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方法論記事

RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

39.3K 回視聴

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DOI:

10.3791/50671

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2013年11月1日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

マスト細胞の脱顆粒、アレルギー性​​メディエーターの放出は、アレルギー、喘息、および寄生虫防御に重要です。ここでは、脱顆粒で薬や毒物の影響を評価するための技術1を実証、方法論は、最近抗菌剤トリクロサン2の強力な阻害効果を発揮するために利用。

要約

マスト細胞はアレルギー疾患や寄生虫に対する免疫防御において重要な役割を果たしている。かつて（アレルゲンによって）アクティブに、彼らは、アレルギー性メディエーターのエキソサイトーシスで結果そのプロセスを脱顆粒。薬物および毒物による肥満細胞の脱顆粒の変調は、人の健康に正または悪影響を与える可能性があります。肥満細胞機能は、ラット好塩基球性白血病マスト細胞の使用（RBL-2H3）、ヒト粘膜肥満細胞の広く受け入れられているモデルまでの時間を詳細に切開されている。 6肥満細胞からのヒスタミンと連携して直線的に放出される肥満細胞顆粒成分およびアレルギーメディエーターβ-ヘキソサミニダーゼを、容易かつ確実に適しているマイクロプレートアッセイで測定可能な蛍光強度を得、蛍光原基質との反応により測定することができる高スループット研究1。もともとNaal らによって出版した。1、我々は、スクリーニングOは、この脱顆粒アッセイを適応しているfは薬物や毒物、ここでその使用方法を示しています。

トリクロサンは、多くの消費者製品中に存在し、このエフェクトのメカニズムは不明であるが、人間のアレルギー性皮膚疾患における治療7-11援助であることが見出されている広域スペクトル抗菌剤である。ここでは、マスト細胞の脱顆粒に対するトリクロサンの効果についてのアッセイを実証する。我々は、最近、トリクロサンを強くマスト細胞機能2に影響を与えることを示した。有機溶媒の使用を回避する目的で、トリクロサン熱と攪拌しながら水性緩衝液中に直接溶解させ、得られた濃度は、12（ε280 = 4,200 L / M / cmで使用）UV-可視分光光度計を用いて確認された。このプロトコルは、より広く、そのアレルギー電位をマスト細胞の脱顆粒に対する効果を決定するために様々な化学物質と一緒に使用される可能性があり、。

概要

マスト細胞は喘息、アレルギー、寄生虫防衛および発癌13-16で重要なメディエーターとして機能性の高い造粒免疫エフェクター細胞である。彼らは、脱顆粒するために活性化されるまで、彼らは無事に質顆粒にアレルギー性および炎症性メディエーターを保管ほぼすべての血管組織15に存在します。脱顆粒は、そのようなヒスタミン、トリプターゼ、およびロイコトリエン15と薬理学的に活性なメディエーターの放出をもたらす膜結合顆粒のエキソサイトーシスである。寄生虫に対する防御だけでなく、アレルギー性喘息、および発がん応答15を開始することをマウントする上で重要であるI型過敏性反応の開始でこのプロセスは結果。

肥満細胞および好塩基球は、FcεRIを受容体、免疫グロブリンE（IgE抗体）17のための高親和性受容体を発現する。アレルゲンまたは抗原への曝露は、複数のIgE結合したFcεRIを受容体17の凝集を引き起こし、それがこのsであるチロシンリン酸化事象のカスケード、ホスホリパーゼC、内部貯蔵からのカルシウムの流出、およびセル18へのカルシウムの流入の活性化：脱顆粒プロセスを開始したIgEに結合したFcレセプターの"架橋" O-と呼ばれる。このカルシウム流入は、脱顆粒のために必要であり、さらに、顆粒のエキソサイトーシス15を起こす前に、膜と顆粒の融合を通知します。実験的に、カルシウムイオノフォアを直接本質的にすべてのシグナル伝達は、上流または下流のものとして毒物による経路標的の同定を可能にする、カルシウム流入工程20の前にステップ迂回細胞膜19を横切って往復カルシウムを使用することができカルシウム20に信号を送る 。

脱顆粒は、ヒスタミン6一緒に顆粒から直線的に放出される細胞上清の中にβ-ヘキソサミニダーゼの放出を監視することにより、迅速かつ効果的に測定された、しかし、私ができるシンプルな酵素 - 基質反応およびアッセイ蛍光生成物をするマイクロプレートリーダーを用いて検出するのははるかに簡単。このマイクロプレートアッセイ、プロトコル·セクションに詳述したように、最初にNaal らによって開発された堅牢な方法に基づいている。1で4 -メチル-N-アセチル-β-D-グルコ蛍光基質の切断を定量化β-ヘキソサミニダーゼ。私たちは、トリクロサンはここに強調​​して、薬や毒物の影響をテストするためのアッセイ法を変更しました。この方法は確実に脱顆粒を定量化する、例えば、フローサイトメトリーベースの検出方法21に安価な代替品であり、抗アレルギー薬の多種多様なハイスループットスクリーニングにうまく自分自身を貸すする可能性があるだけでなく、免疫毒性またはアレルギー物質。この最後の点は、21 世紀 、2007年の国立研究協議会報告書"毒性試験の観点から特に重要である：ビジョンとストラトEGY "（ http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970マウスのような伝統的な実験動物の高価な使用を減らすために、細胞培養を利用した高スループット毒性試験の開発のための提唱）。 Naal らによって開発された1、私達2によって変更された脱顆粒プロトコルは、相同なヒト粘膜肥満細胞または好塩基球3-5に広く受け入れられているモデルであるRBL-2H3細胞株を利用する。 （培養RBL-2H3細胞のための方法は、ハッチンソンらに詳述されている。22）。このアッセイは、おそらく接続されているすべての肥満細胞のタイプに適合させることができる。

