コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス

サマリー

Transsynaptic tracingは、多シナプス回路を通じて周辺標的を調節する中心遠心性神経を分析するための強力なツールとなっています。ここでは、シナプス経性偽狂犬病ウイルスを利用して機能的な脳回路を同定し、局在化するプロトコルと、同定されたニューロングループ間の回路内の特定の接続を検証するための古典的なトラクトトレース技術を紹介します。

要約

経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス^{（PRV）1を利用して}脳内で使用されています。 PRVは、ヒトを含む大型類人猿を、感染していないので、それは、最も一般的に小型哺乳類、特にげっ歯類での研究で使用されています。仮性狂犬病株PRV152は、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子を発現し、逆行だけ離れた感染部位から^2,3シナプス結合の階層的なシーケンスを機能的シナプスを横切ります。他のPRV株は、異なる微生物学的特性を有し、両方向（PRV-ベッカーとPRV-カプラン^）4,5に搬送することができます。このプロトコルは、PRV152を独占的に扱います。筋肉のような末梢部位にウイルスを送達することによって、それがTへのウイルスの侵入を制限することが可能です神経細胞の特定のセットを通じ、彼は脳。脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンを解決します。仮性狂犬病ウイルスを使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な識別されたネットワーク内の特定の接続を解釈させるように、私たちは使用して識別されたセル間の接続を確認するために、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用する高感度かつ信頼性の高い方法を提示PRV152。彼らは、遠位樹状突起^6-11を含む細胞プロセスを明らかにするのに効果的であるため、ペルオキシダーゼおよびDAB（3、3'-ジアミノベンジジン）とBDAとCTbをの免疫化学的検出を選択しました。

概要

経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス（PRV）、PRV-バーサは、最初1961 ^12に記載とりわけ弱毒株を利用して、げっ歯類の脳に使用されている。ここでは、特定の筋肉の運動皮質の表現を識別するためのプロトコルを提示強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子^{2を発現する組換え}仮性狂犬病ウイルス株（PRV152）を使用して、または筋肉群。記載されている方法は、クロスシナプスが機能回路^3,4,13内の他のニューロンに感染することは感染性の子孫を生み出す神経向性ウイルスの挙動を利用しています。 PRV-バーサと同質遺伝子であるPRV152は、唯一の^<離れ感染部位^3,5からのシナプス結合の階層的なシーケンスを逆行性シナプスを横切ります/ SUP>。正確感染末梢部位を制御することにより、運動ニューロンの特定のサブセットを介して脳へのウイルスの侵入を制限することができます。ウイルス順次接続されているニューロンのチェーンに感染したように、脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンのネットワークを解決します。

ニューラルトレースのウイルスを使用することのさらなる利点は、感染細胞内のレポータータンパク質（この場合はEGFP）の増幅です。この信号増幅も疎突起の検出を可能にする感度のレベルを提供します。例えば、ウィスカーを制御顔面運動ニューロンへの感覚毛の運動野からのスパース投影がウイルス発現緑色蛍光タンパク質^{14を用いて、}ラットで発見されました。以前の研究は、レポーター遺伝子増幅^11,15なしで古典的なトレーサーを使用して、この投影法を見つけることができませんでした。残念ながら、多くのウイルスベクターがトレース挙げ研究で使用したものと同様に、それによって多シナプス回路をトレースするためのそれらの使用を制限し、シナプスを横断しません。

