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方法論記事

エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

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DOI:

10.3791/50646

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2013年10月8日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill

この記事について

サマリー

ヒトボランティアの表面掻き取り、生検により得られた鼻上皮細胞は、組織培養インサートに展開され、転送される。コンフルエントに達したら、細胞は、繊毛および非繊毛細胞の培養物を得、空気液体界面で成長させる。差別化された鼻の上皮細胞培養物は、呼吸器粘膜を研究するための実行可能な実験モデルを提供する。

要約

in vitroモデルヒト初代上皮細胞を用いて、微生物感染または吸入薬のコンテキストで気道上皮の主要な機能を理解する上で不可欠です。病気の集団から得られた細胞の直接比較は、私たちは異なる表現型を特徴づけるし、上皮細胞の機能の変化を仲介する根本的なメカニズムを分析することができます。ヒト気管気管支領域からの上皮細胞を培養することは、十分に文書化されているが、気管支ブラシ生検の取得と関連するヒト肺組織または侵襲性の利用可能性によって制限される。鼻上皮細胞ははるかに低侵襲性表在性鼻擦り生検を介して得られ、被験者は、有意な副作用を複数回生検することができる。さらに、鼻呼吸器系へのエントリポイントであり、したがってそのような抗菌剤として空気中のストレッサーの任意の種類に露出される最初の部位、のいずれか、汚染物質、またはアレルゲン。

簡潔には、ヒトボランティアから得た鼻上皮細胞は、コーティングされた組織培養プレート上に展開し、次に細胞培養インサート上に転写される。コンフルエンシーに達すると、細胞は、より生理学的に関連する条件を作り出す数週間、例えば、気液界面（ALI）で培養され続ける。 ALI培養条件は繊毛と細胞を産生する粘液の両方で、人間の鼻上皮と同様の形態学的および機能的な特徴を示す差別化上皮につながる定義されたメディアを使用しています。分化した鼻上皮細胞と組織培養インサートは研究課題（薬理学的薬剤による治療、レンチウイルスベクター、ガスへの曝露、又は微生物剤の感染による形質導入）に応じて様々な方法で操作さに至るまで、多数の異なるエンドポイントのために分析することができる細胞および分子経路、機能的CHアンジェス、形態など

分化したヒトの鼻上皮細胞の試験管内モデルでは 、主に、生体内で鼻上皮を模倣器官実験モデルを使用して新規で重要な研究課題に対処するために研究者を可能にします。

概要

技術の目的

気道上皮細胞（EC）を直接このような病原体、アレルゲンまたは大気汚染物質などの吸入環境ストレスにさらされる最初の部位の一つである。 ECの構造的障壁を超えている：彼らは可溶性メディエーター4-6とそのsurfac 7-9上のリガンド/受容体の発現の解放を経由して、呼吸器、免疫応答1-3を開始し、制御する交換機として機能します。不死化細胞株は、インビトロでのEC呼吸を研究するためのモデルとして使用することができるが、それらはin vivoで観察されるものと同様の偏極繊毛および粘液産生細胞からなる不均一な細胞集団に分化することができない。 in vivoで観察気道上皮の重要な特性を再現するために、一次気道のECを使用することができる。そのため、私たちの目標は、鼻のEC（NECの）を利用し、本手法を最適化することであったヒトボランティアから得た。 NECのは、インビボで見られる鼻上皮の特徴の多くを模倣するNECの分化の細胞培養モデルを得、 インビトロで増殖培養する。

論理的根拠

生体内の状況に模倣ヒト初代のEC を用いたin vitroモデルの使用は、 -この研究で説明したように- 、病気ECの具体的な違いが、気道上皮に関連する生理的パラメータ、またはECおよび他の細胞型間の相互作用を研究するユニークな可能性を提供しますこのような樹状細胞10、ナチュラルキラー細胞11やマクロファージなど。いくつかの既存の方法はbronchoscopies中に、またはそうでなければ廃棄された肺組織から12-17ブラシ生検を介して、侵襲的に得ることができる気管支電気部品を利用する。また、完全に分化したヒト気道上皮細胞培養物を得るための商業的供給源はマテック、アッシュ、MA、Clonetics社から（EpiAirwayモデルが存在調査官は異なるドナーから選択することができますロンザ、バーゼル、スイス、Epithelix SARS、スイスのジュネーブからMucilAir）から。しかし、市販されている上皮細胞の限られたプール、パラメータの限定されたまたは所定の設定、市販の一次ヒト気道のEC、そして廃棄肺組織または新たに採取したヒト気管支生検組織への限定的なアクセスを取得することで、コストの多くの研究者を禁止する完全に分化したヒト気道のECでの研究を行うから。したがって、我々は1）非侵襲的に得られたヒトNECのを利用する技術を開発するために着手し、2）分化したヒト気道上皮の文化をもたらしプロトコルを提供し、3）既存の組織培養インフラのほとんどのラボ設定で、再現性がある。