トリクロサン（TCS）は、病院、パーソナルケア製品、および消費財23,24において30年以上に使用されている広域スペクトル抗菌薬である。 TCSの抗菌特性の作用機序は、エノイル-アシルを阻害することによって可能性が高い、脂肪酸生合成の阻害であるキャリアタンパク質レダクターゼ25,26。このようなシャワージェル、ハンドローション、歯磨き粉、うがい薬、および0.3％または10 mMの24までの濃度におけるハンドソープのような消費者製品の広い範囲で世界的に見られる。 TCSの普及は人間27-29や河川30で検出可能なレベルをもたらしました。 Allmyr らによって行われた研究27は、TCSとその代謝物は、授乳中の母親からプラズマとミルクの両方に存在していることを実証した。重要なのは、TCSは容易に皮膚31-37に吸収される。 Queckenberg ら 37は、肥満細胞が存在する皮膚にかなりの濃度で、その結果、12時間以内に人間の皮膚に〜70mMのTCSクリームの約10％の吸収を発見した。

TCSは、ヒトのアレルギー性皮膚疾患7-11を管理するために臨床的に示されているが、TCSが、アレルギー性皮膚疾患を緩和する機構は38知られていなかった。蛍光マイクロプレートアッセイを使用してdetailedがこのビデオでは、我々は最近、2μMという低濃度でTCSは、かなりこれらの臨床データ2のための潜在的な説明を提供して、マスト細胞機能と脱顆粒を減衰することを実証した。これらの臨床データの説明を提供することに加えて、パーマーら、我々の知見は、 図 2には、TCSがカルシウム流入の下流シグナル伝達分子標的とすることを示唆している。多くの免疫学的および他の生物学的プロセスにおけるカルシウムシグナル伝達の重要性のために、TCSは、潜在的に必要な生物学的プロセスの様々に悪影響を及ぼす可能性がある。実際には、Udoji ら 39は、TCSが別の重要な先天性免疫機能、ヒトナチュラルキラー細胞溶解活性を抑制することが示された。

アレルギー性皮膚疾患（または、逆に、免疫毒性など）で治療補助としての可能性を超えて、TCSもかく乱40-49内分泌かもしれません。このように、溶液中のこの化学物質を準備する方法についての明確な手順I毒物への興味のあるの。 TCSが小さい疎水性分子であるため、有機ビヒクルは、しばしば、水に溶けやすくするために使用される。 TCSがテストされているほとんどの毒性試験では、製剤は、エタノール、アセトン、または油2,50,51などの有機溶媒を用いて水に溶解関与している。しかし、しばしばこれらの溶剤は、それによって被験物質データ51の解釈を複雑にし、自分自身を生物学的に活性である。実際には、Rufli らによる。52等53は、水生毒性実験のための試験溶液は、毒性成果物を作成するための化学溶媒の電位により、化学的方法を介して物理的方法を用いて調製されることが推奨される。我々は以前TCSが0.24％のエタノール/水（体積/体積）中に溶解し、30分を減衰RBLマスト細胞の脱顆粒2超音波処理することを示した。 0.24％より高い濃度でエタノールが肥満細胞degraを抑制することが示されているnulation 54,55-examplesの毒性試験で有機溶剤の潜在的交絡効果の。

それだけではなく生物又は研究のために使用される細胞に対する溶媒の影響を考慮することが重要であるだけでなく、それは被験物質自体に溶媒の影響を監視することが重要である。たとえば、Skaare ら 51は、油中の解散は、関数の完全な損失を引き起こしながら、（一般的に歯磨きやうがい薬で見つかった）ポリエチレングリコールでTCSを溶解が健康な女性の女性の抗細菌および抗プラーク効果を弱めていることがわかった。したがって、異なる溶媒の能力はTCSを含む、毒物および薬物を調節するために、効果をアッセイ設計において考慮されるべきである。油または風味添加物の使用は様々な製品50,51におけるTCSの効果を妨げる可能性があります。

有機溶剤を使用する必要性を排除する目的で、我々は、有機ゾルの使用を排除することによってTCS 2を溶解させるための手法に改良ベント。現在のプロトコルでは、我々は熱（≤50°C）で水性緩衝液に直接TCS顆粒を溶解した後、紫外可視分光光度法によってこのTCSの株式の濃度を確認してください。 TCSは、40μM（最大水溶性であるため、これらの改良が可能であるhttp://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ）および50℃（加熱されたときに分解に抵抗することが示されているhttp:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ）56,57。 TCSも強く4,200 L /モル/ cmで12モル吸光係数が280nmの58で吸収することが知られているように、我々はまた、UV-可視分光測定の付加的な利点を有する。

このプロトコルは、低コストかつ迅速な検証を含む、有機溶剤を使用せずにバッファにTCS顆粒を溶解するために、シンプルでありながら効果的な方法を提供濃度、およびマスト細胞の脱顆粒に対する化学的影響を監視するための強力な蛍光マイクロプレートアッセイを説明しています。

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プロトコル

すべてのバッファレシピがプロトコルテキストの末尾の表に含まれていることに注意してください。

1日目 ：

1。細胞の調製

  1. エッジ効果を避けるために、レイアウト上の試験サンプルを中心に、96ウェルプレートセットアップ方式を計画。割り当て3は、各TCS濃度は（抗原またはイオノフォアの±脱顆粒刺激）テストだけでなく、自然放出（無顆粒刺激）に対して三連、最大放出（0.2％トリトンX-100 [TX]洗剤溶解）と同様に、のために複製井戸は、背景サンプル（無細胞を含まないでしょうが）のために予約。各反復実験の日に、TCSサンプル濃度の新しいランダムレイアウトを選択します。
  2. 37℃の水浴中で暖かいRBLメディア（レシピは、表に記載されている）およびトリプシン。
  3. 良いヒールの一般的な兆候をT-25フラスコ内のRBL細胞（2-4最後の通過日から、それらが解凍されてから3〜4ヶ月未満）をチェック目：メディアの色、濁りの欠如によって示され、適切なpH値。フラスコは、汚染がないことを、細胞が正常に合流健康表示され、主に付加ことを確認するために、光学顕微鏡下でフラスコを置きます。細胞は約6週間ごとに22マイコプラズマ汚染のためにチェックする必要があることに注意してください。
治療 三重
刺激され、0μMTCS A7、B7、C7、F4、G4、H4
刺激され、0.001μMTCS F6、G6、H6
刺激され、0.1μMTCS A4、B4、C4
刺激され、1μMTCS A6、B6、C6
刺激し、5μMTCS F5、G5、H5
刺激され、10μMTCS A3、B3、C3
刺激され、15μMTCS A5、B5、C5
刺激され、20μMTCS G7 F7、H7
刺激され、加えて最高[TCS] F3、G3、H3
（モックを含む）いいえTCS、自発 A10、A11、A12、B10、B11、B12、A1、A2、A8、B1、B2、B8、C1、C2、C8、F1、F2、F8、G1、G2、G8、H1、H2、H8
TX-100、ノーTCS D10、D11、D12、E10、E11、E12
いいえ細胞はない、背景、プラス最高[TCS] G10、G11、G12、H10、H11、H12