モータ回路に参加した細胞のネットワークを識別するための明確な利点を提示しながら、PRV-152を使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な回路内の特定の接続を解釈することができます。したがって、我々は、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用して、二重標識によってPRV-152を使用して識別回路内の特定の接続を検証するための簡単​​な方法を提示します。 BDAとCTbをの併用は、ニューロン^6-8,11の特定のセットの間の接続をトレースするための十分に確立された手法です。一緒に使用する場合、これらの二つのトレーサーは、2色DAB（3、3'-ジアミノベンジジン）手順^{16を使用して同じ}部分に可視化することができます。高分子量BDA（BDA10kDaは）それYので、このプロトコルを選択しました神経プロセス^6,7,9の詳細なラベル付けをields。 BDA10kDaのさらなる利点は、以下のものがあります。それは、優先的に順行方向^6-8に搬送されます。それは、イオン導入や圧力注入^6-8で配信することができます。それは、単純なアビジン-ビオチン化HRP（ABC）の手順^17で視覚化することができます。それは、光または電子顕微鏡^6,7,18によって画像化することができます。それは、遠位樹状突起^10,19を含む細胞プロセスを明らかにするのに有効であるため、ペルオキシダーゼおよびDABとCTbをの免疫化学的検出は、運動ニューロンの逆行性標識のために選ばれました。我々は最近、マウスでのボーカル運動経路を特定するために、以前に²⁰存在しないと仮定した喉頭運動ニューロンへの一次運動野から疎な接続を明らかにするために、このアプローチを使用していました。

プロトコル

注：すべての動物の手順を見直し、デューク大学施設内動物管理と使用委員会により承認されています。

1.保存仮性狂犬病ウイルス

1. 私たちは、1×10 ⁹ PFU /メートルの力価でプリンストン大学で博士リンEnquistの研究室から生ウイルス（PRV152）を得ました。ウイルスを生成するためのプロトコルは^、2を公開されています。
2. 適切なバイオセーフティ条件の下で-80℃でBSL-2バイオセーフティキャビネットや店舗内チューブあたり20μlのでウイルスを等分。
3. 注入の直前にPRVのアリコートを解凍します。

筋肉内に注射するための2外科の準備

1. ケタミン - キシラジン（100ミリグラム/ kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン）の筋肉内注射により全身麻酔を誘導し、イソフルランを使用して、適切な麻酔薬平面を維持します。
2. 眼用軟膏で角膜を保護します。
3. トンを準備彼の髪をトリミングし、ベタジンのスクラブと70％のアルコール（3サイクルの最小値）を交互に手術部位を消毒することにより、無菌技術による手術部位。外科的領域をカバーするために、滅菌ドレープを使用してください。手順を通して無菌技術に準拠していることを確認してください。
4. 皮膚切開を行い、目的の筋肉を明らかにしました。例えば、輪状甲状喉頭筋にアクセスするためには、まず胸骨筋の上に重なる部分を除去する必要があります。
5. VetBond組織接着剤を用いて任意の離断筋肉をシール。

筋肉にPRVの3インジェクション

1. 34 Gステンレス鋼針を取り付け、解凍したてのPRV溶液で10μlのNanoFilのマイクロシステムをロードし、慎重に定位デバイスにマウントします。
2. ゆっくりとデッドスペースをクリアし、そのソリューションは、マイクロチップを出ることを確認します。 bioharzard廃棄物などの流体捨てます。
3. 定位micropを使用ositioningデバイスは慎重に興味のある筋肉にマイクロチップを配置し、わずかな腫脹が表示されるまで、ゆっくりと筋肉を埋めます。注入速度は、注入されるべき筋肉とボリュームのサイズに依存して変化します。例えば、4 NL /秒の速度で200 NL（1μlの合計）の5回の注射は、輪状甲状筋を埋めるために同じサイトに1分間隔で行われるべきです。関心の次の筋肉に注射器（この場合は横方向の輪状披裂）を移動し、注入手順を繰り返します。一度だけ各筋肉を穿刺。
4. 5分後にマイクロシリンジを撤回。
5. VetBondの組織接着剤を使用して、筋膜の断線をシール。
6. すべての注射が完了した後、VetBond組織接着剤を使用して創傷を閉じます。お近くのinstitional動物使用のガイドラインに応じて、縫合糸または創傷クリップを使用することができます。
7. 胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、yで必要とされるケア当社の機関の動物の使用に関するガイドライン。
8. （この場合、2 ^回目にラベルを付ける皮質ニューロンを注文する90時間）実験的に決定生存期間の後、ペントバルビタール過剰投与により動物を犠牲にし、0.1M PBS中の4％ホルムアルデヒドに続いて0.9％生理食塩水で経灌流。
9. 24時間4％ホルムアルデヒドで脳を削除し、ポスト固定してください。
10. 少なくとも48時間、30％スクロースを含有するリン酸緩衝液中で脳をCryoprotect。