既存の技術/モデルに比べて利点

気管支や末梢気道のECに比べて、はるかに少ない侵襲的であるように、新鮮なNECの入手方法は、個々のS重大な副作用が複数回の生検することができ、表面的な鼻掻き生検は、そうでなければ、研究関連のbronchoscopiesの対象とならないだろう、罹患集団で行うことができる。 NECのを得るための非侵襲的な表面的な掻き生検は、研究者が達成される研究目的に合わせて年齢 、性別、疾患の状態を含め、 先験的ドナーの仕様を設定することができます。調査研究を設計する際にこのようにして、研究者は、商用ベンダー、またはデザイン侵襲的な気管支鏡検査の研究から、高価な分化した細胞培養モデルを購入し、臨床的に利用可能な組織/上皮試料によって限定されるものではない。また、NECの使いやすさを得るためには、観察された所見の統計的な妥当性を増強する異なるドナーからの細胞で実験を実施する能力を、増加させる。最後に、鼻に空気中のストレッサーの任意の種類に露出された最初のサイトの一つである。このように、 内器官を生成する鼻上皮を模倣するインビトロ培養系は、容易にこの細胞培養系を使用することによって達成することができるウイルス粒子、汚染物質、アレルゲン、又はガスの吸入を研究するために有用である。

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プロトコル

1。プラスチックの構造を準備します。コートプレート

  1. 12ウェルプレートの各ウェルに500μlのPureCol（滅菌水で希釈1:100）を添加する。
  2. 30分間インキュベーター内で37℃でインキュベート、PureColを削除し、細胞をプレートに添加する前にHBSS権で洗い流し（以下のステップ3.1を参照）。

2。取得と人間NECのの前処理生検

  1. 鼻掻き生検
    1. 鏡（モデル21700）を持つオペレーティング·オトスコープに9ミリメートル、再利用可能なポリプロピレン製鼻鏡（モデル22009）を通して直視下鼻甲介の内側を覆う表面的なECのを入手します。このデバイスは、鼻甲介と運動の柔軟性の最適な可視化を提供します。
    2. わずかに後方に傾いたり診察台に仰臥位で横たわって頭をまっすぐにバックアップされた椅子に直立座っ対象で生検を行う。
    3. 鼻孔と劣っturbiに耳鏡の鏡を挿入しますネイトは、照明で可視化した。
    4. 鼻甲介の奥まで遠位延長先で鏡を通して無菌熱可塑キューレットを挿入します。
    5. 鼻甲介の下面に穏やかな圧力を使用して、キューレットは、粘膜表面5X渡って描かれ後退する。毛細管現象によって保持粘膜細胞の正常な取得は、キューレットのカップには明らかであろう。
  2. のRPMI 1640の8ミリリットル、氷上輸送を含む15ミリリットルコニカルチューブにサンプルを配置します。
  3. 、プローブを取得するために鉗子を使用して、P-1000ピペットでRhinoのプローブから組織を取り除く、プローブを破棄
  4. 遠心分離機、上清を吸引し（注意：ペレットを吸引しないように注意してください）​​を（4℃、400×gで、5分間）ペレット化する。
  5. 100X DNアーゼ1の10μlで1ミリリットルBEGMでペレットを再懸濁します。
  6. 室温で20分間インキュベートする。
  7. 遠心分離機（4℃、400×gで、5分）、上清を吸引しないでください！