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  1. 無菌組織培養（TC）フードにRBL細胞フラスコを取る。細胞は、ボットに接続されているフラスコのトム。 TCのフードの下で働いて、標準的な無菌技術を使用して、滅菌ピペットを用いてフラスコからすべてのメディアを取り出し、細胞がフラスコの底部に取り付けられたまま。次に、2 mlのトリプシンでフラスコをすすぎ、その後、この洗浄を捨てる。
  2. フラスコの底をカバーするために正確に2ミリリットルトリプシンを追加します。 5分間℃のインキュベーター、細胞がフラスコの底から切り離すことができるように37に入れた。
  3. 5分後、細胞を緩め、オープン手のひらでフラスコの側面を押してください。直ちに、フラスコから細胞を洗浄し、トリプシンをクエンチし18ミリリットルRBLメディアを追加。直ちにフラスコと新しい、無菌の50mlチューブ（このチューブの総容積は現在20ミリリットルである）への転送セルメディアトリプシン混合物を取り出します。
  4. 優しくしかし徹底的に混合した後、このチューブからの細胞懸濁液50μlを削除し、カウントされる試料は1.5 mlの滅菌マイクロ遠心チューブに移す。このサンプルを取るだけでなく、50ミリリットル0;ベンチにTCフードの細胞メディアトリプシン混合物を含むチューブ。
  5. 500×gで8分間遠心分離を50 mlチューブを（適切なバランスで）スピン、この力ペレット細胞を効果的に。
  6. スピンこの間、スピニング前単離したサンプル中の細胞を数える。これを行うには、最初の1.5 mlのチューブに細胞の50μlにトリパンブルー色素の50μlを添加し、ゆっくりとしかし徹底的に混在させることが5倍アップするピペットダウン。直ちに、ガラス血球計数器にこの混合物10μlを転送し、メーカーの指示に従ってグリッド領域内のセルを数える。合理的な統計結果には、少なくとも100個の細胞をカウントします。
  7. 戻るTCフードで、スピンダウンした細胞からの上清を除去します。
  8. セルチューブにフタをし、細胞を緩めチューブの底にペレットをフリック。
  9. 細胞数をもとにして0.5×10 6細胞/ mlの密度を得トリプシン処理細胞にメディアを追加する。
  10. メッキ手順中に懸濁された細胞を維持するために十分ですが優しく混ぜる。ピペットマンを用いて、プレートテンプレートシート続いて、96ウェルプレート（平、黒下）に100μl/ウェルの細胞を入れた。細胞は、系統誤差を回避する、三ウェルの各セットが追加された後に混合するためのウェルに添加する方法をランダム化する。背景サンプルのラベルが付いウェルに細胞を入れないようにしてください。
  11. 一度すべてのセルが転送された、プレートにプレートカバーを置き、一晩（37℃/ 5％CO 2）インキュベーターに移す。標準無菌続くクリーンアップします。

2日目 ：

2。トリクロサンの調製

  1. ラベルの付いた500ミリリットルの三角フラスコにメスシリンダー、測定250mlのタイロードバッファーを（表に記載されているレシピ）を使用して、 "TCS-バッファ。"バーをかき混ぜる追加。 TCSでの使用のみのために指定棒、温度計をかき混ぜる、ガラス製品を使用してください。
  2. また、この時、測定値250別の500mL三角フラスコにミリリットルタイロード、ラベルの付いた "制御バッファ。"使用ガラス製品は、バー、TCS用に指定されていない温度計をかき混ぜる。バーをかき混ぜる追加。
  3. TCS顆粒と "TCS-バッファ"フラスコ（250mlのタイロードバッファーを含む）への転送0.0022グラムを秤量する。効率的に三角フラスコに顆粒を転送するためには、すべてのTCSが転送されたことを確認し、ボートを量る洗い落とすために測定された250mlのタイロードから10ミリリットルを使用しています。
  4. 場所組み合わせホットプレート/磁気攪拌プレート上に "TCS-バッファ"フラスコ、およびmanageably高速で攪拌し、それを設定してください。一度よく混合、このTCSストックは公称30μM（実際の濃度は、加熱後に計算されます）になります。 （化学ヒュームフード内のすべてのミキシングを行います。）
    1. また、この時点で、第二の組み合わせホットプレート/磁気撹拌プレート上に "バッファコントロール"フラスコない（TCSを含まない）を配置し、同様の速度で攪拌するように設定する。
  5. 後で使用するために、ランプをウォームアップするUV / Visのランプをオンにします。
  6. 絶えず攪拌しながら50℃に "TCS-バッファ"ソリューションを熱し。かつて最大90分間温度、時間に。 90分の間、頻繁に50℃の温度、適切な撹拌速度を監視し続けています。
    1. 同時に、°C連続的に攪拌しながら50に "制御バッファ"ソリューションを（プレーンタイロードバッファーのちょうど250ミリリットルです）加熱。 50に到達すると、時間温度（50℃で維持し）、撹拌を監視する両方その間°C、90分間の時間、。
  7. 90分の終わりには、ホットプレートや卓上への転送をオフに三角フラスコの両方を取る。
  8. ブランクマシンが加熱 "TCS-バッファ"液1mlをスキャンする前に加熱 "制御バッファ"溶液1mlに、UV /可視分光光度計で波長スキャン機能を使用する。 、スペクトルの形状を確認する280nmでのDレコード吸光度値。濃度を決定するために、ランベルト·ベールの式を使用します（A 280 =ε280ℓc）のεを使って4200の280 L /モル/ cmで12と1cmのℓ。
  9. TCSの濃度を決定した後、 "TCS-バッファ"ソリューションの残りの249ミリリットルに0.249グラムのウシ血清アルブミン（BSA）を追加し、よく混ぜる。
    1. 同時に、 "制御バッファ"ソリューションの残りの249ミリリットルに0.249グラムBSAを追加し、よく混ぜる。

