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方法論記事

ヒト早老症WRNエキソヌクレアーゼのオルソログであるDmWRNexoを特徴付けるための蛍光ベースのエキソヌクレアーゼアッセイ、および他のヌクレアーゼへの応用

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DOI:

10.3791/50722

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2013年12月23日

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Oxford

この記事について

サマリー

エキソヌクレアーゼは、ゲノムの安定性を確保する上で重要な役割を果たします。WRNエキソヌクレアーゼ機能の喪失は、早期老化をもたらします。ヌクレアーゼの基質やその他の要件をin vitroで研究することは、in vivoでのヌクレアーゼの役割を解明するのに役立ちます。ここでは、そのヌクレアーゼ活性を測定するための迅速で再現性のある蛍光ベースのアッセイを実証します。

要約

WRNエキソヌクレアーゼは、DNA複製中または内因性または外因性のジェノトキシンへの曝露後に発生するDNA損傷の解決に関与しています。これは、WRNを欠く細胞の超組換え表現型と一致する、一過性の失速した複製フォークで蓄積する再結合性中間体の蓄積を防ぐ役割を果たす可能性があります。ヒトでは、エキソヌクレアーゼドメインは、ヘリカーゼ活性も持つはるかに大きなタンパク質のN末端部分と、DNAとタンパク質の相互作用に重要な追加の部位で構成されています。対照的に、ショウジョウバエでは、WRN(DmWRNexo)のエキソヌクレアーゼ活性は、推定ヘリカーゼとは異なる遺伝的遺伝子座によってコードされており、ゲノム安定性メカニズムにおけるエキソヌクレアーゼ活性の役割の生化学的(および遺伝的)分析を可能にします。ここでは、精製された組換えDmWRNexoおよび末端標識蛍光オリゴヌクレオチドを使用して、WRNエキソヌクレアーゼ活性を測定する蛍光法を示します。このシステムは、基質オリゴヌクレオチドが数ヶ月間安定なままであるため、放射性アッセイよりも高い再現性を実現し、ヌクレアーゼ活性の詳細な分析のためのより安全で比較的迅速な方法を提供し、ヌクレアーゼの極性、処理能力、および基質の好みを決定することができます。

概要

ヌクレアーゼは、損傷したDNAの除去、ホリデイジャンクションなどの非二本鎖構造の分解、DNA複製中の校正能力の提供において、DNAポリメラーゼ内およびそれらに対する外因性の両方で重要な役割を果たします1。ヌクレアーゼは、DNAを自由末端から順次分解するか(エキソヌクレアーゼ)、またはより長いDNA分子内の内部ホスホジエステル結合を切断することによって作用します(エンドヌクレアーゼ)。ヌクレアーゼ活性の喪失は、非常に特異的なゲノム不安定性の表現型を引き起こす可能性があります。RecQヘリカーゼファミリーのメンバーであるBLMの突然変異は、姉妹染色分体交換の過度に高い率と世界的に高い癌率をもたらしますが(PayneとHicksonによるレビュー2)、高度に関連したWRNタンパク質の突然変異は早期老化につながります3;これら2つのファミリーメンバーの主な有意な違いは、WRN4に3'-5'エキソヌクレアーゼドメインが存在することです。WRNエキソヌクレアーゼがゲノムの安定性を維持する上で重要な役割を果たすという証拠は、WS患者5の遺伝子型の解析と、単離されたエキソヌクレアーゼドメイン6の結晶学的研究に裏打ちされたヒト細胞の点突然変異および欠失研究から蓄積されています。しかし、WRNのエキソヌクレアーゼ活性とその中心ヘリカーゼ活性7との間の協力とクロストークは、それぞれの機能とゲノム安定性への相対的な寄与を切り離すことを困難にしています。植物および下等後生動物では、WRNエキソヌクレアーゼ活性は、ヘリカーゼ活性を欠く単一のポリペプチドに存在します8-10(Cox and Boubriak11でレビュー)。シロイヌナズナでは、このエキソヌクレアーゼが同族のWRNヘリカーゼと協調して作用し、脊椎動物のWRN9で観察された複合酵素活性を効果的に再構成することが生化学的に実証されています。ショウジョウバエのWRNエキソヌクレアーゼを研究してきたのは、優れた遺伝ツールにより、エキソヌクレアーゼ変異の影響を(推定同族ヘリカーゼに影響を与えることなく)生物全体レベルで、そして開発を通じて分析できるからです10,12。さらに、我々は、遺伝子組換えショウジョウバエWRNエキソヌクレアーゼ(DmWRNexo)をクローニング、発現、精製し、その酵素特性13,14の完全な生化学的分析を可能にしました。