eGFPの4免疫化学的検出

1. スライディングミクロトーム上で40μmのセクションをカットし、0.1MのPBSに浮遊セクションを保存します。取り付けられた切片を染色する際に薄肉部は、例えば、30μmとするために、使用されてもよいです。
2. 光から保護し、PBS中0.3％H ₂ O ₂で30分間、切片をクエンチしました。
3. VECTASTAINエリートキット（キットVE）から正常ヤギ血清、0.3％Tween20を含むPBSで30分間、切片中の非特異的抗原を遮断します。
インキュベートは（千1）ウサギ抗-EGFPで3.5時間のためのセクションをブロックされています。
4. インクルードを室温でキットをVEから、その後ヤギ抗ウサギ二次抗体で1時間のためにそれらをインキュベート、5分間のセクションをPBSで3回洗浄します。
5. インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。
6. 5分間、切片をPBSで3回洗浄し、その後ザをRTでキットVEからABC溶液中で1時間のためにそれらを反応させます。
7. 0.05％DAB（3、3'-ジアミノベンジジン）および0.015％の_H 2 O _{2を含有する} 、10分間、リン酸緩衝液中で切片を3回洗浄し、リン酸緩衝液中で8分間、pH7.4のために開発します。
8. スーパーフロストプラススラ​​イド上のマウント部と段階的アルコールシリーズ（70％、95％、100％、5分間、それぞれ100％）を介してそれらを脱水します。
9. 2キシレン回洗浄（各5分）を​​介してのセクションをクリアし、パーマウント封入剤でスライドをカバースリップ。
10. 画像顕微鏡に取り付けられたセクション。 DAB反応製品insidE細胞は茶色に表示されます。デジタル化された画像は色が細かいプロセスを強調するために反転させることができます。

PRVトレースによって検出された脳領域へのトレーサーの注射用5。外科の準備

1. ケタミン - キシラジン（100ミリグラム/ kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン）の筋肉内注射により全身麻酔を誘導し、イソフルランを使用して、適切な麻酔薬平面を維持します。
2. 眼用軟膏で角膜を保護します。
3. 適切な定位フレームに頭部を固定してください。
4. 髪をトリミングし、ベタジンのスクラブと70％のアルコール（3サイクルの最小値）を交互にサイトを消毒することにより、無菌技術による手術部位を準備します。
5. 頭皮の切開を行い、目的の脳領域上の皮膚を撤回。
6. 適切な定位座標で小開頭手術を行います。例えば、laryngeally接続運動皮質の座標はでPRVトレースによって識別n個の成体マウスは、1.2ミリメートル、横方向とブレグマに0.2ミリメートル吻側です。

脳へのビオチン化デキストランアミンの6インジェクション

1. 滅菌生理食塩水の333μlのBDA 25mgの（10,000 MW）を溶解することにより、7.5％のビオチン化デキストランアミン（BDA）を準備します。
2. 計画された注射用の十分なBDA溶液でNanoject IIマイクロピペットシステムをロードします。
3. ゆっくりとデッドスペースをクリアし、そのソリューションは、マイクロピペットチップを出ていることを確認します。
4. 定位微細位置決め装置を使用して、慎重に関心のある脳領域にマイクロピペットの先端を下げ、ゆっくりBDAを注射します。領域の大きさに応じて、噴射率を標識するために調整します。例えば、4.6 NLの12注射は離れて0.2ミリメートル（吻側 - 尾側方向）は成体マウスでlaryngeally接続運動皮質をカバーするために、四つの異なる場所でも行われなければなりません。最終噴射量は、対象の脳領域の大きさに応じて調整されるべきです、ラベルは脳組織を通って、ラベルされたニューロンのプロセスに沿って拡散することにより、射出コアから広がる可能性があることを念頭に置いて。
5. 歯科用セメントを使用して開頭術を密封し、VetBond組織接着剤を使用して頭皮の傷を閉じます。
6. 胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、あなたの制度的動物使用のガイドラインによって要求されるように気になります。