2日目 ：

3。 RBL-2H3細胞を用いた抗原刺激脱顆粒アッセイ

  1. 開始する前に、使用されているすべてのバッファのpHをチェックし、彼らは曇り明確ではないことを確認してください：これはタイロード緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、およびグリシン炭酸バッファー（レシピは表に記載されている）が含まれています。
  2. 37暖かいRBLメディアおよびトリプシン℃の水浴。
  3. BTを（1 mg / mlのメイク0;タイロード緩衝液中のBSA）：0.05グラムBSA + 50ミリリットルタイロード緩衝液（X2）。 37℃の水浴に入れた。
  4. BTの3.136ミリリットル+ 10％の64μlのトリトンX-100（トリトンX-100の最終濃度は0.2％です）トリトンX-100 0.2％を加えます。反転でよく混ぜますが、ボルテックスしないでください。 37℃の水浴に入れた。
  5. 。TCS、温水タイロードバッファー（ステップ"2、"上記） 注の準備を開始します。 "TCS-バッファ"と"制御バッファ"ソリューションは、50℃で攪拌されるまで、次のステップ（IgEの露出を）開始しないでください90分ヒート/攪拌時間の最初の70分。
  6. 両方の溶液を70分間50℃で攪拌された後、（100μl/ウェル）感作であることがサンプルウェルのためにRBLのメディアでは0.1μg/ mlの抗DNPマウスIgE抗体（Sigma）を構成しています。 4℃で保存した場合、IgEの在庫が30日以上経過してはいけません℃、在庫があるか古いレコード。混在させるフリックが、ボルテックスしないのIgEを行う。
  7. TCのボンネットの下に、を50mlチューブに6ミリリットルRBLメディアに0.6μlのIgEの株式を（在庫が1 mg / mlのです）を追加します。第二の50mlチューブでは、唯一の平野RBLメディア（非感作のサンプルのために意図されている）の6ミリリットルを追加します。
  8. シンクに96ウェルプレート（1日目に調製した）から、すべてのメディアをダンプし、TCのボンネットの下にプレートを持参。
  9. ランダム（48ウェル合計）刺激されるべきであるウェルに100μlのメディア/ IgEの混合物を追加します。この混合物は、 "自発的"、 "TX"、および "背景"のサンプルについては意図されていない。
  10. ランダムにのみ、 "TX"、 "自発的"と "背景"ウェルに100μlの平野RBLメディアを追加。
  11. プレートにプレートカバーを入れて、その後1時間℃のインキュベーター、5％CO 2/37にプレートを移動します。
  12. 3.24から1時間のインキュベーションの間、手順3.13に従ってください。
  13. ベンチでは、抗原希釈液を準備します。 1.6 mg / mlの株式DNP-BSA + 850μlの＆＃の0.53μLを追加160、BTは1μgの/ mlのの抗原濃度を取得する。渦と混合し、この株式を反転。
  14. かつて "TCS-バッファ"と "制御バッファ"加熱された後、50℃で90分間撹拌°C、TCSプロトコル（ - 2.8.1ステップ2.6に行く）準備の残りの部分を続行。 BSAは、両方のソリューションに溶解させた後、以下に続ける。
  15. ±銀、±TCSと、露出バッファの準備を開始。まず、 "TCS-バッファ"ソリューション（すでに90分間加熱攪拌されたこと）、新しい50 mlコニカルチューブに移す50mlを249ミリリットルサンプルから。これを50mlアリコート20μlのを削除し、0.0004μgの/ mlのDNP-BSAの最終抗原濃度のため、以前の準備1μgの/ mlの抗原20μlのと交換してください。ボルテックスと反転。
    1. ラベルはこの "チューブ1、ハイTCS / +銀/ + BT。"それは希釈し、最高TCS濃度曝露のために使用されます。
  16. "制御バッファ"ソリューションの249ミリリットルのサンプルから、新しい50 mlチューブに50ミリリットルを転送。この新しい50mlのアリコート20μlのを削除し、0.0004μgの/ mlのDNP-BSAの最終抗原濃度のため、以前の準備1μgの/ mlの抗原を20μlと交換してください。ボルテックスと反転。
    1. ラベルはこの "チューブ2、ノーTCS / +銀/ + BT"。 TCSの希釈と0μMTCS濃度露光に用いられる。
  17. 今 "TCS-バッファ"溶液50mlを取り出し、別の50 mlのチューブに入れた。この新しい50mlのアリコートから20μLを取り外し、平野BT20μlのと交換してください。ボルテックスと反転。いいえ抗原は追加されません。
    1. この "チューブ3、ハイTCSなし/銀/ + BT。"これは背景に使用されます。ラベルを付け
  18. 別の50 mlのチューブに "制御バッファ"溶液50mlを転送します。このNEから20μLを取り出す W 50mlのアリコートと平野BT20μlのと交換してください。ボルテックスと反転。 （いいえ銀は追加されません。）
    1. この "チューブ4、ノーTCSなし/銀/ + BT。"これは背景と自発のサンプルに使用されます。ラベルを付け
BSA TCS 抗原
チューブ1 figure-protocol-2ハイ[] figure-protocol-3
チューブ2 figure-protocol-4 NO figure-protocol-5
チューブ3 / files/ftp_upload/50671/check.jpg "幅=" "15px /> ハイ[] NO
チューブ4 figure-protocol-6 NO NO
  1. "TCS-バッファ"株式の濃度を決定した後、希釈用のボリュームを計算し、記録する。各希釈濃度の総ボリュームは、1ミリリットルでなければなりませんし、滅菌マイクロチューブに準備する必要があります。校正されたP2およびP1000ピペットマンを使用してください。
濃度 ハイトリクロサン+タイロード+ BSA 0.0004μgの/ mlの銀
（上からチューブ1） 		加熱BT 0.0004μgの/ mlの銀
（上からチューブ2）
20μM
15μM
10μM
5μM
1μM
0.1μM
0.001μM
0μM（プレートの上部） ----------------------- 500μlを加えて別の500μlの
0μM（プレートの底） ----------------------- 500μlを加えて別の500μlの
  1. 1-HRのIgEインキュベーション後、インキュベーターからプレートを取り出してシンクにすべてのメディアを投げる。 （注：テストの化学物質が消費者製品TCSよりも毒性があることが知られている場合、有害な廃棄物処理が必要になることがあります。）
  2. Combitipを使用して、ランダムにBSA-タイロード緩衝液（200で96ウェルプレートに細胞を洗浄/ウェル）。付着した細胞を乱すことを避けるために、むしろ直接接続されているセルの上にも、井戸の側面に洗浄バッファーを解放します。プロセスをもう一度繰り返します。
  3. アプリケーション、渦の治療を準備し、右のプレートに添加する前に希釈を反転させる。
  4. プレートの上部のセクション以降では：ランダム対応するウェルに抗原溶液200μlの各（TCSの正しい濃度）の三重を追加します。プレートの底に進みます。プレート上のすべての "モック"を "制御バッファ"ソリューションプラスのAg（上記の "チューブ2"から）を追加します。
  5. 対応するウェルに適切な解決策を200μlを追加します。
    1. 0.2％トリトンX-100 "TX"に、指定されたウェルを200μlを加える。
    2. 次に、プレートの "バックグラウンド（BKGD）最高TCS"というラベルの付いた3ウェルにチューブ3を200μlを加える。
    3. 最後に、200μlのを追加チューブの4〜6ウェルは "自発的"というラベル
  6. 37℃/ 5％CO 2で1時間プレートをインキュベートする。
  7. 1時間のインキュベーション中：氷の2つのバケット（インキュベーター内で "古い"プレート用と新しいプレート用1）を取得します。それは光に敏感であるため、ホイルに保つ最大40分室温で解凍4 - メチル-N-アセチル-β-D-グルコ（4-MU）、。
    1. 一度4-MU在庫が解凍されて、4-MUワーキングソリューションを構成する：150μlの株式+冷たい酢酸緩衝液の14.85ミリリットル（表に記載レシピ）、渦と反転。ホイルに包まれた50ml遠心管、および使用するまで氷上で保管してください。
    2. Combitipを使用すると、ランダムにNEWグルニエ黒96ウェルプレート（アイスバケット＃2上の）の各ウェルの一番下に100μlの冷たい4-MUワーキングソリューションを追加。 、ランダムトリトンX-100ウェル内に、ランダムプレートの底内に、プレートの上部内でランダム作動溶液を添加することによって最初に起動そして最後にランダムに背景井戸内。
    3. 次のステップのためのP200チップの新しいボックスを入手してください。
  8. 1時間のインキュベーションの終わりには、良好な混合のためのよく回ったが混合しながら細胞に触れていない、（静かに、気泡を導入していません）4-5X上下アイスバケット＃1、ピペット上澄みにインキュベーターからセルプレートを置く。体系的に、基板（サンプルの同じ順序は、当初出予定）で新しいプレートに各ウェル場所から25μlのサンプルを取り出す。ときに、新しいウェル内の気泡を導入することなく、徹底的にサンプルを混ぜて上下ピペット。
  9. 37℃/ 5％CO 2で30分間インキュベートする。
  10. 30分間のインキュベーションの後、ランダムに325μlの合計に井戸を埋めるために、ウェル当たりコールドグリシン - 炭酸塩緩衝液200μlを（Combitipを使用）を追加します。 （トリトンX-100波及を回避するために、この添加は、トリトンX-100サンプルの最後にしてください）​​。プレートを読む前に気泡をチェック（クリーンP10ピペットで突くTE先端）は、任意の気泡をポップする。
  11. （セクション4へ）蛍光プレートリーダーでプレートを実行します。

