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方法論記事

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DOI:

10.3791/50688

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2013年8月7日

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1Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, 2Physiology and Biophyics, Virginia Commonwealth University

この記事について

サマリー

腸神経系のニューロンおよびグリア成分を直接研究するための細胞培養プロトコルを実演します。成体マウスの筋神経叢から、電気生理学、免疫組織化学などにより個々のニューロンとグリアの機能を調べる能力を提供する、カバースリップ上のニューロン/グリア混合培養

物。

要約

腸神経系は、機能的に消化管運動を制御して消化管の長さを実行しているニューロンとグリアの広大なネットワークである。筋層間神経叢からの神経細胞とグリア細胞の混合集団の単離および培養のための手順を説明する。初代培養は、ニューロンとグリアの間で開発の接続で、7日以上維持することができる。添付叢と縦筋ストリップは、マウスの回腸または結腸の基礎となる円形の筋から除去し、酵素消化に供される。無菌状態では、単離された神経細胞とグリア人口はペレット次遠心内に保存され、カバースリップ上に播種。 24〜48時間以内に、神経突起伸長が起こり、ニューロンは汎神経マーカーで識別することができます。パッチクランプ研究によって観察されるような文化の中で2日後、ニューロン火災活動電位を単離した。さらに、腸グリアもidentifできGFAP染色によりiedを。近い同格のニューロンとグリアのネットワークが5内のフォーム - 7日。腸ニューロンは個別になり、直接的に、例えば免疫組織化学、電気生理学、カルシウムイメージング、および単一細胞PCRなどの方法を用いて研究することができる。さらに、この手順は、遺伝的に改変された動物において行うことができる。この方法は、実行する簡単で安価である。我々はより良​​い、正常および疾患状態におけるENSの機能を発見することができるように全体的に、このプロトコルは、簡単に操作方法で、腸神経系の構成要素を公開します。

概要

腸神経系(ENS)は、消化管(GI)の全長を走る神経とグリアの広大なネットワークです。ENSは、蠕動運動、体液の吸収/分泌、刺激の感覚など、消化のすべての側面を機能的に制御します(レビューについては1を参照)。脊髄に見られるよりも多い5億個以上のニューロンが含まれており、脳に見られるすべての神経伝達物質クラスが含まれています。さらに、ENSは、中枢神経系からの入力なしに反射的に機能できるという点で独特です2。ENSの理解は、その正常な生理学的役割を理解するだけでなく、先天性(ヒルシュスプルング病)、後天性(シャーガス)、病状への続発性(糖尿病性胃不全麻痺)、薬物誘発性(オピオイド腸症候群)、または損傷による(術後イレウス)など、さまざまな神経障害への関与を理解するために非常に重要です。さらに、腸管ニューロンはウイルス感染(水痘帯状疱疹)の貯蔵庫になる可能性があります3。脳に類似していることと腸内のセロトニンのレベルが高いため、中枢神経系の欠陥の治療を目的とした薬は、ENS 2に望ましくない副作用をもたらすことがよくあります。また、アルツハイマー病やパーキンソン病などの多くの神経障害は、中枢ニューロンに現れるずっと前に腸管ニューロンに同様の細胞変化を示しており、ENSをこれらの疾患の病因を研究するためのアクセス可能なモデルにしていることも注目に値します4。したがって、ENSを完全に理解することは、病状を理解し、薬理学的副作用を予防/予測するために必要です。

ENSのニューロンは、伝統的にモルモットで全量製剤5-7または培養ニューロン8を用いて研究されてきました。この大型動物ではニューロンの研究が容易であるにもかかわらず、このモデルには、遺伝子組み換え株の欠如、この種に特異的な試薬の欠如、これらの被験者の注文と収容に関連する高コストなど、多くの制限があります。マウス腸管神経系モデルの開発には、さまざまなノックアウトシステム、細胞培養技術と組み合わせて使用できる他の確立された方法論の膨大な配列、およびモルモットモデルの検証を提供する能力という独自の利点があります。