3。 Sプラスチック上EED細胞（0日目）

  1. プレートからPureColを削除し、HBSSで洗い流し（も1.2ステップ参照）。
  2. （メディアのメニスカスがウェルの中央に表示されるまで、80〜100μL）塗装板の（生検サイズに応じて）1-4ウェルにBEGM +メディアの最小容積を追加します。
  3. 慎重にあまりにも多くのメディアを吸引することなく、チューブから生検組織のペレットを除去するために、P-1000ピペットを使用してください。
  4. 、井戸の中央にペレットを移し、細胞のクラスタとして一緒に生検を維持し、単一細胞懸濁液を作るために別れるません。播種することができる4つのウェルまでの良好な生検が得られます。組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、> 90％相対湿度）中にプレートを置く。
  5. （メニスカスを乱すことなく）十分なメディアがあることを保証するために、2時間後に確認してください。
  6. 1日目は、24時間後に播種：すべてのウェルのすべての非接着細胞を回収（ティルトプレートとP-1000のセルでメディアを集めて、C1.5ミリリットルの遠心管中のすべてのウェルollect）。
  7. 遠心分離（4℃、400×gで、5分間）。
  8. 細胞懸濁液を遠心分離しながら：0日目に播種した細胞にBEGM + +とBEGM +メディア混合物を250μlの約250μLを加える。
  9. 繰り返し、非接着細胞用3.1から3.5を繰り返します。
  10. 日2-5：毎日の細胞の変化媒体; BEGM +メディア段階的に（播種後2日目の量減らし、各ウェルに500μlのメディアを追加します。125μLBEGM +プラス375μLBEGM +、播種後3日目と次の日：73 μLBEGM +プラス427μLBEGM +）。

4。フラスコ中の細胞を増殖

  1. 日々のセルを監視、彼らは80〜90％の集密度に達すると（彼らは時間がかかる場合には、通常5〜7日の生検後、彼らが正常に成長しない）リフト細胞以下のとおりです。慎重に培地を吸引し、0.25％トリプシン500μlのを追加細胞が剥離するまで、ウェル毎に、（それは通常は2〜3分かかります）、37℃で保管してください。
  2. 必要性を準備する15mlチューブ中の大豆トリプシンインヒビター（SBTI）（1ミリリットル当たりトリプシン750μL）のEDの音量。
  3. 繰り返しピペッティングトリプシン溶液ダウンによって細胞を取り除く。SBTIで15ミリリットルコニカルチューブを剥離した細胞を移す。
  4. 細胞とチューブにHBSSを追加、合計1ミリリットルHBSS中で全てのウェルを洗浄します。
  5. 、（4℃、400×gで、5分間）ペレットメディアを吸引し、1ミリリットルBEGM +メディアに再懸濁し、チューブを渦に遠心します。
  6. ペレットサイズに応じて、T25やT75フラスコ中の細胞を展開します（これはP1である。約2集密ウェルが1 T75フラスコに入り、1集密よく1、T25には十分ですが、通常は2融合性ウェルは1 T75）を得た。
    1. （T75のための5ミリリットルごとに、T25のための3ミリリットルずつ）フラスコにBEGM +を追加します。
    2. フラスコに細胞懸濁液を追加します。組織培養インキュベーターにフラスコを転送します。
  7. 24時間後にフラスコ播種：フラスコ（T75とT25に3ミリリットル、10ミリリットル）に追加BEGM +メディアを追加します。
  8. フラスコ中の細胞を維持する：（5 ml/T25、20 ml/T75）メディア（角から吸引）を取り外し、BEGM +メディアを追加します。メディアは、2〜3日ごとに変更する必要があります。彼らは約80％コンフルエントになるまでフラスコ中の細胞を維持する（集密度でも全体のフラスコを通してできない場合があり、通常、これは7〜10日間を要する。彼らは、彼らが正常に成長しない10日後にコンフルエントされていない場合）。

