197A（16SRNA 1と2をコピー））。 クラミジアにおけるDNA交換と再結合に関する詳細については、参考文献（12、13）を参照してください。

1. 24ウェルプレート上に成長したVero細胞のコンフルエントな単層に各株からcentrifuging6×10 ⁵細菌によって、野生型およびクローンの変異株を共同感染。並行して、単独の各株で単層に感染。
2. 44でHPI、感染細胞の低張溶解によって収穫したEB：
   1. 完全培地を吸引。
   2. 滅菌水0.4 mlを加え、10分間放置。
   3. 活発な、少なくとも10回のアップ＆ダウンペッティングにより細胞を溶解。転送は、マイクロチューブに溶解物。
   4. 1X SPGの最終濃度のために5倍のSPGの0.1ミリリットルでミックス。
   5. 粗溶解液を即座に使用されるか、または-80℃で保存することができる℃で
3. 原油EBのプラーク50μlのは名誉な組換え体を選択するために、適切な抗生物質を添加したアガロース/ DMEM中のd 5×1時10分の段階希釈。 （組換え体の選択のための代表的な抗生物質の濃度についての表を参照してください。）
4. プラークは、浄化し、上記のように組換え株を充実させる。所望の表現型の有無のためにスコアが組換え体。変異の有無をタイピングする目的のためDNAzol治療（次項）により組換え株からDNAを抽出します。
5. 交雑をさらに突然変異を分離し、同質遺伝子系統を生成するために、他の抗生物質耐性マーカーを有する菌株を繰り返すことができる。別の抗生物質マーカーを冠した別の野生型株に選択された組換え体を共感染させる。

表1：組換え体の選択のための抗生物質の濃度：

最終濃度	準備指示
200 ngの/ mlのリファンピン	ジメチルスルホキシド（DMSO）に25 mg / mlの貯蔵ストックを作る。 H 2 Oとストレージ株式を希釈して200μgの/ mlのワーキングソリューションを構成する暗闇の中で-20℃で保管してください。
200μgの/ミリリットルトリメトプリム	DMSOで100 mg / mlのストックを作る。 -20°Cで保存
200μgの/ミリリットルスペクチノ	100μlのアリコートの水で100 mg / mlのストックを作る。 -20℃で保存繰り返し凍結融解は避けてください。

5。ジェノタイピングのための組換え株からのゲノムDNAの抽出

注：カラムベースの精製キットを使用することもできる。 DNAzol処理によるDNA抽出の利点はコストです。

1. 12ウェルプレート上に成長したVero細胞の単層上に1.2×10 ⁵クラミジアに感染。
2. 36-48 HPIでは、培地を吸引し、DNAzolの0.375ミリリットル（インビトロジェン10503から027）を追加します。優しく細胞とピペットリサを攪拌1.5 mlのマイクロチューブにTES。
3. 100％エタノールの0.188ミリリットルを加えてDNAを沈殿させる。転倒混和します。
4. ピペットチップでスプールによりDNAを抽出し、きれいなチューブに入れます。また、ペレットを室温で2分または4℃、デカント上澄みのトップスピードで遠心分離によってDNA。
5. 75％エタノール1.0mlので二回DNA沈殿物を洗ってください。
6. 15秒のためにエタノールを除去した後空気乾燥DNA。
7. の0.1M HEPESの20.2μlのpH8.0に中和し、その後0.2ミリリットル8 mMのNaOHでDNAを可溶化する。水やTE、0.5 mlの最終容積に持ち出す。また、TEバッファー（DNAペレットが完全に可溶化されません。）中のDNAを再懸濁します。
8. 同定された変異に隣接300-500 bpの領域のPCR増幅のためのテンプレートとしてDNAzol抽出したDNAを使用してください。シーケンスは、精製されたまたはサンガー配列決定により（午前1時20分）PCR産物を希釈した。

結果

突然変異原への曝露は、細菌の細胞死が原因おそらく、細菌を欠い現れる介在物につながる。一般的に、血清型LGV-L2は完全に48時間後に感染症の中で感染した細胞を溶解しますが、変異誘発物質による治療は> 90 hまでこのサイクルを拡張することができます。介在物の約10％が回復すると予想される。我々の実験では、20 mg / mlのEMSで治療感染Vero細胞は、未処理のコントロールと比較して感染性の子孫の回収で99％の減少につながった。変異治療も小さなプラーク（SPQ）（ 図3）を含む、変更された形態とプラークの出現につながった。他の形態は、粒状塊状、または（ 図3）ハニカム形現れる老人斑があります。これらの表現型は、ホスト環境内の感染および生存のために必要なプロセスの欠陥を反映しているかもしれない。小さなプラーク（SPQ）形態を有する変異体は、一般的にかなり少ない感染子孫を生産し、2〜3週間かかる場合がありますmplify。差し戻しとサプレッサー変異が高頻度で蓄積することができるようにこれらの株を継代するときは注意が必要です。

ディスカッション

それは遺伝子型と表現型の間のリンケージを確立するように、この方法論は、遺伝子解析のための基本的な要件を満たしています。重要なことに、これはしばしば、非モデル微生物における遺伝子機能の解析における律速段階である組換えDNA形質転換菌の遺伝子の挿入不活化のための従来の分子生物学のツールの助けを借りずに達成される。

一つの重要なステップは、プラーク精製変異体のクローンを確保することである。野生型または "フィッター"突然変異体との交差汚染を迅速outcompetedされる変異株につながることができます。同様に、非クローンサンプルの全ゲノム配列決定により変異をマッピングすると、あいまいな結果につながることができます。重くplaqued井戸から突然変異体を単離し、またはあまりにお互いに接近しているプラ​​ークを差し込むことは避けるべきである。また、成長の遅い変異体のために、復帰は、比較的高い周波数で現れることができる。私たちは、オリジナルまたは低い通路株式を保持をお勧めします。 REPL交差汚染または復帰場合aque変異体が疑われている。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコs Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995-073
ウシ胎児血清 (FBS)	Cellgro	35-010-CV
エチルメタンスルホン酸 (EMS)	Σ	M0880
シクロヘキサミド	Σ	C4859-1ML
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	ライフテクノロジー	14190-144
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液、0.493 mM MgCl2 および 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)	Life Technologies	14040-133
1 M NaOH
5x SPG バッファー (1.25 M スクロース、 50 mM リン酸ナトリウム、25 mM グルタミン酸)
SPG バッファー (0.25 M スクロース、10 mM リン酸ナトリウム、5 mM グルタミン酸)
水 (滅菌、組織培養グレード)
2x DMEM (粉末から調製、7.4 g/L 重炭酸ナトリウム	Sigma	D7777
非必須アミノ酸 (NEAA)	Life Technologies	11140-050
1.2% GTGのアガロース、オートクレーブされた	Lonzo	50070
ゲノムDNAの浄化のキット	Qiagen	69504
DNAzol	生命技術	10503-027
エタノール(分子生物学の等級)
8 mM NaOH
0.1 M HEPES(4(2-hydroxyethyl)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)緩衝液
25 cm2 組織培養フラスコ (T25 フラスコ)
6 ウェル組織培養プレート
12 ウェル組織培養プレート
96 ウェル組織培養プレート
化学安全フード
生物学的安全フード
>遠心分離機と回転組織プレート
>解剖顕微鏡
蛍光光度計(Qubit)	Invitrogen	Q32866
Adaptive Focused Acoustics S220 instrument	Covaris