ヌクレアーゼin vitro分析は、従来、放射性標識オリゴヌクレオチドを用いて行われており、アクリルアミドゲル4,8,15上の生成物のラダーを探して分解を評価してきました。このようなアッセイは高感度ですが、標識された基質の放射性崩壊のため、日常的に定量的に再現性がありません。さらに、放射性試薬の取り扱いと廃棄は、重大な環境および健康問題を引き起こします。放射性標識の調達もますます問題になっています。別の最近の方法は、質量分析16によって最終分解生成物の量を評価する。しかし、時間がかかり(数日かかる)、特殊な機器が必要であり、読み出されるのは最終生成物(単一ヌクレオチド)の量であるため、酵素の処理能力などの側面を高感度で測定したり、一部のヌクレオチド、配列、または修飾がヌクレアーゼの一時停止または停止につながるかどうかを判断するのには適していません。これらの問題を解決するために、私たちは従来のゲルベースのアッセイを蛍光オリゴヌクレオチド基質と併用するために適応させ、長期間にわたって再現性よく使用できる安定して標識された基質を生成し、さまざまな条件下でのヌクレアーゼ活性を直接比較できるようにしました。

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プロトコル

1. 基質オリゴヌクレオチドの調製

  1. カスタムオリゴヌクレオチドを合成します。
    1. 5'結合フルオレセイン分子を持つ1本の一本鎖オリゴヌクレオチドを設計し、これがすべての基質のバックボーンとなります。(これは3'-5'エキソヌクレアーゼ用であり、5'-3'極性エキソヌクレアーゼ用は3'-共役骨格鎖を使用することに注意してください)。極性が不明な場合は、3'と5'の両方をテストする必要があります。
    2. 蛍光標識されたオリゴヌクレオチドにアニールすると、選択した二本鎖基質が形成されるように相補的な鎖を設計します。相補鎖は蛍光色素に結合していないことに注意してください。ご注文の際は、PAGE-purification (脱塩では不十分) と指定してください。
    3. オリゴヌクレオチドストックは、1 nmol/μlで10 mMにバッファーを含ませ、-20°Cおよび暗所で保存してください。
  2. バックボーン標識オリゴヌクレオチドを、各相補的非標識オリゴヌクレオチドと、標識:非標識バッファー(10 mM Tris-HCl pH 7.6、1 mM EDTA pH 8.0、50 mM NaCl)の1:1.2モル比で混合します。(注:1:1の比率が最も望ましいですが、ラベル付けされたすべてのストランドが結合していることがより重要です。1:1 - 1:1.5の比率が機能します。
  3. ウォーターバスまたはヒートブロックを95°Cに加熱し、アニーリング混合物をこれに3分間入れてからスイッチを切り、全体をゆっくりと(1°C/分)30°C未満まで冷却します。
  4. 得られた二本鎖基質を天然の10%ポリアクリルアミドゲル(10% 19:1アクリルアミド:ビスアクリルアミド、1x Tris-Borate-EDTA(TBE、89 mM Tris base、89 mM ホウ酸、2 mM EDTA)に0.05% w/v/v過硫酸アンモニウム(APS)および0.005% v/v TEMEDで重合)上で泳動することにより、標識オリゴヌクレオチドの完全なアニーリングを確認します。PhosphorImager を使用して視覚化します (以下のセクション 5 を参照)。