5。組織培養インサート上で細胞を播種

  1. フラスコから培地を除去し、トリプシン（T25用3ミリリットル、T75フラスコのための4ミリリットル）を追加します。
  2. 細胞が剥離するまで、37℃でインキュベートする（約2〜3分）。
  3. 15ミリリットルチューブにSBTI（T25用1ミリリットルのトリプシン> 2.25ミリリットル、T75のための3ミリリットル当たり750μl）を準備します。
  4. ダウンフラスコをテーピングし、ピペッティングにより細胞を取り除くとSBTIとコニカルチューブに移す。
  5. 15mlチューブにHBSSを加え、HBSS（T25、T75のための2ミリリットルのための1ミリリットル）でフラスコを洗浄します。
  6. 遠心分離機（4℃、400×gで、5分間）ペレットにし、上清を注意深く除去します。
  7. プレートを準備します。シードされたことを行っているか多くのプレートを決定し、サンプルコードや番号、継代数（ すなわち P2）と日付でプレートにラベルを付ける。基底室に700μLBEGM +メディアを追加します。
  8. チューブをボルテックスで1ミリリットルBEGM ALI培地で細胞ペレットを再懸濁します。
  9. （T25は通常、約4万個の細胞を生産、T75は、島によっては最大20万個の細胞を持つことができます。1 12ウェルプレートのための細胞の1から2000000を使用してください）​​、血球計数器で細胞をカウントして細胞懸濁液を希釈（プレート当たり2.5ミリリットルのメディアに1.2×10 6細胞）を播種する必要があり、プレートの量のために必要な総容量BEGM ALIメディア（注：細胞の一部を凍結する場合は、チューブにラベルを付け、細胞を除去ここに：我々は通常、メディアの凍結の2ミリリットル中の2×10 6個の細胞を凍結する）
  10. 各コーティングされていないコーニング12well細胞の頂端側に200μlの細胞懸濁液を追加挿入（>これは約80,000〜150,000個/挿入されます。0.4ミクロンの細孔のポリエステル（ポリエチレンテレフタレート（PET））メンブレンインサート付き12mmのトランスウェル）は、組織培養インキュベーターに移す。
  11. 24時間後、頂端メディア（200μlの増殖培地）を変更。
  12. 細胞培養の維持：（BEGM ALI媒体、700μlの基底外側および200μlの頂端）メディアを変更日おきに。インサートは、細胞が（単層に穴が見えない）、完全にコンフルエントになるまで水没維持されなければならない。それは、細胞が最も可能性の高い実行可能ではありません長い時間がかかる場合は、細胞数に依存し、これは通常、2〜6の間で日かかります。

6。エア·液界面を確立する（トランスウェル上の細胞が完全にコンフルエントのとき）一度細胞が完全にコンフルエント

  1. 細胞が完全にコンフルエントになったら48時間500nMのレチノイン酸を補給しBEGM ALIメディアの両方先端および基底外側のメディアを交換してください。
  2. レチノイン酸を添加した後の48時間はBEGM ALIメディアを補足：PneumaCult-ALI 維持培地（以下、メーカーの説明書）を準備します（基礎コンパートメントの通常8.5ミリリットル1版用）に必要な媒体の体積を計算し、1ミリリットルあたりの追加完全基礎培地をPneumaCult ：

    10μLPneumaCult 100X保守サプリメント
    （2 mg / mlの保存溶液）2μlのヘパリン
    （96μL/ mlの保存溶液）5μLヒドロコルチゾン。

  3. すべてのメディアを削除し、基底外側のみ（頂端側の無培地）に700μlのPneumaCult-ALI保守メディアを追加。
  4. ALIで4週間の細胞培養を維持する。
    1. （月曜日、水曜日と金曜日のスケジュールは私たちのためにうまく動作します）一日おきにメディアを変更。
    2. ALIの1週間後、一週間（水曜日）、一度先端表面を洗浄されています慎重に吸引し、培養器で10分のためにそれらを保つため、頂端側に200μlのHBSSを追加HBSSを（HBSSをオフに吸引するピペットの先端に200μLのヒントを使用して、生物学的安全キャビネット内の真空トラップに付着したガラスピペット内の9を使用します）。

注意：変更板間のヒントだけでなく、側底対頂端面から行くときのヒントを変更する。 ALIで約2週間後、細胞は分化し始めると、繊毛が表示される。細胞培養は、ALIで約4週間後に完全な差別化を達成。

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結果

NECのは、ここで説明するプロトコルは、生体内の状況（ 図1）を表す繊毛と非繊毛細胞から構成されるECの異質層に再差別次培養した。差別化NECののいくつかは、（AB / PAS、 図1Bを用いた青色に染色細胞）を産生する粘液である。ここで紹介するプロトコルが最適化されるにもかかわらず、全体的な分化は、細胞集団（：粘液産生細胞：繊毛細胞、すなわち異なる比率の非繊毛細胞）の分布に関して変化し得る、あるいはそれ以上の扁平上皮を生じる。これらの変化は、我々が以前の喫煙者18からNECのを使用して実証したように、ドナー集団に依存し、したがって、基礎疾患表現型の要約を表すことができます。 図2は 、異なるプロトコルやメディア製剤を使用して次善の再分化NECの例を示しています。細胞は扁平であり、直方体や繊毛でもないし、多列気道上皮（ 図2）を模倣しないでください。