ENSは、胃腸管の長さを走る3つのプレキシで構成されています。主に腸の蠕動運動に関与する外側の筋神経叢(縦筋と円形の筋肉の間)、および体液の吸収/分泌と刺激の検出を主に制御する粘膜下神経叢と粘膜プレジプチオ(それぞれ粘膜の下と粘膜内に見られる)1 .この方法は、消化管の外側の筋肉層を剥がすことにより、縦方向の筋/腸管神経叢(LMMP)の準備を分離することから始まります。これにより、粘膜層が分離に関与している場合に発生する汚染の問題が劇的に削減されます。その結果、このプロセスは、ENSの分泌作用ではなく、運動性のニューロン制御の研究に理想的です。

ここで紹介する方法は、腸内ニューロンとグリアの混合培養をもたらします。少なくとも2つの異なるタイプのニューロンが、以前の電気生理学的および免疫細胞化学的観察に基づいて存在する9。グリアの存在は、それ自体が研究すべき重要な細胞型であるだけでなく、腸管ニューロン10の生存に寄与し、ニューロン細胞表面11上の天然受容体発現を維持するため、非常に有利である。さらに、腸グリアの欠乏は、異常な胃腸運動性疾患の状態につながる可能性があり、「神経膠症」12と呼ばれています。したがって、ここで紹介するENS培養は、研究に適したいくつかの細胞タイプをもたらします。

この方法論の利点は、分離が容易であること、安価なツール要件、および経験豊富なラボ担当者が技術を習得する時間が短いことです。この方法論の限界には、大量の組織による全体的な細胞収量の低さや、粘膜および粘膜下神経叢からのENSニューロンの排除が含まれます。この手順は、電気生理学、免疫組織化学、シングルセルPCR、およびその他の方法論を専門とする学者にとって非常に有利です。

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プロトコル

すべての動物の世話と実験の手順は、バージニアコモンウェルス大学の動物管理および使用委員会に準拠し、承認されました。

1. 24ウェルプレートにおける無菌ポリ-D-リジンおよびラミニンコーティングガラスカバースリップの調製

  1. ステップ1のすべての手順は、フードの下で、滅菌試薬を使用して、滅菌状態で実行されます。ガラスカバーガラスと二重脱イオン水(ddH2O)は、事前に滅菌する必要があります。プレートの調製は、ニューロン分離の2週間前まで行うことができます。
  2. ボンネットの下では、滅菌鉗子を使用して、オートクレーブ処理されたガラスカバースリップを24ウェルプレートの12ウェルに配置します。
  3. poly-D-lysineストックを事前に調製してください。50 mLの滅菌ddH2Oを5 mgのポリ-D-リジンに加えます。.ボルテックスし、-20°Cで3mlのアリコートに保管し、使用前にアリコートを解凍します。
  4. 最終濃度が25 cm2あたり1 mLのポリD-リジンストックの場合:各ガラスカバースリップ(2 cm2)の上部にポリD-リジンストック80 μlをピペットで取り付けます。溶液を10分間落ち着かせます。
  5. 真空を使用してポリ-D-リジンを除去し、カバースリップを滅菌ddH2Oで3倍すすぎます。
  6. プレートをボンネットの下で少なくとも2時間乾燥させます。
  7. プレートは、ラミニンコーティングに進む前に4°Cまたは-20°Cで保存できます。
  8. ラミニンストックを事前に準備してください。ラミニンを氷の上で解凍し、使用中は氷の上に置いてください。50μg/mlの濃度に希釈します。ロットの集中に注意を払ってください。各ロットは異なります。ロット濃度に応じて、約20mlのddH2Oがラミニンの各バイアルに添加されます。アリコート(5ml)を-80°Cで保存し、使用前に氷上で解凍してください。
  9. カバースリップに5 μg/cm2ラミニンを塗布し、各カバースリップに200 μlのラミニンストックをピペットで塗布します。
  10. ラミニン溶液をカバーガラス上で1時間インキュベートします。
  11. 残ったラミニン溶液を吸引し、カバースリップをddH2Oで一度すすぎます。
  12. プレートは4°Cで最大2週間保存してください。

