不定冠詞インビトロ準備

腸神経系(ENS)は、消化管(GI)の全長を走る神経とグリアの広大なネットワークです。ENSは、蠕動運動、体液の吸収/分泌、刺激の感覚など、消化のすべての側面を機能的に制御します(レビューについては¹を参照)。脊髄に見られるよりも多い5億個以上のニューロンが含まれており、脳に見られるすべての神経伝達物質クラスが含まれています。さらに、ENSは、中枢神経系からの入力なしに反射的に機能できるという点で独特です²。ENSの理解は、その正常な生理学的役割を理解するだけでなく、先天性(ヒルシュスプルング病)、後天性(シャーガス)、病状への続発性(糖尿病性胃不全麻痺)、薬物誘発性(オピオイド腸症候群)、または損傷による(術後イレ^{ウス)など}、さまざまな神経障害への関与を理解するために非常に重要です。さらに、腸管ニューロンはウイルス感染(水痘帯状疱疹)^の貯蔵庫になる可能性があります3。脳に類似していることと腸内のセロトニンのレベルが高いため、中枢神経系の欠陥の治療を目的とした薬は、ENS ²に望ましくない副作用をもたらすことがよくあります。また、アルツハイマー病やパーキンソン病などの多くの神経障害は、中枢ニューロンに現れるずっと前に腸管ニューロンに同様の細胞変化を示しており、ENSをこれらの疾患の病因を研究するためのアクセス可能なモデルにしていることも注目に値します⁴。したがって、ENSを完全に理解することは、病状を理解し、薬理学的副作用を予防/予測するために必要です。

ENSのニューロンは、伝統的にモルモットで全量製剤^5-7または培養ニューロン⁸を用いて研究されてきました。この大型動物ではニューロンの研究が容易であるにもかかわらず、このモデルには、遺伝子組み換え株の欠如、この種に特異的な試薬の欠如、これらの被験者の注文と収容に関連する高コストなど、多くの制限があります。マウス腸管神経系モデルの開発には、さまざまなノックアウトシステム、細胞培養技術と組み合わせて使用できる他の確立された方法論の膨大な配列、およびモルモットモデルの検証を提供する能力という独自の利点があります。

ENSは、胃腸管の長さを走る3つのプレキシで構成されています。主に腸の蠕動運動に関与する外側の筋神経叢(縦筋と円形の筋肉の間)、および体液の吸収/分泌と刺激の検出を主に制御する粘膜下神経叢と粘膜プレジプチオ(それぞれ粘膜の下と粘膜内に見られる)1 .この方法は、消化管の外側の筋肉層を剥がすことにより、縦方向の筋/腸管神経叢(LMMP)の準備を分離することから始まります。これにより、粘膜層が分離に関与している場合に発生する汚染の問題が劇的に削減されます。その結果、このプロセスは、ENSの分泌作用ではなく、運動性のニューロン制御の研究に理想的です。

ここで紹介する方法は、腸内ニューロンとグリアの混合培養をもたらします。少なくとも2つの異なるタイプのニューロンが、以前の電気生理学的および免疫細胞化学的観察に基づいて^{存在する9。}グリアの存在は、それ自体が研究すべき重要な細胞型であるだけでなく、腸管ニューロン¹⁰の生存に寄与し、ニューロン細胞表面¹¹上の天然受容体発現を維持するため、非常に有利である。さらに、腸グリアの欠乏は、異常な胃腸運動性疾患の状態につながる可能性があり、「神経膠症」¹²と呼ばれています。したがって、ここで紹介するENS培養は、研究に適したいくつかの細胞タイプをもたらします。

この方法論の利点は、分離が容易であること、安価なツール要件、および経験豊富なラボ担当者が技術を習得する時間が短いことです。この方法論の限界には、大量の組織による全体的な細胞収量の低さや、粘膜および粘膜下神経叢からのENSニューロンの排除が含まれます。この手順は、電気生理学、免疫組織化学、シングルセルPCR、およびその他の方法論を専門とする学者にとって非常に有利です。

