腸神経系のニューロンおよびグリア成分を直接研究するための細胞培養プロトコルを実演します。成体マウスの筋神経叢から、電気生理学、免疫組織化学などにより個々のニューロンとグリアの機能を調べる能力を提供する、カバースリップ上のニューロン/グリア混合培養
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この記事について
サマリー
要約
腸神経系は、機能的に消化管運動を制御して消化管の長さを実行しているニューロンとグリアの広大なネットワークである。筋層間神経叢からの神経細胞とグリア細胞の混合集団の単離および培養のための手順を説明する。初代培養は、ニューロンとグリアの間で開発の接続で、7日以上維持することができる。添付叢と縦筋ストリップは、マウスの回腸または結腸の基礎となる円形の筋から除去し、酵素消化に供される。無菌状態では、単離された神経細胞とグリア人口はペレット次遠心内に保存され、カバースリップ上に播種。 24〜48時間以内に、神経突起伸長が起こり、ニューロンは汎神経マーカーで識別することができます。パッチクランプ研究によって観察されるような文化の中で2日後、ニューロン火災活動電位を単離した。さらに、腸グリアもidentifできGFAP染色によりiedを。近い同格のニューロンとグリアのネットワークが5内のフォーム - 7日。腸ニューロンは個別になり、直接的に、例えば免疫組織化学、電気生理学、カルシウムイメージング、および単一細胞PCRなどの方法を用いて研究することができる。さらに、この手順は、遺伝的に改変された動物において行うことができる。この方法は、実行する簡単で安価である。我々はより良い、正常および疾患状態におけるENSの機能を発見することができるように全体的に、このプロトコルは、簡単に操作方法で、腸神経系の構成要素を公開します。
概要
腸神経系(ENS)は、消化管(GI)の全長を走る神経とグリアの広大なネットワークです。ENSは、蠕動運動、体液の吸収/分泌、刺激の感覚など、消化のすべての側面を機能的に制御します(レビューについては1を参照)。脊髄に見られるよりも多い5億個以上のニューロンが含まれており、脳に見られるすべての神経伝達物質クラスが含まれています。さらに、ENSは、中枢神経系からの入力なしに反射的に機能できるという点で独特です2。ENSの理解は、その正常な生理学的役割を理解するだけでなく、先天性(ヒルシュスプルング病)、後天性(シャーガス)、病状への続発性(糖尿病性胃不全麻痺)、薬物誘発性(オピオイド腸症候群)、または損傷による(術後イレウス)など、さまざまな神経障害への関与を理解するために非常に重要です。さらに、腸管ニューロンはウイルス感染(水痘帯状疱疹)の貯蔵庫になる可能性があります3。脳に類似していることと腸内のセロトニンのレベルが高いため、中枢神経系の欠陥の治療を目的とした薬は、ENS 2に望ましくない副作用をもたらすことがよくあります。また、アルツハイマー病やパーキンソン病などの多くの神経障害は、中枢ニューロンに現れるずっと前に腸管ニューロンに同様の細胞変化を示しており、ENSをこれらの疾患の病因を研究するためのアクセス可能なモデルにしていることも注目に値します4。したがって、ENSを完全に理解....
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プロトコル
すべての動物の世話と実験の手順は、バージニアコモンウェルス大学の動物管理および使用委員会に準拠し、承認されました。
1. 24ウェルプレートにおける無菌ポリ-D-リジンおよびラミニンコーティングガラスカバースリップの調製
- ステップ1のすべての手順は、フードの下で、滅菌試薬を使用して、滅菌状態で実行されます。ガラスカバーガラスと二重脱イオン水(ddH2O)は、事前に滅菌する必要があります。プレートの調製は、ニューロン分離の2週間前まで行うことができます。
- ボンネットの下では、滅菌鉗子を使用して、オートクレーブ処理されたガラスカバースリップを24ウェルプレートの12ウェルに配置します。
- poly-D-lysineストックを事前に調製してください。50 mLの滅菌ddH2Oを5 mgのポリ-D-リジンに加えます。.ボルテックスし、-20°Cで3mlのアリコートに保管し、使用前にアリコートを解凍します。
- 最終濃度が25 cm2あたり1 mLのポリD-リジンストックの場合:各ガラスカバースリップ(2 cm2)の上部にポリD-リジンストック80 μlをピペットで取り付けます。溶液を10分間落ち着かせます。
- 真空を使用してポリ-D-リジンを除去し、カバースリップを滅菌ddH2Oで3倍すすぎます。
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結果
LMMP由来細胞を単離した直後には、ニューロンやその他の細胞種を容易に判別することはできません。表現型の不明確な生存している円形の細胞に加え、不完全に消化された組織断片や結合組織などの組織デブリが観察されます。これらの浮遊物は問題ではなく、2日後の最初の培地交換時に大部分が除去されます。それまでにスライドを洗浄しようとしないでください。健康で生存可能な細胞まで一緒に除去されてしまいます。
培養1日後、ニューロンに神経突起の伸展が見え始めます。この時点では、ニューロンの特異的な同定はまだ不明確な場合があります。細胞が実験用チャンバーに転移させるのに十分な接着性を持っているならば、培養1日後から電気生理学的研究が可能です。ただし、細胞は培養2日後により強固に接着し、2〜5日目あたりが機能研究（電気生理学、カルシウムイメージング）に最適です。
培養開始から約1週間後、ニューロンの形態学的特徴が明確になります（図1）。理想的な免疫細胞化学的特徴は、ニューロンが長い突起を伸ばし、グリア細胞が混在するほぼ.......