2. ニューロン分離溶液の事前準備

  1. クレブス溶液(mM単位:118 NaCl、4.6 KCl、1.3 NaH2PO4、1.2 MgSO4、25 NaHCO3、11グルコース、および2.5 CaCl2)を調製します。13.79 g NaCl (FW 58.44)、0.686 g KCl (FW 74.55)、0.312 g NaH2PO4 (FW 120)、.289 g MgSO4 (FW 120.4)、4.20 g NaHCO3 (FW 84.01)、3.96 g グルコース (FW 180.2)、および 0.555 g CaCl2 (FW 111) を 2 L ddH20 に配置します。4°Cに冷やします。
  2. リンス培地(10%ウシ胎児血清(FBS)と抗生物質/抗真菌剤を含むF12培地)を調製します:500 mLのF12培地ボトルに、50 mLのFBSと5 mLの抗生物質/抗真菌剤100倍液(Gibco)を加えます。
  3. 腸管性ニューロン培地(B-27、2 mM L-グルタミン、1% FBS、10 ng/ml、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、および抗生物質/抗真菌剤100倍液を含む神経基礎A培地)を調製します。GDNFストックを作るには、1 μgのGDNFに1 mLのddH2Oを加え、50 μlのアリコートで凍結し、-80°Cで保存します。50 mLのバイアルに1つの完全ニューロン培地を1本入れるには、47.5 mLのNeurobasal A培地、1 mLのB-27(50倍)、500 μLのFBS、500 μLの200 mM L-グルタミン(Gibco)、50 μLのGDNFストック、および500 μLの抗生物質/抗真菌剤100倍液を組み合わせます。培地は、GDNFの鮮度を確保し、この高価な細胞培地混合物の大量汚染を避けるために、50 mLの小さなバッチで製造されます。