2日目 ：

4。蛍光プレートリーダーの命令とデータ解析

  1. GEN5プログラム、オープン実験セクションを開きます。
  2. プレートリーダーとインサートプレート（左上隅がA1である）をオンにします。
  3. プロトコルfigure-protocol-7手順figure-protocol-8カスタム測定値を設定するために読んでください。各ウェルからの生の蛍光データを収集するためにサンプルを、複製などについては何も追加しないでください。
  4. トップ50％を選択し、 "蛍光"、 "エンドポイント"、 "ノーマルスピード"、 "ゲイン40"、 "励起40分の360"、 "エミッション40分の460、"光学の位置を "読む"の下。光学トップオフセット：7メートルM。いいえぶれなし、遅延、無動力、よくないモニター、温度：インキュベーターオフ。
  5. フラットブラックボトム、96ウェルプレート（グルニエ96ウェル、平底）を選択します。
  6. プレートレイアウトとのディール：プロトコルfigure-protocol-9プレートレイアウト。繰り返し、希釈などを示すことなく、サンプルをセットアップする
  7. プレートfigure-protocol-10読み。
  8. ファイルを保存します：Excelにデータファイルをエクスポートします "エクセル"ボタンをクリックします。プレートレイアウトのためにとマトリックスのためにこれを行う。コンピュータとUSBドライブ上のファイルを保存します。
  9. Excelで、トリトンX-100の井戸を含むすべてのサンプルからの読み取りの平均バックグラウンドを減算します。
  10. 平均トリトンX-100の値で（すでにバックグラウンドを差し引いたた）それぞれの値を分割することによって、相対％の脱顆粒を計算し、その割合にするために100を掛けます。
  11. 平均は、すべて三連、標準偏差を計算します。平均値としてExcelのグラフのデータ値±標準偏差。統計的なテストのために、グラフパッドによってPrismソフトウェアになりました移動します。

2日目 ：

5。 RBL-2H3細胞を用いたイオノフォア刺激脱顆粒アッセイ

  1. 上記のように指示し、 "細胞の調製"のためのプロトコル（第1節、1日目）と "トリクロサンの調製"（第2節2日目）に従う。イオノフォア刺激のためのプレートレイアウト例を以下に示す。
治療 三重
刺激され、0μMTCS A7、B7、C7、F4、G4、H4
刺激され、0.001μMTCS F6、G6、H6
刺激され、0.01μMTCS F3、G3、H3
刺激され、0.1μMTCS A4、B4、C4
刺激され、1μMTCS A6、B6、C6
刺激し、5μM[TCS F5、G5、H5
刺激され、10μMTCS A3、B3、C3
刺激され、15μMTCS A5、B5、C5
刺激され、20μMTCS G7 F7、H7
DMSO、無TCS（モックを含む）と、自発 A10、A11、A12、B10、B11、B12、A1、A2、A8、B1、B2、B8、C1、C2、C8、F1、F2、F8、G1、G2、G8、H1、H2、H8
DMSO、無TCSとTX-100、 D10、D11、D12、E10、E11、E12
いいえセルの背景ない、DMSOと、プラス最高[TCS] G10、G11、G12、H10、H11、H12