2. アクリルアミドゲルの調製

  1. 16 cm x 18 cmのプレートと1.5 mmのスペーサーを備えたHoefer SE400ゲルリグなどのゲルキャスティングシステムをセットアップします。
    1. ガラスプレートとスペーサーは、洗剤と水を使用して完全に清掃します。指の油でプレートが再汚染され、一貫したゲル形成が妨げられるのを防ぐために、清潔な手袋を着用してください。
    2. プレートを大量の蒸留水(脱イオン水)ですすいで洗剤の残留物を取り除き、糸くずの出ないティッシュ(キムワイプなど)で拭きます。
    3. 最後に、70%エタノールをスプレーして拭きます-ガラスプレートがきれいであればきしむはずです。エタノールの最後の部分が蒸発するのを待つために、直立させておきます。
    4. 残りのゲル形成装置を蒸留水で洗浄し(必要に応じて最初に洗剤を使用してください)、乾かします。
    5. ガラスプレートとスペーサーをゲル形成リグに組み立て、システムが漏れないことを確認します。
  2. ゲル溶液を所望のポリアクリルアミドの割合まで調製します
    1. ヌクレアーゼアッセイには、1x TBE中の8 M尿素を含む変性14%ポリアクリルアミドゲルを使用します。
    2. 100 mL(漏れに十分な余剰分があるゲル2個分)を作るには、幅の広いビーカーに48.05 gの尿素を取り込み、40%アクリルアミド溶液35 mLと10x TBE(890 mM Tris、890 mM ホウ酸、20 mM EDTA、pH 8.3、NaOHを含む)を10 mL加えます。注意:手袋を着用してください-アクリルアミドは強力な神経毒です。攪拌子とマグネチック攪拌板を使用して尿素を溶解します(これには時間がかかります)。
    3. 溶解したら、100 mLにミリQ脱イオン水を加え、0.22 μmのメンブレンでフィルター滅菌します。すぐに使用しない場合は、吸引装置を使用して短時間脱気し、暗所で保管してください(数日保管します)。尿素が沈殿しますので冷蔵しないでください。
  3. ゲルを重合してキャストします。
    1. 尿素アクリルアミドを10%(w/v)過硫酸アンモニウム0.5 mL (APS、蒸留水で組成) とTEMED50 μlを加えます。容器をゆっくりと渦巻かせて、重合を阻害する空気を与えずに混合し、ゲルフォーマーに注ぎます。迅速に行動しないと、注ぎが終了する前にゲルが固まる可能性があります。
    2. サンプルローディング用のウェルを形成するために適切なコームを追加します(分析するゲルリグとサンプル数に応じて選択されます(例:15歯または29歯のコームはHoeferゲルリグでの使用に適しています)。コームの歯の下に気泡が入っていないことを確認してください。
    3. セットに任せてください。漏れを監視します。完全な重合は、大気との接触によりコームで遅延します。ウェルが固まると、残りのゲルがセットされます。
    4. コームを取り外し、水とピペットを使用して未重合アクリルアミドを洗い流します。
  4. ランニング用にジェルをセットします。
    1. キャストゲルをゲルランニングシステムにセットし、適切な量の1x TBEランニングバッファーを下部チャンバーとゲルウェルに加えます。これで、ゲルをロードする準備が整いました。