3. マウスから縦筋/筋神経叢(LMMP)の調製物を採取

  1. 動物実験を行う前に、適切な国家的および制度的倫理が整備されるべきである。体重が25gを超える成体(通常は8週齢以上)の成体スイスウェブスターマウスは、実験前に6匹のグループで飼育されます。回腸神経ニューロンとグリアの分離には2匹のマウスの組織を使用し、結腸細胞の分離には3匹のマウスを使用します。
  2. 手術エリアを準備します。小さな手術用ハサミ、角度付き鉗子、綿棒、200mlのガラスビーカー3本、ガラス/プラスチック棒(絵筆)を集めます。汚染を最小限に抑えるために、使用前にすべての消耗品を徹底的に洗浄してすすいでください。このステップは、実験の前日に実行できます。
  3. クレブス溶液を氷の上に置き、カルボゲン(95%酸素、5%CO2)で少なくとも30分間泡立ててpHを安定させます。
  4. さまざまな機器と温かい化学薬品の電源を入れて、目的の温度で安定させます。水浴を37°Cに加熱し、遠心分離機を4°Cに冷却し、ハンク平衡塩溶液(HBSS)と0.5%トリプシンを水浴(37°C)に入れます。完全なニューロン培地とリンス培地は冷蔵したままにする必要があります。
  5. 150mlの氷冷泡クレブスを、「ダーティ」、「クリーン」、「LMMP」のラベルが付いた3つの200mlガラスビーカーに入れます。カルボゲンで「LMMP」とラベル付けされたバブルビーカー。
  6. 倫理委員会の承認後、マウスを頸部脱臼またはCO2窒息により安楽死させます。
  7. マウスを手術面の背側横臥にし、70%EtOHで皮膚をきれいにし、鉗子を使用して腹部の皮膚を持ち上げます。ハサミを使って腹腔を開き、内部の消化器官を露出させます。
  8. 回腸の一部を持ち上げ、その腸間膜を明らかにすることにより、胃腸管の長さを取り除きます。ハサミで腸間膜を切り取り、回腸/結腸から腸間膜を引っ張らないように注意しながら、回腸と結腸を優しく取り除いて解きます。
  9. 腸の全長が解けたら、胃の遠位と盲腸の近位にある腸を切開して回腸を取り除きます。注:この手順は、結腸を盲腸の遠位から肛門の近位まで切除することにより、結腸組織でも実行できます。
  10. 組織はさらに、近位結腸と遠位結腸、空腸、回腸に分けることができます。この手順の残りの部分では、回腸の分離を参照します。手順は、結腸LMMPの分離についても同じです。回腸全体を「汚れた」とマークされた氷冷したクレブスを入れたガラス容器に入れます。
  11. 回腸を洗浄するツールを作成し、ヤスリストーンを使用して大きな20Gの針を鈍くし、氷冷したクレブスが入った大きな注射器(10 ml)に取り付けます。
  12. 回腸を3つ以上の大きな部分に切片にして、回腸から糞便を取り除きます。ビーカーから回腸切片を取り外し、鈍い針を回腸片の端に置きます。
  13. すべての糞便が別の廃棄物容器に取り除かれるまで、クレブスを腸のセクションにそっと通します。洗浄した部分を「クリーン」とマークされたクレブスの容器に入れます。回腸全体がきれいになるまで繰り返します。
  14. LMMPを取り外すには、回腸を約2〜4cmの小さなセグメントに切ります。プラスチックまたはガラスの棒に回腸のセグメントを置きます。回腸はぴったりとフィットしますが、緩んだりぴんと張ったりしないでください(~2 mm)。鉗子を使用して、まだ胃腸(GI)管に付着している腸間膜の断片を穏やかに除去することにより、LMMPの除去を開始します。親指を使用してチューブをロッドにそっと固定することにより、GI管がロッドの周りを回転するのを防ぎます。
  15. LMMPを下にある円形筋から分離します;まず、腸間膜が付着した線全体に沿って鉗子の端をセグメントの上から下に優しくこすり、縦筋に緩やかに隙間を作ります。次に、クレブスで濡らした綿棒を使用して、縦方向の筋肉をやさしくからかいます。
  16. 縦筋の隙間の上部から始めて、縦筋が円形筋から分離し始めるまで非常に軽い圧力をかけながら、最も軽い水平ストロークを使用してからかいます。
  17. 次に、消化管の周りをゆっくりと動かし始め、縦筋が管の周りで円形の筋肉からゆっくりと分離するにつれて、上から下へ、そして戻します。完了すると、LMMPはGIチューブの残りの部分から自然に外れます。
  18. 得られた縦筋の細いストリップを「LMMP」とマークされたビーカーに入れます。すべてのセグメントに対して繰り返します。
  19. 1 つのマウスから LMMP のすべてのストリップを収集したら、使用している他のマウスに対して手順を繰り返します。再利用する前に、「汚れた」ビーカーと「きれいな」ビーカーをよくすすいでください。
  20. LMMPを3xすすぎ、生物学的汚染を取り除きます。2mlのエッペンドルフチューブ3本に氷冷したクレブスを入れます。LMMPストリップを最初のチューブに入れ、4°Cに冷却した遠心分離機で356 x gで30秒間回転させ、ピペットで上清を慎重に取り除き、LMMPストリップを次にきれいなクレブス充填チューブに移します。残りのチューブごとにこの手順を繰り返します。