figure-protocol-11
大きな画像を表示するには、ここをクリック 。

  1. 開始する前に、使用されているすべてのバッファのpHをチェックし、それらが明確で曇っていないことを確認してください。タイロード、酢酸ナトリウム緩衝液、およびグリシン炭酸塩緩衝液（レシピはテーブルに設けられた）。
  2. 50ミリリットルのタイロードバッファーに0.05グラムBSAを追加することで、よく混ぜてボルテックスでBTの1 50ミリリットルコニカルチューブを準備します。 37℃の水浴中でインキュベートする。
  3. 10％トリトンX-100〜4.704ミリリットルBTの96μLを加えることにより0.0032% DMSO（最終カルシウムイオ車両濃度）で、0.2％トリトンX-100を加えます。よく混ぜる。次に、この溶液を0.155μLを取り出して捨てる。今100％DMSOの0.155μlの後ろに追加します。
  4. イオノフォアバイアルに新鮮な100％DMSO400μlのを追加して混合するボルテックスすることにより粉末からA23187イオノフォアの5mMの株式（2.5 mg / mlの）を準備します。一度溶液中で、1.5 mlコニカルチューブ、記録の内容と今日の日付と有効期限（準備から3ヶ月-20℃で適切に保存されている）に転送。
    1. また、氷の上で今日の凍結ストックを使用している場合は、解凍、および5mM A23187イオノフォアはよく混合し、明確であることを確認します。渦、フリック、および使用する前に、この株式を反転。 ＃このA23187の準備とロトの基準日。
  5. かつて "TCS-バッファ"と "制御バッファ"は加熱して90分間攪拌してきた、TCSプロトコル（手順2.6-2.8.1に行く）準備の残りの部分を継続する。 BSAは、両方のソリューションによく混合した後、残りのプロトコルの手順を続行します。
  6. "TCS-バッファ"液249ミリリットルのサンプルから、新しい50 mlコニカルチューブに50ミリリットルを転送。 50ミリリットルのアリコートの1.8μLを外し、5 mMのイオノフォア株式の1.8μLを加える。ボルテックス8秒3倍と3倍の反転。ファイナルイオノフォア濃度は1です80 nmである。 A23187のこの濃度は、株式効力によって異なりますので注意してください、とA23187イオノフォア用量応答がRBL-2H3に非細胞毒性として同定されているおよそ20％の最大放出の脱顆粒のレベルを惹起A23187の濃度を特定することをお勧めします細胞毒性アッセイによる細胞（2参照）。
    1. この "チューブ1、ハイTCS / +イオノフォア/ + BT。"希釈と最高TCS濃度暴露に使用するラベル。
  7. "制御バッファ"ソリューションの249ミリリットルのサンプルから、新しい50 mlコニカルチューブに50ミリリットルを転送。 50ミリリットルのアリコートの1.8μLを取り出し、5 mMのイオノフォア株式の1.8μlの後ろに追加します。ボルテックス8秒3倍と3倍の反転。イオノフォアの最終濃度が180 nMである。
    1. ラベルは、この "チューブ2、ノーTCS / +イオノフォア/ + BT。"これは、希釈して0μMTCS濃度のために使用されます。
  8. Rの249ミリリットルのサンプルから 20、TCS-バッファ "ソリューション、新しい50 mlコニカルチューブに50ミリリットルを転送。新しい50ミリリットルのアリコートの1.8μLを取り出し、100％DMSOの1.8μLを加える。ボルテックス8秒3倍と3倍の反転、無イオノフォアが追加されます。
    1. ラベルは、この "チューブ3、ハイTCS /いいえイオノフォア/ + BT / + DMSOは";背景に使用されます。
  9. "制御バッファ"ソリューションの249ミリリットルのサンプルから、新しい50 mlコニカルチューブに50ミリリットルを転送。新しい50ミリリットルのアリコートから1.8μLを取り出し、100％DMSOの1.8μLを加える。ボルテックス8秒3倍と3倍の反転。いいえイオノフォアは追加されません。
    1. ラベルは、この "チューブ4、TCS /ノーイオノフォア/ + BT / + DMSOいいえ";自発リリースサンプルに使用されます。
BSA TCS イオノフォア追加された100％のDMSO
チューブ1 "SRC =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "幅=" 15px "/> ハイ[] figure-protocol-12 NO
チューブ2 figure-protocol-13 NO figure-protocol-14 NO
チューブ3 figure-protocol-15ハイ[] NO figure-protocol-16
チューブ4 figure-protocol-17 NO NO エックマーク "のfo：コンテンツ幅=" "SRC =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "幅=" "15px />で.1
  1. "TCS-バッファ"株式の濃度を決定した後、希釈用のボリュームを計算し、記録する。校正されたP2およびP1000ピペットマンを使用してください。各希釈濃度の合計体積1mlのであるべきであり、滅菌マイクロ遠心チューブ中で調製されるべきである。
濃度 ハイトリクロサン+タイロード+ BSA 180 nMのA23187（チューブ1上から） 加熱BT +180 nMのA23187（チューブ2上から）
20μM
15μM
10μM
5μM
1μM
0.1μM
0.001μM
0μM（プレートの上部） ---------------------------------- 500μlを加えて別の500μlの
0μM（プレートの底） ---------------------------------- 500μlを加えて別の500μlの
  1. インキュベーターのメッキ昨日の細胞を取り出して、シンクにメディアを空にします。 Combitipを使用すると、ランダムにBTと96ウェルプレート（200μL/ウェル）で細胞を洗浄する。洗浄をもう一度繰り返します。
  2. アプリケーション、渦の治療を準備し、右のプレートに添加する前に希釈を反転させる。プレートの上部のセクションで始まる：ランダムcorrespoに200μlに三重TCSの正しい濃度のそれぞれを追加よくnding。プレートの底に進みます。プレート上のすべての "モック"を "制御バッファ"ソリューションプラスA23187を（ "チューブ2"上から）を追加します。
  3. 対応するウェルに適切な解決策を200μlを追加します。
    1. 0.2％トリトンX-100 "TX"に、指定されたウェルを200μlを加える。
    2. 次に、プレートの "バックグラウンド（BKGD）最高TCS"というラベルの付いた3ウェルにチューブ3を200μlを加える。
    3. 最後に、ラベルの付いたチューブ4〜6のウェルを200μl加える "自発的に。"
  4. 37℃/ 5％CO 2で1時間プレートをインキュベートする。
  5. 1時間のインキュベーション中：氷の2つのバケット（インキュベーター内で "古い"プレート用と新しいプレート用1）を取得します。それは光に敏感であるため、ホイルに保つ最大40分室温で解凍4 - メチル-N-アセチル-β-D-グルコ（4-MU）、。
    1. 一度4-MU在庫が解凍されて、4-MUワーキングsolutiを作る上：150μlの株式+ 14.85冷たい酢酸緩衝液（表に記載レシピ）、渦と反転。ホイルに包まれた50ml遠心管、および使用するまで氷上で保管してください。
    2. Combitipを使用すると、ランダムにNEWグルニエ黒96ウェルプレート（アイスバケット＃2上の）の各ウェルの一番下に100μlの冷たい4-MUワーキングソリューションを追加：上部の内ランダムに実用的なソリューションを追加することで、最初に起動ランダムにプレートの底内、ランダムにトリトンX-100井戸の中、最後にランダムに背景井戸内プレート、。
    3. 次のステップのためのP200チップの新しいボックスを入手してください。
  6. 1時間のインキュベーションの終わりには、良好な混合のためのよく回ったが混合しながら細胞に触れていない、（静かに、気泡を導入していません）4-5X上下ピペット上清、第1位アイスバケットにインキュベーターからセルプレートを置く。体系的に、基板と各ウェルと場所から新しいプレートに25μlのサンプルを取り出し（同じSAの順序mples、当初）を計画した。ときに、新しいウェル内の気泡を導入することなく、徹底的にサンプルを混ぜて上下ピペット。
  7. 37℃/ 5％CO 2で30分間インキュベートする。
  8. 30分間のインキュベーションの後、ランダムに325μlの合計（トリトンX-100波及を回避するために、最後のトリトンX-100をサンプルに、この付加を作る）に井戸を埋めるために、ウェル当たり200μlの冷たいグリシン - 炭酸バッファー（Combitipを使用）を追加します。プレート（任意の気泡をポップするために、クリーンP10ピペットの先端で突く）を読む前に気泡を確認してください。
  9. （第4章のすべての手順に従ってください）​​蛍光プレートリーダーでプレートを実行します。