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ディスカッション
使用動物
このプロトコルは、スイスウェブスターマウス用に最適化されています。ただし、この方法は、ラットなどの他の小型哺乳類や他の系統のマウスに容易に適応できます。C57マウスとμオピオイド受容体ノックアウトによる予備単離に成功しました。ただし、消化管の形態学的変化により、他の系統のマウスが問題になる可能性もあります。さらに、LMMP調製物 13のニューロン回路において、マウス株(C57Bl/6対Balb/c)間に既知の違いがあり、これは最終単離におけるニューロンの混合に影響を与える可能性がある。さらに、加齢に伴うニューロンの喪失は、コリン作動性ニューロンとそれに対応するグリアに特異的な腸神経叢で発生し、 14歳の12か月という早い時期に見られるため、この方法を使用する際には年齢を考慮する必要があります。最後に、このプロトコルを他の種の動物に適応させる場合、筋神経叢が円形筋に付着したままになるのではなく、縦筋と一緒に離れるように注意する必要があります。
使用組織
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開示事項
著者らは、主要な競合する利益は存在しないと宣言します。
謝辞
国立衛生研究所助成金DA024009、DK046367、T32DA007027.
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| 成長カバーガラス用フィッシャーブランドカバーガラス(直径12mm) | フィッシャーサイエンティフィック | 12-545-82 | |
| ポリ-D-リジン | シグマ | P6407-5 mg | |
| 24ウェル細胞培養プレート | CELLTREAT | 229124 | 任意のブランドを使用できます |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | 研究室で準備可能 | ||
| 15 ml 滅菌遠心分離チューブ | Greiner Bio-one | 188261 | 任意のブランドを使用できます |
| 50 ml 滅菌遠心分離チューブ | Greiner Bio-one | 227261 | 任意のブランド |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | フィッシャーケミカルズ | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| グルコース | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 メディア | Gibco | 11330 | |
| ウシ胎児血清 | クオリティバイオロジカル株式会社 | 110-001-101HI | 任意のブランドを使用できます |
| 抗生物質/抗真菌剤 100x液体 | Gibco | 15240-062 | |
| 神経基礎A培地 | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-グルタミン | Gibco | 25030164 | |
| グリア由来神経栄養因子(GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| シャープポインテッド解剖はさみ | フィッシャーサイエンティフィック | 8940 | 、任意のブランドを使用することができます |
| 解剖組織鉗子 | フィッシャーサイエンティフィック | 13-812-41 | 任意のブランドを使用することができます |
| コットンチップアプリケーター | フィッシャーサイエンティフィック | 23-400-101 | 任意のブランドを使用することができます |
| 250ミリリットルの目盛り付きガラスビーカー | フィッシャーサイエンティフィック | FB-100-250 | 任意のブランド2 Lを使用することができます |
| ガラスErlenmyerのフラスコ | フィッシャー科学 | FB-500-2000 | あらゆるブランドの |
| プラスチック棒（子供のペンキのブラシを使用することができます | Crayola | 05 3516 | ブランドを使用することができます |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | 任意のブランド |
| 21 G x 1 1/2 inを使用することができます。皮下注射針 | ベクトン・ディキンソン | 305167 | 任意のブランドを使用できます |
| コラゲナーゼ 2型 | ワージントン | LS004174 | |
| ウシ血清アルブミン | アメリカンバイオアナリシス | AB00440 | |
| 2 mlの微量遠心分離機のエッペンドルフの管フィ | ッシャー科学 | 13-864-252 | あらゆるブランドの |
| Nitrex Mesh 500 µを使用することができます。M | Elko Filtering Co | 100560 | 任意のブランドを使用できます |
| ピペットセット | フィッシャーサイエンティフィック | 21-377-328 | 任意のブランドを使用できます |
| シャープニングストーン | フィッシャーサイエンティフィック | NC9681212 | 任意のブランド |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 生物学的安全キャビネット (細胞培養フード) | Nuaire | NU-425-400 | 任意のものを使用できますブランド |
| 10 L 振とうウォーターバス | Edvotek | 5027 | 任意のブランドを使用できます |
| 微量遠心分離機 5417R | Eppendorf | 5417R | サイズアダプター付きの単一の大型遠心分離機を使用できます |
| Allegra 6 シリーズ遠心分離機 | ベックマン・コールター | 366816 | 任意のブランドを使用できます |
| HuluMixer サンプルミキサー | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow ウォータージャケット CO2 インキュベーター | Nuiare | NU-4750 | 任意のブランドを使用可能 |
| 分析天秤スケール | メトラー・トレド | XS104 | 任意のブランドを使用可能 |
参考文献
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., C....
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