すべての動物の世話と実験の手順は、バージニアコモンウェルス大学の動物管理および使用委員会に準拠し、承認されました。

1. 24ウェルプレートにおける無菌ポリ-D-リジンおよびラミニンコーティングガラスカバースリップの調製

1. ステップ1のすべての手順は、フードの下で、滅菌試薬を使用して、滅菌状態で実行されます。ガラスカバーガラスと二重脱イオン水(ddH₂O)は、事前に滅菌する必要があります。プレートの調製は、ニューロン分離の2週間前まで行うことができます。
2. ボンネットの下では、滅菌鉗子を使用して、オートクレーブ処理されたガラスカバースリップを24ウェルプレートの12ウェルに配置します。
3. poly-D-lysineストックを事前に調製してください。50 mLの滅菌ddH2Oを5 mgのポリ-D-リジンに加えます。.ボルテックスし、-20°Cで3mlのアリコートに保管し、使用前にアリコートを解凍します。
4. 最終濃度が25 cm²あたり1 mLのポリD-リジンストックの場合:各ガラスカバースリップ(2 cm²)の上部にポリD-リジンストック80 μlをピペットで取り付けます。溶液を10分間落ち着かせます。
5. 真空を使用してポリ-D-リジンを除去し、カバースリップを滅菌ddH₂Oで3倍すすぎます。
6. プレートをボンネットの下で少なくとも2時間乾燥させます。
7. プレートは、ラミニンコーティングに進む前に4°Cまたは-20°Cで保存できます。
8. ラミニンストックを事前に準備してください。ラミニンを氷の上で解凍し、使用中は氷の上に置いてください。50μg/mlの濃度に希釈します。ロットの集中に注意を払ってください。各ロットは異なります。ロット濃度に応じて、約20mlの_ddH2Oがラミニンの各バイアルに添加されます。アリコート(5ml)を-80°Cで保存し、使用前に氷上で解凍してください。
9. カバースリップに5 μg/cm²ラミニンを塗布し、各カバースリップに200 μlのラミニンストックをピペットで塗布します。
10. ラミニン溶液をカバーガラス上で1時間インキュベートします。
11. 残ったラミニン溶液を吸引し、カバースリップをddH₂Oで一度すすぎます。
12. プレートは4°Cで最大2週間保存してください。

2. ニューロン分離溶液の事前準備

1. クレブス溶液(mM単位:118 NaCl、4.6 KCl、1.3 NaH₂PO₄、1.2 MgSO₄、25 NaHCO₃、11グルコース、および2.5 CaCl₂)を調製します。13.79 g NaCl (FW 58.44)、0.686 g KCl (FW 74.55)、0.312 g NaH₂PO₄ (FW 120)、.289 g MgSO₄ (FW 120.4)、4.20 g NaHCO₃ (FW 84.01)、3.96 g グルコース (FW 180.2)、および 0.555 g CaCl₂ (FW 111) を 2 L ddH₂0 に配置します。4°Cに冷やします。
2. リンス培地(10%ウシ胎児血清(FBS)と抗生物質/抗真菌剤を含むF12培地)を調製します:500 mLのF12培地ボトルに、50 mLのFBSと5 mLの抗生物質/抗真菌剤100倍液(Gibco)を加えます。
3. 腸管性ニューロン培地(B-27、2 mM L-グルタミン、1% FBS、10 ng/ml、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、および抗生物質/抗真菌剤100倍液を含む神経基礎A培地)を調製します。GDNFストックを作るには、1 μgのGDNFに1 mLのddH2Oを加え、50 μlのアリコートで凍結し、-80°Cで保存します。50 mLのバイアルに1つの完全ニューロン培地を1本入れるには、47.5 mLのNeurobasal A培地、1 mLのB-27(50倍)、500 μLのFBS、500 μLの200 mM L-グルタミン(Gibco)、50 μLのGDNFストック、および500 μLの抗生物質/抗真菌剤100倍液を組み合わせます。培地は、GDNFの鮮度を確保し、この高価な細胞培地混合物の大量汚染を避けるために、50 mLの小さなバッチで製造されます。