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結果

90分間50℃に加熱すると、TCSのためのUV-可視吸収スペクトルは図1に示すように、280nmの付近のピークで、260〜300nmの間の強力な、滑らかな曲線を生成する。 UV-可視分光光度計は、従って、280nmで公開されてモル吸光係数が4,200 L /モル/ cmで12であるので、濃度を計算するために利用することができる重要なツールである。我々は、TCSが50°Cに加熱した（データは示さず）後に、全体の脱顆粒実験の時間枠の間に溶液から脱落しないことを見出した。

マストから解放β-ヘキソサミニダーゼのレベルを記録し、このアッセイは、水性緩衝液に直接TCSを溶解するために、この加熱法を使用した後、我々はNaal らから最適化された蛍光ベースのアッセイを用いて肥満細胞の脱顆粒にTCSの効果を検討した。1蛍光発生基質産物を検出することにより、一時間のインキュベーション後の細胞。 DNP-BSによって脱顆粒に刺激するかどうか抗原（ 図2）やカルシウムイオノフォアA23187（ 図3）は ...

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ディスカッション

2004年に、Naal ら は、脱顆粒1の高スループット試験のため、肥満細胞バイオセンサーを開発した。それは私達が私達のTCS研究のために適応され、このビデオで詳述していることを堅牢アッセイである。前にNaal ら 1アッセイ、マスト細胞の脱顆粒が日常β-ヘキソサミニダーゼ59-61によって評価が、これらの初期の方法は、一つのサンプルを一度に読み込みされた蛍光光度計を利用した。されていた重要なのは、Naal ら 。マイクロプレートリーダーおよびサンプルは蛍光光度計の1つずつを読んでされた以前の方法を利用してそれらのよりハイスループットな方法との間の直接的な一致を確立した。要するに、Naal ら 1が大幅同様にワークフローにいくつかの変更を組み込むことにより、ハイスループットマイクロプラットフォームにそれを適応させることでスピード、パワー、シンプルさ、および検定の信頼性を向上させた。ここでは、ここでさらに、具体的には、様々なテストの化学物質の研究のために、このアッセイを適応している、ユビキタス薬TC...

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開示事項

我々は、開示することは何もありません。

謝辞

LMWとRHKは生物医学科学と工学（GSBSE）のUMaine大学院によってサポートされています; RHKもメイン農業＆森林試験場によってサポートされていました。追加資金は、一般医科学研究所（NIH P20-GM103423）、メイン州農業＆フォレスト実験ステーション（グラント番号ME08004-10、JAG）、メインADVANCEライジングタイドセンター（NSFグラント＃1008498）大学によって提供されました、とPhRMAの基礎（JAG）から薬理/毒性の研究スターターグラント。私たちは、博士に感謝します。抗原およびセルのデイビッドHolowkaとバーバラベアード。我々は、機器と注文のヘルプのためのひなハシミ、アレハンドロベレス、とアンドリューAbovianに感謝しています。これは、メイン州農業＆森林試験場公開番号3311です。

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材料

プラスチック材料:
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント

RBL-2H3 細胞

ATCC

CRL-2256

私たちが使用した細胞は贈り物でしたが、ATCC

<また>p align="center">Triclosan/Irgasan

Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

低湿度環境で保管する必要があります

Trypsin

Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

Lonza

12-611F

Fetal Bovine Serum

Atlanta Biologicals

S11150

ゲンタマイシン硫酸塩

Lonza Biological Sciences

17-518

アルブミン、ウシ血清

Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)

Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

塩化マグネシウム

VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucose

Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

塩化カリウム結晶

J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

塩化カルシウム二水化物

Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

グリシン

Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-メチルウンベリフェリル-N-アセチル-&β;-D-グルコサミニド (4-MU)

EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

ホイルで包む – 感光性です

アンチDNPマウスIgE

Sigma

D8406

試薬の濃度は1 mg / mlです。アリコート25µl 試薬を別々の微量遠心チューブとパラフィルムに入れます。アリコートを-20°Cで保管します。使用されていないCと2-8°Cで使用されているアリコートを保管します。C for only longer than 1 month.