4. LMMPをダイジェストする

  1. 10 mLのカルボゲン泡状クレブス溶液に13 mgのコラゲナーゼ2型および3 mgのBSAを入れて消化溶液を調製します。
  2. すすぎたLMMPの一部を消化液に入れ、はさみを使ってLMMPを細かく切り取ります。
  3. LMMPをシェーカー付きのウォーターバスで37°Cで60分間消化し、カルボゲンで穏やかに泡立てます。
  4. 消化が完了したら、4°Cに冷却した遠心分離機で356 x gで8分間遠心分離して細胞を採取します。
  5. この時点から、すべての手順は細胞培養フード内の無菌条件下で行う必要があります。すべての試薬と容器は、使用前に滅菌する必要があります。
  6. 遠心分離中に、温めた0.25%トリプシン1 mLと温めたHBSS4 mLを滅菌した50 mLの細胞培養チューブに入れて、0.05%トリプシン溶液を調製します。
  7. 遠心分離後、上清を取り除いて廃棄します。掃除機は使用しないでください。これにより、遠心分離速度が遅いため、細胞ペレットが吸い込まれる可能性があります。細胞ペレットを慎重に取り出し、5mlの0.05%トリプシン溶液を入れたきれいなチューブに入れます。
  8. 0.05%トリプシン溶液中の細胞を37°Cのウォーターバスで7分間振とうしながら消化します。トリプシン治療の合計7分を超えないと、ニューロンが死滅します。
  9. トリプシン処理の7分後に10mlの冷たいすすぎ媒体でトリプシンを中和します。
  10. 細胞を356 x gで8分間遠心分離します。メディアを取り外して廃棄します。
  11. 遠心分離中に、滅菌した15 mLの細胞培養チューブの上に滅菌したNitexメッシュの一部のバランスを取ります。
  12. 遠心分離後、上清を取り除いて廃棄します。3 mLの完全ニューロン培地でトリチュレートすることにより、細胞混合物を穏やかに再懸濁します。このステップおよび細胞混合物がトリチューンされる将来のすべてのステップで気泡が発生しないようにしてください。すべてのトリチュレーションは非常に穏やかに行う必要があります。Nitexメッシュを介して細胞溶液を清浄な15 mL細胞培養チューブにろ過します。
  13. オプション:細胞培養チューブにキャップをし、冷蔵フラミキサー(または回転可能なミキサー)に入れ、30分間ゆっくりと転がし、傾けます。この手順はオプションですが、推奨されます。
  14. オプション:フラミキサーの後、2mlのコールドリンスメディージを加えて細胞を洗浄します。
  15. 遠心分離(8分、356 x g)で細胞を採取します。上清を取り除き、廃棄します。
  16. 細胞を1,200 μlの完全ニューロン培地に再懸濁します。1 mLのプラスチック製ピペットチップを使用して細胞を穏やかに滴下します。気泡を発生させないでください。ほとんどのチャンクが分かれ、細胞が液体に懸濁されるまで、ゆっくりと穏やかにピペットで撫でます。
  17. プレコートガラスカバースリップを含む12個のウェルのそれぞれに750 μlの完全培地を加え、トリチュレートした細胞溶液100 μlを加えます。
  18. 細胞培養インキュベーターでニューロンを37°Cで5%CO2でインキュベートします。
  19. 細胞培地の半分を2日ごとに交換します。
  20. ニューロンは、培養で1〜2日後に電気生理学的記録の準備ができています。

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結果

LMMP由来細胞を単離した直後には、ニューロンやその他の細胞種を容易に判別することはできません。表現型の不明確な生存している円形の細胞に加え、不完全に消化された組織断片や結合組織などの組織デブリが観察されます。これらの浮遊物は問題ではなく、2日後の最初の培地交換時に大部分が除去されます。それまでにスライドを洗浄しようとしないでください。健康で生存可能な細胞まで一緒に除去されてしまいます。

培養1日後、ニューロンに神経突起の伸展が見え始めます。この時点では、ニューロンの特異的な同定はまだ不明確な場合があります。細胞が実験用チャンバーに転移させるのに十分な接着性を持っているならば、培養1日後から電気生理学的研究が可能です。ただし、細胞は培養2日後により強固に接着し、2〜5日目あたりが機能研究（電気生理学、カルシウムイメージング）に最適です。

培養開始から約1週間後、ニューロンの形態学的特徴が明確になります（図1）。理想的な免疫細胞化学的特徴は、ニューロンが長い突起を伸ばし、グリア細胞が混在するほぼ...

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ディスカッション

使用動物

このプロトコルは、スイスウェブスターマウス用に最適化されています。ただし、この方法は、ラットなどの他の小型哺乳類や他の系統のマウスに容易に適応できます。C57マウスとμオピオイド受容体ノックアウトによる予備単離に成功しました。ただし、消化管の形態学的変化により、他の系統のマウスが問題になる可能性もあります。さらに、LMMP調製物 13のニューロン回路において、マウス株(C57Bl/6対Balb/c)間に既知の違いがあり、これは最終単離におけるニューロンの混合に影響を与える可能性がある。さらに、加齢に伴うニューロンの喪失は、コリン作動性ニューロンとそれに対応するグリアに特異的な腸神経叢で発生し、 14歳の12か月という早い時期に見られるため、この方法を使用する際には年齢を考慮する必要があります。最後に、このプロトコルを他の種の動物に適応させる場合、筋神経叢が円形筋に付着したままになるのではなく、縦筋と一緒に離れるように注意する必要があります。