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ディスカッション

呼吸のECは、外因性の刺激20から人体を保護するだけでなく、可溶性メディエーターまたは直接受容体-リガンドの細胞-細胞相互作用の分泌を介して開始し、呼吸器、免疫防御応答を1-3に調節するための配電盤として作用する物理的障壁だけを提供する。さらに、免疫応答におけるECの役割を研究するための病気の集団からの電気部品間の電位差を調べるために、又は電気部品に対する外因性ストレスの影響を研究するためには、in vivoでの状況を再現することが重要である。人間の気道は、繊毛細胞、杯細胞および基底細胞20などの異なる上皮細胞を含む40以上の異なる種類の細胞20を含んでいる。我々のプロトコルは、表面的な鼻掻き生検が大きく、生体内で鼻上皮を模倣した、NECの培養を得、再分化を受けることを拡大し、培養することができるNECのを得るために処理する方法について説明します。

器官に分化した初代ヒトNECのこのin vitroモデルを...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

著者らは、有用入力に対してリサデイリーに感謝したいと思います。

この作品は、国立衛生研究所（ES013611とHL095163）からの補助金によって支えられて、フライトアテンダント医学研究所（FAMRI）、および環境保護庁（CR83346301）とは、利害の衝突を宣言していません。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。この資料に記載された研究は、ノースカロライナ州チャペルヒル大学の環境医学、喘息および肺生物学センターとの協力協定のCR83346301を通じて、米国環境保護庁（EPA）によって部分的に資金を供給してきたが、それが施されていない代理店の必要なピアおよび政策見直し、したがって必然的に機関の見解を反映するものではない、と公式承認は一切関係ありません。 O言及Fの商号または市販品を使用するために承認または推奨するものではありません。ロレッタ·ミュラーは、個人的な補助金とスイス国立科学財団によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
鼻鏡ウェルチ・アリンモデル220099 mm、再利用可能なポリプロイレン
手術用耳鏡ウェルチ・アリンモデル21700
サイプローブ細胞キュベットアーリントンサイエンティフィックSY-96-092キュベットの頭をもう少し曲げ
12ウェル培養プレートコーニング3512
トランズウェル膜細胞培養インサートCorning3460
組織培養フラスコ Corning430639 and 430641T25 and T75 ベントフラスコ
RPMI 1640 培地 (L-グルタミン付き)Gibco11875
気管支/気管上皮細胞増殖培地細胞アプリケーション511-500
BEGM 気管支上皮細胞増殖培地ロンザCC-3170これは、サプリメント付きのミディアムとバイアルの1本のキットとして提供されます。
重曹7.5%溶液Gibco25080そのままご使用ください。
NuSerumBD Biosciences355104そのままご使用ください。
BAMBANKER 凍結メディアBAMBANKER302-14681そのままご使用ください。
CoolCell BiocisionHTBCS-136(CryoPrepアルコールフリー細胞凍結容器)
PureColAdvancedBioMatrix5005-B水で1:100に希釈(約0.03 mg / ml)500 μ
Ca2 および Mg2+Gibco14025
DNAse 1SigmaDN25100x 溶液である 1.5 mg/ml で溶解し、10 μメディア
トリプシン、0.25%、1x、フェノールレッドGibco25200-056での使用は
大豆トリプシン阻害剤(SBTI)シグマT6522mg / mlの濃度でHBSSに溶解して使用
チノイン酸シグマR7632100 μMストック溶液(下記参照)、10&muに希釈。無水アルコールとM、5&muを取ります。これを1 mLのBEGM培地(当社の作業溶液)に加えます.