DNP-BSA

コーネル大学のデビッド・ホロウカ博士とバーバラ・ベアード博士からの贈り物

提案:ライフサイエンスDNP-BSAカタログ#A23018

>

カルシウムイオノフォアA23187

グマ

C75-22-1mg

イオノフォアは、400 µl 新鮮な100%DMSOをイオノフォアバイアルに注入し、-20°Cに保ちます。C

注:3か月の有効期限を過ぎたイオノフォアを正常に使用しました

DMSO

Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

酢酸

VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

無水炭酸ナトリウム

Sigma

222321

CAS# 497-19-8

塩化ナトリウム

Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

塩酸

VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

参照バッファー、pH 7

VWR

BDH5046

>

基準バッファー、pH 10

VWR

BDH5072

Reference バッファー、pH 4

VWR

BDH5018

>

pH電極ストレージソリューション

VWR

14002-828

Equipment:

DU 7500分光光度計

Beckmann

販売終了

Synergy 2 プレート リーダー

Gen5 マイクロプレート データ収集および分析ソフトウェアを使用

BioTek

モジュール S

血球計算量計

HausserScientific

3110

7 x 7 CER HOT/STIR 120 V

ホットプレート/マグネティックスタープレートの組み合わせ

VWR

97042-634

Centrifuge

Eppendorf

5430

組織培養水浴

VWR

Model# 89032-206

組織培養生物学的安全キャビネット

SafeGARD(TCフード)

The Baker Company

Model# SG403A-HE

組織培養インキュベーター

ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

VWR

範囲: P2-P1000

Balance

メトラー・トレド

Model# AG204

pH meter

Symphony/VWR

Model# SB70P

Pipet-Aid

DrummondScientific

4-000-100

>

Combitip dispenser

Eppendorf

4981 000.019

レシピ:

酢酸緩衝液、pH 4.4

0.12 M酢酸を作り、10 N NaOHでpH 4.4まで滴定します。これは、5.3 mLの氷酢酸を1 LのMilliQ水に含んだものです:(1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml、氷河の密度が1.37 g/mlであるため

滅菌フィルターをオートクレーブ処理したガラス瓶に入れます

基板(4-MU)

Sigma M-2133、 250 mg、C18H21NO8、FW 379.4 CAS (37067-30-4) -20°Cで保存;Cストック:0.12 MのDMSO(1 mL DMSOに46 mg)、37°Cまで温めます。C、ボルテックス、10分間超音波処理します 温水と水浴ソニケーターで、再びボルテックス

各実験について、アセテートバッファー(100倍希釈)で基質の新鮮な溶液を作り、アセテートバッファーの最終濃度1.2 mM

グリシン炭酸塩バッファー、pH 10

26.7 gグリシン47.1 g無水炭酸ナトリウム1 Lに脱イオン水を加えます。 pHを10

滅菌フィルターをオートクレーブ滅菌ガラス瓶

チロデス(2 L)、pH 7.4

135 mM NaCl:15.78 g(または270 mlの1 M)5 mM KCl:10 mlの1 Mストック1.8 mM CaCl2: 7.20 ml の 0.5 M ストック 1 mM MgCl2: 4.00 ml の 0.5 M ストック 5.6 mM グルコース: 2.02 g (1 M 11.2 ml) 20 mM HEPES: 40 ml の 1 M ストック 濃縮 HCl pH を使用 ~9.7-7.4

滅菌フィルターをオートクレーブ滅菌ガラス瓶に入れます

RBL Cell Media

牛胎児血清(FBS、-20°Cで保存。C)37°Cで約4時間。Cウォーターバス 標準的な滅菌技術に従って、L-グルタミンを含む1 Lの最小必須培地(MEM)を取り出します(Earle'と800 ml MEMを持つためにいくつかのMEMを注ぎ、200 mLの温かいFBSを追加します 滅菌ピペットで1 Lの培地に1 mlの硫酸ゲンタマイシン抗生物質を追加します オートクレーブされ、細胞培養使用のみのためにマークされた培地ボトルのみを使用してください。

滅菌フィルター(0.2 mm)をオートクレーブ処理ガラス瓶に入れます

<

200 & micro;l 96ラック

VWR

53509-009

polypropylene

1,000 & micro;l HighRecovery

VWR

89003-420

polyethylene

10 µl マイクロチップ低結合滅菌

VWR

14217-704

ポリプロピレン

高G力のための使い捨て/円錐形微量遠心チューブ

VWR

20170-038

ポリプロピレン

使い捨て/目盛り付き/円錐形/滅菌 50 ml スクリューキャップ付き遠心分離管

VWR

21008-178

ポリプロピレン

使い捨て/目盛り付き/円錐形/滅菌15ml スクリューキャップ付き遠心チューブ

VWR

21008-103

ポリプロピレン

CELLSTAR 組織培養処理済みT-25フラスコ(フィルターキャップ付き)

Greiner Bio One

690175

ポリスチレン

CELLSTAR 組織培養処理済み T-75 フラスコ フィルターキャップ付き

Greiner Bio One

658175

ポリスチレン

CELLSTAR 10 ml 紙/プラスチック包装血清ピペット

Greiner Bio One

607180

ポリスチレン

CELLSTAR 2 ml 紙/プラスチック包装血清ピペット

Greiner Bio One

710180

ポリスチレン

CELLSTAR 5 ml 紙/プラスチック包装血清ピペット

Greiner Bio One

606180

ポリスチレン

CELLSTAR 25 ml 紙/プラスチック包装血清ピペット

Greiner Bio One

760180

ポリスチレン

1cmキュベット

N/A

N/A

ポリスチレン

CELLSTAR、96W マイクロプレート、組織培養処理済み、黒、蓋付き

96-well Plate

Greiner Bio One

655086

ポリスチレン

Combitips

Eppendorf

022266501

ポリプロピレン/

ポリエチレン

シtd colspan="4">

参考文献

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