使用組織

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開示事項

著者らは、主要な競合する利益は存在しないと宣言します。

謝辞

国立衛生研究所助成金DA024009、DK046367、T32DA007027.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Reagents
成長カバーガラス用フィッシャーブランドカバーガラス(直径12mm)フィッシャーサイエンティフィック12-545-82 
ポリ-D-リジンシグマP6407-5 mg 
24ウェル細胞培養プレートCELLTREAT229124任意のブランドを使用できます
LamininBD Biosciences354 232 
ddH2O研究室で準備可能 
15 ml 滅菌遠心分離チューブGreiner Bio-one188261任意のブランドを使用できます
50 ml 滅菌遠心分離チューブGreiner Bio-one227261任意のブランド
NaClFisher BioReagentsBP358-212MW 58.44
KClFisher BioReagentsBP366-500MW 74.55
NaH2PO4 .2H2OフィッシャーケミカルズS369-3MW137.99
MgSO4Sigma AldrichM7506-500GMW 120.4
NaHCO3Sigma AldrichS6014-5KGMW 84.01
グルコースFisher ChemicalsD16-1MW 180.16
CaCl22H2OSigma AldrichC5080-500GMW 147.02
F12 メディアGibco11330 
ウシ胎児血清クオリティバイオロジカル株式会社110-001-101HI任意のブランドを使用できます
抗生物質/抗真菌剤 100x液体Gibco15240-062 
神経基礎A培地Gibco10888 
200 mM L-グルタミンGibco25030164 
グリア由来神経栄養因子(GDNF)NeuromicsPR27022 
シャープポインテッド解剖はさみフィッシャーサイエンティフィック8940、任意のブランドを使用することができます
解剖組織鉗子フィッシャーサイエンティフィック13-812-41任意のブランドを使用することができます
コットンチップアプリケーターフィッシャーサイエンティフィック23-400-101任意のブランドを使用することができます
250ミリリットルの目盛り付きガラスビーカーフィッシャーサイエンティフィックFB-100-250任意のブランド2 Lを使用することができます
ガラスErlenmyerのフラスコフィッシャー科学FB-500-2000あらゆるブランドの
プラスチック棒（子供のペンキのブラシを使用することができますCrayola05 3516ブランドを使用することができます
CarbogenAirgasUN 31565% CO2
10 ml Leur-lock SyringeBecton Dickinson309604任意のブランド
21 G x 1 1/2 inを使用することができます。皮下注射針ベクトン・ディキンソン305167任意のブランドを使用できます
コラゲナーゼ 2型ワージントンLS004174 
ウシ血清アルブミンアメリカンバイオアナリシスAB00440 
2 mlの微量遠心分離機のエッペンドルフの管フィッシャー科学13-864-252あらゆるブランドの
Nitrex Mesh 500 µを使用することができます。MElko Filtering Co100560任意のブランドを使用できます
ピペットセットフィッシャーサイエンティフィック21-377-328任意のブランドを使用できます
シャープニングストーンフィッシャーサイエンティフィックNC9681212任意のブランド
Equipment
LabGard ES 425 生物学的安全キャビネット (細胞培養フード)NuaireNU-425-400任意のものを使用できますブランド
10 L 振とうウォーターバスEdvotek5027任意のブランドを使用できます
微量遠心分離機 5417REppendorf5417Rサイズアダプター付きの単一の大型遠心分離機を使用できます
Allegra 6 シリーズ遠心分離機ベックマン・コールター366816任意のブランドを使用できます
HuluMixer サンプルミキサーInvitrogen15920D 
AutoFlow ウォータージャケット CO2 インキュベーターNuiareNU-4750任意のブランドを使用可能
分析天秤スケールメトラー・トレドXS104任意のブランドを使用可能
は 任意のを使用できます

参考文献

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