All-trans Retinolは、325 nmのエタノールで52,480の吸光係数を持っています。25mgを50mlの無水エタノールに溶解します。連続希釈を行う必要があり、50mlのストックを450mlの無水エタノールで希釈し、これを50ml取り、450mlの無水エタノールで希釈し、これを50ml取り、450mlの無水エタノールで希釈し、再びこれを50ml取り、450mlの無水エタノールで希釈し、これを100ml取り、900mlの無水エタノールで希釈し、325nmの分光光度計で読み取ってください。 次に、この数値にその ' を掛けます。希釈係数を52,480の吸光係数で割ると、mM単位の数値が得られます。100 mMのストックを作成します(-20°Cで保管します。C)そして、このストックから10mMアリコートが作られ、必要な毎日のレチノイン酸は、995mlのALI培地中のこの10mMアリコートの5mlとなる。例:325nmの読み取り値は1.15です。1.15 x 10,000(希釈係数)/ 52,480 = 0.219 = 219 mM、これから無水エタノールで100 mMのストックを作成します。
DMEM 高グルコース (1x)、液体、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムGibco11995
牛下垂体抽出物Gibco13028-014BEGM ALI培地に使用されます。
ナイスタチンシグマN4014-50 mg、3.3 mg / mlの溶液を構成します。
ウシ血清アルブミンフィッシャーサイエンティフィックBP1600-100ミリQ水に10 mg / ml溶液の溶液を作ります。
PneumaCult-ALI培地StemCell5001これは、サプリメントを含む培地とバイアルの1本のキットとして提供されます。詳細については、以下を参照してください。
ヒドロコルチゾンStemCell79042.4 mgのヒドロコルチゾンを1 mlのddH2O(200倍のヒドロコルチゾンストック溶液を作るために使用)に溶か
PBS(2 mg / ml)のヘパリンナトリウム塩StemCell7980で使用します。
フィルターフラスコ (500 ml)Corning4310970.22 μm細孔径
フィルターチューブ(50ml)ミリポアSCGP00525ステリフリップ、0.22 μm孔径
ピペットチップ-ARTバリアチップ分子バイオ製品2139RI、2069RI、2179RI
コニカルチューブ、滅菌、15mlおよび50ml
ddH2O、無水エタノール、氷
CO2インキュベータ
冷蔵遠心分離機
生物学的安全キャビネット
ピペット(P2、P200、P1000)、9インチガラスピペット手袋
ラボコートタイトカフス
る 滅菌 を の各mlにlそれです1 レははしますのー手袋付き<td colspan =" 4" > <>
  • 540 Μl ddH2O
使用したメディアとソリューション:< / strong> レシピ 使用対象
一般的な備考:常にメディアを室温まで温めてください
BEGM media
  • 500 ml BEGM 細胞アプリケーション培地 レチノイン酸 1 アリコート
 (半半分に混合してろ過)
  • 500 ml BEGM ロンザ 培地 1 アリコートのシングルクォートサプリメント
    < Li> 生検の消化
BEGM+ 培地
  • 50 ml BEGM 培地
  • 細胞の維持プレート内のプラスチック上(通路0)< / Li >< / UL >< / TD > < / Tr>
  • 10 & MU;l レチノイン酸 (作業溶液)
  • フラスコ内の細胞の播種 (継代1; 部分的に)
< / td> < / tr > < tr> 		< / td>
  • フラスコ内の細胞を維持します
< / TD>
BEGM++ media
  • 50 ml ロンザ'サプリメントを含むBEGM培地
  • プラスチック
  • 1 mlナトリウム重炭1
  • プラスチック上のプレート内の細胞の維持 (passage0; 部分的にのみ)
  • 2.5 ml NuSerum
  • フラスコ (passage1; partially)
BEGM ALI media
  • 250 ml DMEM-H
  • トランズウェル上の細胞を移動前に維持する ALI
  • 250ml BEGM サプリメントを含む
  • 2 ml ウシ下垂体抽出物 (12.5 mg/ml 溶液)
  • 1 ml ナイスタチン (3.3 mg/ml 溶液)
  • 75 μl BSA(10 mg / ml溶液)
200Xヒドロコルチゾンストック溶液(96 μL/mL溶液)
  • 200 Μl 溶解ヒドロコルチゾン
<> < / td rowspan="5">
  • フラスコ内の最終日および細胞がインサート上にあるときのPneumaCult-ALIコンプリートベースメディウムの補足として< / li > < / td > < / tr>
  • 4250 μl 溶解塩化ナトリウム
  • 10 μl 無水エタノール
フィルター溶液 0.22 μmフィルター、アリコート溶液、-20°Cで保存します。C、追加の凍結/融解サイクルを避けてください
PneumaCult-ALIコンプリートベースメディア
  • 450 ml PneumaCult-ALI 基礎培地
  • 3つすべてのPneumaCult-ALI培地
  • 50 ml PneumaCult 10x サプリメント
  • PneumaCult メディアは光に敏感なため、常に暗闇に保管してください
(これは2-8°Cで2週間安定しています。Cまたは-20°Cで最大6か月間。C)
PneumaCult-ALI メンテナンス ミディアム1 ml PneumaCult-ALI コンプリート ベース ミディアム 追加:挿入物の ALI 培養
  • 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement
  • 2 μl ヘパリン(2mg/ml原液のもの)
  • 5 μl ヒドロコルチゾン (96 μL / mLストック溶液)< / Li>< / UL>< / TD > < / TR> < / Tbody> < /Table>

参考文献

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