顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

サマリー

アフリカツメガエル胚の間の顔の組織が ​​開発された「エクストリーム前部ドメイン」移植する技術。組織は、頭蓋顔面および開発のための顔領域間の相互作用をシグナリングするための地域の要件の研究を可能にする、別に1つの遺伝子発現のバックグラウンドを移動させることができる。

要約

頭蓋顔面の先天性欠損症は、すべて700出生のうち1つで発生したが、病因はほとんどのため、頭蓋顔面の開発の限られた理解に知られていない。シグナル伝達経路や組織が ​​発達顔のパターン形成中に行動する場所を特定するには、「顔面移植」技術はカエルアフリカツメガエルの胚で開発された。推定ティッシュ（「エクストリーム前方ドメイン」（EAD））の領域は、尾芽段階でドナー胚から除去され、同等の領域が除去された同じステージの宿主胚に移植する。これは、ホストまたはドナー組織は遺伝子機能の損失又は利得を有し、および/または系統標識を含むキメラ面を生成するために使用することができる。顔領域を容易に大規模であり、次のように治癒した後、現像の結果を監視し、ドナー又は周囲の宿主組織内シグナル伝達経路の役割を示している。 アフリカツメガエルは 、顔の開発のための貴重なモデルであるマイクロマニピュレーション用ccessible。多くの胚は、開発が急速に起こるため、短い期間にわたって、アッセイすることができる。頭蓋顔面のプロセスは、アフリカツメガエルと哺乳類の間で保存現れるので、カエルでの調査結果は、人間開発に関連している。

概要

頭蓋顔面の先天性欠損症^1〜2のメカニズムを理解するために、頭蓋顔面の開発における重要な組織とそのシグナル伝達の寄与が特定されなければならない。カエルアフリカツメガエル、外胚葉と内胚葉、直接^3-4並置されている「エクストリーム前歯ドメイン」（EAD）、から口や鼻の穴の形を含む顔の一部では、。 EADはまた、顎や他の顔領域^5を形成^し 、頭蓋神経堤など、周囲の組織に影響を与えるために、シグナリング·センターとして機能します。組織が対応するホスト領域を除去した後に、ホスト胚にドナーから移植されている場合、EADの機能に寄与する遺伝子を同定するために、「顔面移植」技術は、開発されました。移植後、顔の発達を生じることは評価される。このように、機能の喪失（LOF）またはEAD内の特定の遺伝子のための機能（GOF）の利得の効果は、局部的に分析したところ、Hの残りの部分EADと体は、野生型組織から構成されている。野生型組織特異的遺伝子のグローバルLOFまたはGOFを有する胚に移植される移植逆数を行うことができる。移植は、しばしば、アフリカツメガエルおよびニワトリの試験⁶で用いられてきた。例えば、 アフリカツメガエルの移植が単純発生の神経誘導、レンズや神経の能力、および神経堤の移行^7月10日に対処しています。ウズラ、ひよこキメラ移植は、前神経板、前方神経尾根、神経堤、....

プロトコル

1。試薬の調製

1. 10倍のMBS：バース生理食塩水（MBS）溶液¹⁷修正10倍の1リットルを準備します。 表1、試薬、成分、および手順を参照してください。すべてのソリューションのために、蒸留水を使用してください。完全に溶解するまで、撹拌棒を使用して、ビーカーに混ぜる。すべての溶液は室温でなされるべきである。
2. 1X MBS：1X MBS 1リットルを作るために蒸留水900ミリリットルに100ミリリットル10倍のMBS溶液を希釈。 1 M CaCl ₂溶液の0.7ミリリットルを追加します。
3. 0.1×MBS：希釈1×MBS 0.5×MBS溶液および0.1×MBS溶液の2 LのL 1を調製する。 0.1×MBS溶液1リットルに、10 mg / mlのゲンタマイシン溶液1mlを加える。ゲンタマイシンと0.1×MBS溶液は、長期間の胚の培養に使用される。
4. フィコール/ MBSは：0.5×MBS溶液500mlにフィコール400の15グラムを追加します。積極的に混ぜる。攪拌棒を追加し、フィコールが完全に（数時間）に溶解するまで混合する。
5. 70％エタノール：70％エタノール、100％エタノールを用いて希釈する蒸留水。

2。ガラス営業ツールの準備

1. 針の準備：....