筋肉へのコレラ毒素サブユニットBの7インジェクション

1. 滅菌生理食塩水100μlのCTbを1mgを溶解させることによって、1％コレラ毒素サブユニットB（CTB）を準備します。
2. 六日の脳へのBDA注射後、筋肉にPRV注射のために上記のように外科手術の準備を行います。
3. 34 Gステンレス鋼針を取り付け、CTbを溶液で10μlのNanoFilのマイクロシステムをロードし、慎重に定位デバイスにマウントします。
4. 以前デとして関心の筋肉（複数可）にマイクロインジェクションを実行しますPRVのためのスクライブ。
5. 胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、あなたの制度的動物使用のガイドラインによって要求されるように気になります。
6. 三日のCTB注射の後、ペントバルビタール過剰投与により動物を犠牲にし、0.1M PBS中の4％ホルムアルデヒドに続いて0.9％生理食塩水で経灌流。
7. 24時間4％ホルムアルデヒドで脳を削除し、ポスト固定してください。
8. 少なくとも48時間、30％スクロースを含有するリン酸緩衝液中で脳をCryoprotect。

同じセクション内BDAとCTbを8.検出

1. ミクロトーム上で40μmのセクションをカットし、0.1MのPBSに浮遊セクションを保存します。
2. 光から保護し、PBS中0.3％H ₂ O ₂で30分間、切片をクエンチしました。
3. インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。
4. 切片を5分間PBSで3回洗浄し、その後、室温でABC溶液中で1時間のためにそれらを反応させます。
5. 10分間、リン酸緩衝液中で切片を3回洗浄し、0.05％DAB（3、3'-ジアミノベンジジン）、0.015％のH _{2 O 2、}及び0.05％の塩化ニッケルを含有し、リン酸緩衝液中で8分間、pH7.4のために開発します。細胞内でのDAB反応生成物は、黒表示されます。
6. VECTASTAINエリートキットから正常ウサギ血清を0.3％Tween 20を含むPBS中で30分間ブロックセクション。
7. RTで：インキュベートは、（10,000 1）ヤギ抗CTbをで2時間のセクションをブロックされています。
8. セクション5分間PBS中で3回洗浄し、その後、インクルードをRTでキットをVEからウサギ抗ヤギ二次抗体で1時間のためにそれらをインキュベートします。
9. インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。
10. 5分間、切片をPBSで3回洗浄し、その後、室温でABC溶液中で30分間、それらを反応させます。
11. 0.05％DAB（3、3を含む、10分間のセクションをリン酸緩衝液で3回洗浄し、リン酸緩衝液中に最大8分、pHが7.4のために開発「-diaminobenzidine）と_0.015％H 2 O _2。細胞内でのDAB反応生成物は茶色に表示されます。
12. スーパーフロストプラススラ​​イド上のマウント部と段階的アルコールシリーズ（70％、95％、100％、5分間、それぞれ100％）を介してそれらを脱水します。
13. 2キシレン回洗浄（各5分）を​​介してのセクションをクリアし、パーマウント封入剤でスライドをカバースリップ。
14. 画像顕微鏡に取り付けられたセクション。