3. Hisタグ付き組換えDmWRNexoタンパク質の調製

  1. DmWRNexoタンパク質の細菌発現
    1. 接種ループを使用して、-80°Cに維持されたグリセロールストックの表面をこすり落としてバクテリアを採取します(バクテリアはpIVEX2.3d-DmWRNexoで形質転換された大腸菌T7 Iq LysY(NEB)です)。LB寒天プレート(トリプトン10 g、酵母抽出物5 g、NaCl 5 g、15 g寒天、蒸留水で最大1 L、pH 7.4に調整)に50 μg/mlアンピシリンを付着させてストリークします。逆転させて37°Cで一晩インキュベートします。
    2. プレートから1つのコロニーを50 mL LB(トリプトン10 g、酵母抽出物5 g、蒸留水で最大1 Lまで調製)に50 μg/mlのアンピシリン(水中で調製し、0.22 μmにフィルター滅菌)を添加した1コロニーを選択します。220rpm、37°Cで一晩振とうしながら成長させます。
    3. LB-アンピシリンの 1.8 L (適切な通気を確保するために 3 つの 2 L 円錐フラスコにそれぞれ 600 ml のアリコート) を一晩 50 ml 培養して接種し、OD600 ~ 0.8 まで成長させます。IPTGを最終濃度0.7 mMまで添加し、26°Cでインキュベート(タンパク質凝集を防ぐため)し、4〜8時間振とうします。
    4. 8,000 rpm 4 °C で 10 分間遠心分離して細胞ペレットを回収します - それぞれに 300 ml の細胞懸濁液が入った 500 ml の滅菌プラスチック遠心分離ボトルを 6 本使用します。上清を捨て、ペレットを元のLB-ampの少量(10 ml)に再懸濁し、15 mlのFalconチューブに移し、5,000 rpmで再スピンして細胞をペレット化します-上清を再度除去し、-80°Cで凍結します(これは溶解に役立ちます)。
  2. 細菌細胞溶解
    1. 5 M NaCl 1 mL、1 M DTT、1 M ベンザミジン 200 μl、10 mg/ml リゾチーム1 mL(蒸留水に再懸濁)を含む 3.2 mL の溶解緩衝液を調製します。
    2. 300 mLの細菌懸濁液に由来する各ペレットに、320 μLの溶解バッファーを加えます。可能な限り再懸濁します - 「ソーオフ」されたp1000チップを使用して、ピペッティングで上下に攪拌します。氷上で20分間インキュベートします。さらに100 μlの溶解バッファーを加えてよく混合し、再懸濁したライセートをできるだけ多くマイクロチューブに移します(非常に粘性が高く、ピペットが入りにくくなります)。
    3. ライセートを14,000rpmで、予冷したマイクロフュージローターで4°Cで30分間遠心分離し、その後、上清を清潔なマイクロフュージチューブに持って行きます。
  3. Hisトラップ精製
    1. 試薬の調製:40 mM、60 mM、100 mM、300 mM、および500 mMのイミダゾール濃度のそれぞれについて、5本のマイクロチューブを標識します(例:標識40-1、40-2、40-3など)。 チューブを氷の上に蓋を開けてラックに保管します(ただし、他のすべてを準備する間、清潔に保つために、ラップフィルムなどでゆるく覆います)。希釈剤として1x PBS(8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4、pHを7.4に調整し、蒸留水で最大1 L)を使用して、25 mLの20 mMイミダゾールと他の濃度のイミダゾールのそれぞれ10 mLのストックを25 mLユニバーサルチューブに調製します。
    2. 適量の2Mイミダゾール原液を使用して細菌溶解物を20 mMイミダゾールに調整し、20 mMイミダゾールを使用して容量を少なくとも1 ml(<5 ml)に調整します。.