3. マウスから縦筋/筋神経叢(LMMP)の調製物を採取

1. 動物実験を行う前に、適切な国家的および制度的倫理が整備されるべきである。体重が25gを超える成体(通常は8週齢以上)の成体スイスウェブスターマウスは、実験前に6匹のグループで飼育されます。回腸神経ニューロンとグリアの分離には2匹のマウスの組織を使用し、結腸細胞の分離には3匹のマウスを使用します。
2. 手術エリアを準備します。小さな手術用ハサミ、角度付き鉗子、綿棒、200mlのガラスビーカー3本、ガラス/プラスチック棒(絵筆)を集めます。汚染を最小限に抑えるために、使用前にすべての消耗品を徹底的に洗浄してすすいでください。このステップは、実験の前日に実行できます。
3. クレブス溶液を氷の上に置き、カルボゲン(95%酸素、5%CO₂)で少なくとも30分間泡立ててpHを安定させます。
4. さまざまな機器と温かい化学薬品の電源を入れて、目的の温度で安定させます。水浴を37°Cに加熱し、遠心分離機を4°Cに冷却し、ハンク平衡塩溶液(HBSS)と0.5%トリプシンを水浴(37°C)に入れます。完全なニューロン培地とリンス培地は冷蔵したままにする必要があります。
5. 150mlの氷冷泡クレブスを、「ダーティ」、「クリーン」、「LMMP」のラベルが付いた3つの200mlガラスビーカーに入れます。カルボゲンで「LMMP」とラベル付けされたバブルビーカー。
6. 倫理委員会の承認後、マウスを頸部脱臼またはCO₂窒息により安楽死させます。
7. マウスを手術面の背側横臥にし、70%EtOHで皮膚をきれいにし、鉗子を使用して腹部の皮膚を持ち上げます。ハサミを使って腹腔を開き、内部の消化器官を露出させます。
8. 回腸の一部を持ち上げ、その腸間膜を明らかにすることにより、胃腸管の長さを取り除きます。ハサミで腸間膜を切り取り、回腸/結腸から腸間膜を引っ張らないように注意しながら、回腸と結腸を優しく取り除いて解きます。
9. 腸の全長が解けたら、胃の遠位と盲腸の近位にある腸を切開して回腸を取り除きます。注:この手順は、結腸を盲腸の遠位から肛門の近位まで切除することにより、結腸組織でも実行できます。
10. 組織はさらに、近位結腸と遠位結腸、空腸、回腸に分けることができます。この手順の残りの部分では、回腸の分離を参照します。手順は、結腸LMMPの分離についても同じです。回腸全体を「汚れた」とマークされた氷冷したクレブスを入れたガラス容器に入れます。
11. 回腸を洗浄するツールを作成し、ヤスリストーンを使用して大きな20Gの針を鈍くし、氷冷したクレブスが入った大きな注射器(10 ml)に取り付けます。
12. 回腸を3つ以上の大きな部分に切片にして、回腸から糞便を取り除きます。ビーカーから回腸切片を取り外し、鈍い針を回腸片の端に置きます。
13. すべての糞便が別の廃棄物容器に取り除かれるまで、クレブスを腸のセクションにそっと通します。洗浄した部分を「クリーン」とマークされたクレブスの容器に入れます。回腸全体がきれいになるまで繰り返します。
14. LMMPを取り外すには、回腸を約2〜4cmの小さなセグメントに切ります。プラスチックまたはガラスの棒に回腸のセグメントを置きます。回腸はぴったりとフィットしますが、緩んだりぴんと張ったりしないでください(~2 mm)。鉗子を使用して、まだ胃腸(GI)管に付着している腸間膜の断片を穏やかに除去することにより、LMMPの除去を開始します。親指を使用してチューブをロッドにそっと固定することにより、GI管がロッドの周りを回転するのを防ぎます。
15. LMMPを下にある円形筋から分離します;まず、腸間膜が付着した線全体に沿って鉗子の端をセグメントの上から下に優しくこすり、縦筋に緩やかに隙間を作ります。次に、クレブスで濡らした綿棒を使用して、縦方向の筋肉をやさしくからかいます。
16. 縦筋の隙間の上部から始めて、縦筋が円形筋から分離し始めるまで非常に軽い圧力をかけながら、最も軽い水平ストロークを使用してからかいます。
17. 次に、消化管の周りをゆっくりと動かし始め、縦筋が管の周りで円形の筋肉からゆっくりと分離するにつれて、上から下へ、そして戻します。完了すると、LMMPはGIチューブの残りの部分から自然に外れます。
18. 得られた縦筋の細いストリップを「LMMP」とマークされたビーカーに入れます。すべてのセグメントに対して繰り返します。
19. 1 つのマウスから LMMP のすべてのストリップを収集したら、使用している他のマウスに対して手順を繰り返します。再利用する前に、「汚れた」ビーカーと「きれいな」ビーカーをよくすすいでください。
20. LMMPを3xすすぎ、生物学的汚染を取り除きます。2mlのエッペンドルフチューブ3本に氷冷したクレブスを入れます。LMMPストリップを最初のチューブに入れ、4°Cに冷却した遠心分離機で356 x gで30秒間回転させ、ピペットで上清を慎重に取り除き、LMMPストリップを次にきれいなクレブス充填チューブに移します。残りのチューブごとにこの手順を繰り返します。