結果

図3Aに示すように、移植された組織は、完全に移植後に宿主ヘッド内に挿入されるべきであり、 図2BCに示すように、ガラスブリッジは、適宜、胚の顔の上に配置されている。移植を成功させるために移植されたドナー組織が正しく、ホストオープニングサイズにする必要があります。 図3B及び3Cに見られるようにEAD組織は、どのような方法で、頭部から突出しないようにしてください。 図3（d）に示すように加えて、顔の移植は、ドナーの体での位置に対して回転してはならない。数時間後、移植組織および周囲の顔が癒しべきであり、次の日までに、胚は、 図4Aおよび図4（a） 'に示した例のように表示されます。一つは、移植は、 図4（b）の所定の位置に残っていること、蛍光の下で、観察することができます。ステージ41には、移植された対照組織はCONTRます口にibuteし、「図4.......

ディスカッション

重要なステップと制限：EADの顔面移植の手順は時間であり、集中して作業。それは完璧に練習、着実に手や器用さを必要とします。顔面移植プロトコルは、効率的に組織を除去し、移植する研究者の能力に依存しています。 1ホストの顔を移植を挿入するためには長すぎるがかかる場合は、ホストの顔は収縮し、癒すために開始されます。鉗子は、微妙に顔領域を拡張するために使用することができます。有意な創傷収縮が発生した場合は、移植ならびに治癒せず、宿主の顔の穴にフィットするようにサイズを小さくする必要があるかもしれない。移植のサイズと形状は、ほぼ正常な挿入を可能にするために、受信者の顔の空洞の大きさや形状と一致する必要があります。

ステージによってマッチングされた胚で、ステージ19〜22の間で実行時に顔移植は最も成功している。ステージ22〜26の間の古い顔移植は、可能であるが、より困難であるANクレスト·フリー正中領域は、ステージ22から26と大幅に狭くなるため、Dは、顔の両側に神経堤の移行を妨害することがあります。

受信者とドナーの両方.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
パスツールピペット	VWR	14672-400	ライムグラス
サイズ5 3/4 in	コットンプラグ目
盛り付きトランスファーピペット	VWR	16001-180
#5/45鉗子	ファインサイエンスツールデュポンメディカル	11251-35	角度45°
標準パターン鉗子	ファインサイエンスツール	11000-20	ストレート;鋸歯状チップ;ステンレス鋼
キャピラリーチューブ(針用)	FHC	30-30-1	ホウ素1.0 mm OD x 0.5 mm ID /ファイバー
カバースリップ	VWR	48393 252	24 x 60 mm マイクロカバーガラス;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
ニードルプラー	Sutter Instrument Co	Needle Puller:生産終了 Filament:FB300B	最も類似した、現在入手可能な ニードルプーラーはP-97です。フィラメントには、幅3.0mmのSutter 3.00 mm角ボックスフィラメントを使用します。
モデル P-80	フレーミング / ブラウン マイクロピペットプーラー
実体顕微鏡	Zeiss
実体顕微鏡 Lighting by Fostec	フォステック		アームが2本付いたライトボックスを使用します。
ニッケルメッキピンホルダー	ファインサイエンスツール	26018-17	顎開口部径:0-1 mm
モリアニッケルメッキピンホルダー	ファインサイエンスツール	26016-12	顎開口部直径:0-1 mm
タングステン針	ファインサイエンスツール	10130-05	0.125 mmロッド径
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
クレイ-白、赤、または黄色
mMessage mMashine SP6またはT7キット	Ambion	AM1340

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