    3. 1 mL の His-Trap カラム(Amersham)を 10 mL の MilliQ 水で 5 mL または 10 mL のシリンジとルアーロック、穏やかな手動圧力で洗浄し、PBS で組成した 10 mL の 20 mM イミダゾールを通過させてカラムを平衡化します(上記のステップ 3.3.1 を参照)。
    4. ライセートをカラムにロードします。ライセートがカラムにロードされると、大きな背圧がかかる可能性があります。これは完全に正常です。シリンジに力を入れすぎないように、圧力を一定に保ちます。通常、ライセートがカラムに入ると軽度の色の変化が見られます。流れをSterilinビジューボトル(容量7 ml)に集め、氷上に保存します。
    5. カラムを 10 mL の 20 mM イミダゾールで洗浄し、これを氷上の 25 mL ユニバーサルチューブに集め、「wash」とラベル付けします。
    6. 5 mLの40 mMイミダゾールをカラムに通し、1 mLの画分を各マイクロチューブ(40.1、40.2、40.3などとラベル付け)に収集します:これにより1 mlの測定が可能になるため、シリンジのプランジャーを注意深く観察します。
    7. 次に、60 mM、100 mM、300 mM、および500 mMのイミダゾールをそれぞれ5 mLを順次通過させ、各塩濃度で5 x 1 mlの画分を再度収集します。
  4. カラムフラクションの分析
    1. ドットブロット:各カラム画分のドット2 μlをニトロセルロースのシートに(また、ロード、フロースルー、洗浄も)します。これは、柔らかい鉛筆を使用してグリッドで事前に定規化すると簡単です。風乾させます。0.2% v/v Tween 20 で PBS で調製した 5% 脱脂粉乳で室温 15 分から 1 時間ブロッキングしてドットブロットを処理し、PBS-Tween で数回洗浄し、PBS-Tween で 1:500 に希釈した HRP-anti-his 抗体と 30-60 分間インキュベートします。PBS-Tweenで広範囲に洗浄し、次にPBSで広範囲に洗浄し、Hyperfilm MPで視覚化されたEnhanced Chemiluminescence(ECL)を使用して結合抗体を検出します。このドットブロットは、SDS-PAGE分析に先立ってピークフラクションの優れたアイデアを提供し、必要に応じて後続の精製ステップに情報を提供することができます(例えば、タンパク質の安定性が問題となる場合、ドットブロットの結果に基づいてピークフラクションをプールし、ゲルろ過カラムに直接ロードすることができます - 以下のステップ3.5を参照)。
    2. SDS-PAGE:各カラム画分50 μlを、2x SDS-PAGEローディング色素(4% w/v SDS、20% v/vグリセロール、120 mM Tris-HCl pH 6.8、200 mM DTT)が入った標識マイクロチューブに集めます。これらのサンプルを95〜100°Cで5分間煮沸します(加熱された蓋のないホットブロックを使用する場合は、チューブが加熱されて「爆発」しないように、各チューブの蓋に細いゲージのシリンジ針で小さな穴を開けてください)。各カラム画分10μlをローディングした10% SDS-PAGEミニゲルを泳動し、Coomassieブリリアントブルーで染色して、タンパク質のピーク画分と%純度を確認します。必要に応じて、SDS-PAGEで分離したタンパク質をニトロセルロースに移すことにより、hisタグ付きタンパク質をウェスタンブロットすることもできます。PBS-0.2% Tween 20 で 5% 脱脂乳でメンブレンをブロックし、ドット ブロットと同様に HRP 標識抗 his 抗体 (1:500) で洗浄してプローブします。
  5. 純度を高めるために、his-trapカラムからのピークフラクションをプールし、増量塩中で溶出するSuperdex 75ゲルろ過カラムにロードすることができます(前述のBoubriak et al.13 と Mason et al.14)。