4. LMMPをダイジェストする

1. 10 mLのカルボゲン泡状クレブス溶液に13 mgのコラゲナーゼ2型および3 mgのBSAを入れて消化溶液を調製します。
2. すすぎたLMMPの一部を消化液に入れ、はさみを使ってLMMPを細かく切り取ります。
3. LMMPをシェーカー付きのウォーターバスで37°Cで60分間消化し、カルボゲンで穏やかに泡立てます。
4. 消化が完了したら、4°Cに冷却した遠心分離機で356 x gで8分間遠心分離して細胞を採取します。
5. この時点から、すべての手順は細胞培養フード内の無菌条件下で行う必要があります。すべての試薬と容器は、使用前に滅菌する必要があります。
6. 遠心分離中に、温めた0.25%トリプシン1 mLと温めたHBSS4 mLを滅菌した50 mLの細胞培養チューブに入れて、0.05%トリプシン溶液を調製します。
7. 遠心分離後、上清を取り除いて廃棄します。掃除機は使用しないでください。これにより、遠心分離速度が遅いため、細胞ペレットが吸い込まれる可能性があります。細胞ペレットを慎重に取り出し、5mlの0.05%トリプシン溶液を入れたきれいなチューブに入れます。
8. 0.05%トリプシン溶液中の細胞を37°Cのウォーターバスで7分間振とうしながら消化します。トリプシン治療の合計7分を超えないと、ニューロンが死滅します。
9. トリプシン処理の7分後に10mlの冷たいすすぎ媒体でトリプシンを中和します。
10. 細胞を356 x gで8分間遠心分離します。メディアを取り外して廃棄します。
11. 遠心分離中に、滅菌した15 mLの細胞培養チューブの上に滅菌したNitexメッシュの一部のバランスを取ります。
12. 遠心分離後、上清を取り除いて廃棄します。3 mLの完全ニューロン培地でトリチュレートすることにより、細胞混合物を穏やかに再懸濁します。このステップおよび細胞混合物がトリチューンされる将来のすべてのステップで気泡が発生しないようにしてください。すべてのトリチュレーションは非常に穏やかに行う必要があります。Nitexメッシュを介して細胞溶液を清浄な15 mL細胞培養チューブにろ過します。
13. オプション:細胞培養チューブにキャップをし、冷蔵フラミキサー(または回転可能なミキサー)に入れ、30分間ゆっくりと転がし、傾けます。この手順はオプションですが、推奨されます。
14. オプション:フラミキサーの後、2mlのコールドリンスメディージを加えて細胞を洗浄します。
15. 遠心分離(8分、356 x g)で細胞を採取します。上清を取り除き、廃棄します。
16. 細胞を1,200 μlの完全ニューロン培地に再懸濁します。1 mLのプラスチック製ピペットチップを使用して細胞を穏やかに滴下します。気泡を発生させないでください。ほとんどのチャンクが分かれ、細胞が液体に懸濁されるまで、ゆっくりと穏やかにピペットで撫でます。
17. プレコートガラスカバースリップを含む12個のウェルのそれぞれに750 μlの完全培地を加え、トリチュレートした細胞溶液100 μlを加えます。
18. 細胞培養インキュベーターでニューロンを37°Cで5%_CO2でインキュベートします。
19. 細胞培地の半分を2日ごとに交換します。
20. ニューロンは、培養で1〜2日後に電気生理学的記録の準備ができています。

LMMP由来の細胞、ニューロン、その他の細胞タイプの分離直後は容易には明らかになりません。不明瞭な表現型の生きた丸い細胞や、不完全に消化された組織片や結合組織からの組織残骸が見られます。この漂流物は問題ではなく、2日後の最初のメディア交換で大部分が取り除かれます。この前にスライドを掃除しようとしないでください、健康で生存可能な細胞も同様に除去されます。