結果

eGFPのための染色は、一次運動ニューロンの筋肉にPRV152を注入した後、約72時間の弱い信号を示す開始する必要があります。ウイルスの複製および経シナプス輸送はtiter-と時間依存⁴されています。約90時間の注入後、eGFPの染色は、2 ^番目の順に感染した細胞において強いシグナルを明らかにします。より長い生存期間は、3 ^{回目を明らかに}し、より高次の細胞が、生存時間は約5日間接種後PRVの致死性によって制限されています。

図1aは、7つの喉頭筋の二つに94時間PRV152を注入した後、PRV152は喉頭運動ニューロンを収容疑核、におけるEGFPを発現する感染したニューロンを示しています。ウイルスが感染した筋肉は、そのような舌下神経核などの他の発声運動ニューロンプールを、神経支配ニューロンを介して脳に入ったので、eGFPを発現しない（ 図1B）。

図2は疑核における一次感染の後に²次の脳幹ニューロンへのウイルス...

ディスカッション

PRV152 ^{4,21を用いた実験}を計画する際に考慮に入れなければならない多くの問題があります。最も重要なのは、仮性狂犬病ウイルスは致命的です。前述したように、ヒトを含む大型類人猿は、感染に対して感受性ではなく、適切なケアは、他の動物を保護するために行使されなければなりません。成体マウスは通常、5〜7日間の弱毒PRV152株を接種​​した後に生き残ります。したがって、PRV152は1週間以上の生存時間を必要とする実験のために適切ではありません。また、感染した動物は、一般的に、それによって正常な行動の観察を必要とする実験のためPRV152の有用性を制限し、生存期間中に病気の兆候が表示されます。

さらに、PRV152は、細胞傷害性免疫応答^{22をトリガーします} 。複製やウイルスの送信は時間依存⁴ titer-とされているので、ニューロンのパターンは、ビラの免疫化学的検出によって明らかに細胞は、感染の段階を経て進行としてのLタンパク質またはEGFPレポーター遺伝子は、生存期間の過程で変更されます。五日間筋肉内接種後、

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬名/材料	会社	カタログ番号	コメント
NanoFil マイクロインジェクションシステム	ワールド 精密機器	IO-Kit	34 G オプション
固定装置フレーム	David Kopf Instruments	モデル 900
Nanoject II オートナノリットルインジェクター	Drummond Scientific Company	3-000-204
	ライカ	SM2010 R
[header]
VetBond	3M	1469SB
イソフルオラン(フォラン)	Baxter
1001936060 ベタジン スワブ スティック	Cardinal Health	2130-01	200 カウント
パーマウント マウント ミディアム	フィッシャー サイエンティフィック	SP15-500
スーパーフロスト プラス スライド	フィッシャー サイエンティフィック	12-550-15
ビオチン化デキストラン アミン	Invitrogen	D-1956	10,000 MW
偽狂犬病ウイルス	博士の研究室Lynn Enquist (プリンストン大学)	PRV152	力価 >1 x 107
抗コレラ毒素 B サブユニット (ヤギ	)リスト 生物研究所	703
コレラ毒素 B サブユニット	リスト 生物学研究所	103B
抗eGFP	オープンバイオシステム	ABS4528
3, 3'-ジアミノベンジジン	Sigma-Aldrich	D5905	10 mg錠剤
タノール	Sigma-Aldrich	E7023	200プルーフ
ホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	F8775	4%
過酸化水素	Sigma-Aldrich	H3410	30%
ケタミンHClに希釈キシラジンHCl	Sigma-Aldrich	K4138	80 mg/ml & 6 mg/ml
塩化ニッケル	Sigma-Aldrich	339350
リン酸緩衝液	Sigma-Aldrich	P3619	1.0 M; pH 7.4
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich	P5493	10x; pH 7.4
ペントバルビタールナトリウム	Sigma-Aldrich	P3761	50 mg/mL
スクロース	Sigma-Aldrich	S9378
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
キシレン	Sigma-Aldrich	534056	組織学的グレード
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6101 (ウサギ);PK-6105 (ヤギ)
Optixcare 眼軟膏	Vet Depot	1017992