4. ヌクレアーゼアッセイ

  1. 基板のワーキングストックを作成します。
    1. 反応ごとに20 pmolの基質を使用するため(ただし、これは対処する問題に応じて変えることができます)、便利なワーキングストックは200 pmol/μl(つまり、10倍)です。ワーキングストックは、少量のアニーリングバッファー(10 mM Tris-HCl pH7.6、1 mM EDTA pH 8.0、50 mM NaCl)または10 mM Tris-HCl pH 7.0(ヌクレアーゼによるpH 8.5まで)で、酵素感受性または実施するアッセイに応じて構成されます。
    2. 4°Cの暗所に保管してください(ホイルで包まれています)。基質は、デュプレックスの完全性や蛍光シグナルを損なうことなく、何週間も持続します。
  2. 比色分析によるエキソヌクレアーゼタンパク質濃度のアッセイ、またはAbs260でのUV分光法。
    1. -80°Cの小さなアリコートで保存してください。
    2. サンプルを一度凍結/解凍する場合は、タンパク質のミスフォールド率を5%と仮定し(または、アッセイするタンパク質ごとに経験的に定義)、それに応じて濃度を調整します。
    3. 2回の凍結融解サイクル後にエキソヌクレアーゼ活性のアッセイのためにタンパク質を廃棄し、各実験のタンパク質の状態を記録します。
  3. サンプルの設計実験を行い、マスターミックス(MM)の量を計算します。
    1. サンプル間のばらつきを減らすために、試験するサンプルに共通するすべての成分(通常は酵素または基質を除くすべて)を含むMMを作成します。
    2. MMを作成する際には、ピペッティングエラーを考慮してください(例:N個のサンプルに対して十分な量(N + 0.1N)のボリュームを作成することにより、N個のサンプルの容量を計算します。
    3. 1 pmolの酵素と20 pmolの基質を含む総容量20 μl/サンプルで反応を設定します(最適化前のデフォルトとして、明らかに量は試験対象によって異なります。例えば、酵素濃度の効果をテストする場合は酵素の量を変更します)。DmWRNexo では、ヌクレアーゼ活性に最適なバッファーとして、40 mM Tris-HCl pH 8.0、4 mM MgCl2、5 mM ジチオスレイトール、0.1 mg/ml 分子生物学グレードの BSA が含まれていることが経験的に見出されました。
  4. リアクションを設定します。
    1. すべての試薬を4°Cに保ちます(アイスバケツまたはクライオラック)。
    2. マスターミックスと分注を適切な数の滅菌DNaseフリー0.5 mLマイクロフュージチューブに分注します。初期基質を可視化するための非酵素コントロールを含めます(非分解コントロール)。
    3. ヒートブロックを酵素活性に適した温度に設定します(DmWRNexoには37°C、最終時点30分が最適でしたが、これは選択した酵素の活性をさまざまな温度と時間で比較することにより経験的に決定する必要があるかもしれません)。バッファーに一般的に存在する可能性のある酵素阻害剤は、慎重に試験する必要があります(例えば、EDTAは過剰なATP14と同様にDmWRNexoを阻害し、おそらくヌクレアーゼ活性に重要なMg2+のキレート化によって阻害されます)。高濃度のイミダゾール(>300 mM)でも、DmWRNexo酵素活性に影響を与えず、蛍光を消光することもありません。
    4. STOP溶液(80%ホルムアミド、1x TBE)を作ります。これは3倍です。これには、必要に応じてブロモフェノールブルーなどの染料が含まれている場合があります。RTで保管してください。
    5. ヒートブロックの近くに、反応ミックスに添加する最終試薬(通常は酵素)、1-10 μlのピペッターとチップ、タイマー、クライオラックまたはアイスバケット、およびSTOP溶液を設定します。
  5. 反応を開始します。
    1. 最初のチューブに酵素を添加するタイマーをセットします。チューブをヒートブロックに入れます。
    2. 適切な間隔で残りのチューブに酵素を追加し続けます。(STOP溶液のみで完了する単純な反応には15秒で十分です)。酵素が追加されたらすぐにヒートブロックに入れます。
  6. 反応を止めます。
    1. タイマーが正しい時間(たとえば15分)に達したら、最初のサンプルに10 μlのSTOP溶液を加え、ピペッティングで混合します。すぐに氷の上/クライオラックに置きます。
    2. 適切な時間間隔で、設定したのと同じ順序で反応を停止し続け、各反応がまったく同じインキュベーション時間を持つようにします。
  7. これで、サンプルを調製した変性ゲルにロードする準備が整いました。
    1. 正確なピペッティングのために、ゲルローディングチップを使用して各サンプルの半分(またはすべて)をロードします。反応に使用されるオリゴヌクレオチドのレベルでは、反応の半分が可視化のための良好な出力をもたらし、リピートの実行が可能になります(たとえば、最初のゲルが正しく実行されない場合)。
    2. 色素(ブロモフェノールブルーなど)を含む1x STOP溶液を1つ以上のレーンにロードして、ゲルがどのように動作しているかを確認すると便利です。
    3. 既知のサイズの蛍光オリゴヌクレオチドは、サイズマーカーとしてサンプルと一緒に分析できます。
  8. ジェルを走らせます。
    1. 上部のランニングバッファーチャンバーをゲル装置に追加し、ランニングバッファー(1x TBE)を充填して、サンプルが乱されないようにします。バッファの漏れがないか確認してください。
    2. ゲルリグを電源に接続し、200 V(定電圧)で150〜200分間、またはブロモフェノールブルー色素(使用している場合)がゲルの約3分の2下になるまで(このパーセンテージのゲルで10nt DNAのレベルで動作します)運転します。バッファの漏れを監視し、分離を歪めたり防いだりする可能性があります。
    3. ゲルを停止し、走行装置から取り外します。