培養後、ニューロンは神経突起の成長を示し始めます。ニューロンの具体的な同定は、現時点ではまだ不明瞭である可能性がある。細胞が実験チャンバーに移すのに十分な接着性があれば、1日の培養後には電気生理学的研究の準備が整います。しかし、細胞は培養で2日後にはより接着性が高くなり、約2〜5日目の機能研究(電気生理学、カルシウムイメージング)に最適です。

ニューロンの形態学的特徴は、培養で約1週間後に明確になります(図1)。理想的な免疫細胞化学的特徴は、ニューロンが長い突起を示し、グリアが点在するほぼ「神経節」のような方法で成長する約10日後に特定できます(図2)。この染色は、この方法論を用いてこれらの細胞のシナプス相互作用を研究することが可能であることを示唆しています。

培養後、ニューロンはsine que nonまたは「定義する特徴」、つまり活動電位によって認識されます(図3)。電気生理学的には、それらは機能的に少なくとも2つのニューロンタイプに分類できます:ナトリウムとカリウムの過分極後と電流/密度関係の増加を含むニューロンと、後過分極を持たず、ナトリウムとカリウムのコンダクタンスが大幅に少ないニューロンです(図4)。AHPの陽性ニューロンと陰性ニューロンは、それぞれ以前のギニアの研究で見られたAHニューロンとSニューロンと相関しているようです。AHP陽性ニューロン(AHニューロン)は細胞体の周囲に複数の長い突起を持ち、AHPネガティブニューロン(Sニューロン)は1つの長い突起が何度も分岐します。これは、図1の免疫細胞化学的コードと併せて、ニューロン集団が非常に不均一であることを示唆しています。

図 1.マウス縦筋から単離された腸内ニューロンおよびグリアの免疫組織化学的特性評価。共焦点顕微鏡法により、マウスの全マウント回腸縦筋(A)調製物におけるニューロン特異的なβ-III-チューブリン(Abcam、ウサギ、1:1,000)の染色が明らかになりました。縦筋/筋神経叢(LMMP)調製物から単離された細胞には、ニューロン(B;β-III-tubulin、アブカム、ウサギ、1:1,000)が含まれており、カルビンジン(C)(ケミコン、ウサギ、1:1,000)およびカルレチニン(D)(Swant、ウサギ、1:2,000)に陽性染色します。グリア細胞(E)は、グリア特異的マーカーGFAP(Chemicon、マウス、1:500)で可視化しました。抗体は、適切なヤギ二次抗体Alexa 488(緑、Molecular Probes、1:1,000)0を用いて可視化しました。核はHoescht 33342(青、C-G、1 μg/ml)を用いて可視化しました。一次抗体を省略した場合(F)、染色は見られませんでした。Smith, T.H., et al.モルヒネは、ナトリウムチャネルの阻害を介して腸内ニューロンの興奮性を低下させます。PLoS One., doi:10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012).大きな図を見るにはここをクリックしてください。

図 2.マウスの縦筋から分離されたニューロンとグリアは、互いに近接して成長します。共焦点顕微鏡画像は、ニューロン(緑、β-III-チューブリン、アブカム、ウサギ、1:1,000)とグリア(赤、GFAP、ケミコン、マウス、1:500)が互いに隣接して容易に成長し、in vitroで相互作用しているように見えることを示しています。大きな図を見るにはここをクリックしてください。

図 3.培養腸管ニューロンとグリアの電気生理学。電流クランプモードでは、電流注入時にすべてのニューロン(A)が活動電位を示しました。グリア(B)は活動電位を持っていませんが、電流注入に応答して大きな電気張電位を示します。A および B のプロトコルは、-0.01 nA の電流注入から始まり、11 の 0.01 nA ステップで 0.09 nA まで増加します。大きな図を表示するにはここをクリックしてください。

図 4.マウス回腸から培養されたニューロンは、電気生理学的に不均一な集団です。電流クランプ・モードでは、ニューロンに0.09nAの電流を注入すると、活動電位が発生します。Sニューロン(A)は、刺激後すぐに静止膜電位に戻ります。AH型ニューロン(B)は、刺激後に後過分極(AHP)を示し、静止膜電位がベースラインを下回った後、ゆっくりと初期値に戻ります。Smith, T.H., et al.モルヒネは、ナトリウムチャネルの阻害を介して腸内ニューロンの興奮性を低下させます。PLoS One., doi:10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012).

著者らは、主要な競合する利益は存在しないと宣言します。