5. ゲル解析とイメージング

  1. 例えば、Fuji FLA-3000 PhosphorImager/Fluorescence Imagerは、F1000の最大感度設定と 50μmの最小ピクセル読み取り(解像度)を使用して、青色473nmレーザーを使用してフルオレセインの蛍光を検出できます。
  2. ゲルをスキャンします。
    1. スペーサーとゲルプレート1枚を慎重に取り外します。もう一方のゲルプレートに残っているゲルを十分に(ただし慎重に)すすぎ、スキャンを妨げる可能性のある沈殿した尿素の痕跡を取り除きます。
    2. プレート(ゲルが付着したまま)をゲルホルダーのガラス面にゲルダウンしてセットし、イメージャーに置きます。ガラス上のゲルの座標に注意してください(表面全体に充填されていない場合)。
    3. 接続されたコンピューターで適切なソフトウェアを開き、ゲルがあるスキャン領域のメモされた領域をスキャンします。ステップ 5.1 で決定された最適な条件を使用します。作成されるファイルは比較的大きくなります(数MB)が、必要に応じて画像をトリミングして圧縮できます。
    4. 保存してから、解析ソフトウェアで読み込めるファイルとしてエクスポートします(ImageJを使用した解析用の.tiffとしてエクスポートします)。
  3. データを分析します。
    1. エキソヌクレアーゼアッセイが成功すると、オリゴヌクレオチドに沿ってフルオロフォアに向かって基質が順次分解され、ゲル上に蛍光DNA断片の特徴的なはしご状のパターンが生じます。ゲル上での移動度が高い(より遠くまで走る)分子種は、非分解された出発基質よりも小さいため、エキソヌクレアーゼ分解の生成物を表します。
    2. ImageJの「Gels」ツールを使用して、各レーンの分子種の移動度に依存する相対的な強度を定量化し、各サンプルのエキソヌクレアーゼ活性の劣化レベルを決定します。

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結果

エキソヌクレアーゼ活性のin vitro解析を行うには、実際の解析に加えていくつかの準備ステップが必要です。手順の概要を図1に示します。

蛍光ベースのエキソヌクレアーゼアッセイを実施する前に、適切な蛍光イメージングシステムを用いて、尿素・アクリルアミドゲルで分離した後の蛍光標識オリゴヌクレオチド基質の検出を最適化することが不可欠です。フィルターの選択はアッセイ全体の感度に著しい影響を与えるため、極めて重要です。本研究のオリゴヌクレオチド基質はフルオレセイン標識されているため、励起波長 470 nm および蛍光波長 520 nm を透過するフィルターが必要です。このフィルターを使用し、イメージング装置の感度と解像度の両方を調整することで、低濃度の基質（または生成物）の検出能を高めることが可能です（図 2A および 2B）。フィルターの帯域幅にはある程度の許容範囲があり、最適ではないフィルター（ex 520/em 580 nm など）を選択した場合でも基質の部分的な検...

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ディスカッション

精製タンパク質のエキソヌクレアーゼ活性の測定には、DNA切断産物の分析が必要です。エキソヌクレアーゼによるDNAの連続切断は、アクリルアミドゲル上の標識切断産物を分離することによって視覚化できます。歴史的に、これには放射性標識(32Pまたは35Sなど)によるDNA基質の末端標識が含まれていましたが、放射性標識の使用に固有の欠点(コスト、安全性の問題、および経時的な不安定性)がありました。これらの問題を克服するために、蛍光標識DNA基質を用いたエキソヌクレアーゼアッセイを開発し、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のWRNエキソヌクレアーゼオルソログ(DmWRNexo10)のヌクレアーゼ活性の決定におけるアッセイシステムの有用性を示しました。私たちのアッセイの主な利点は、蛍光標識基質が経時的に安定しているため、精製された組換えエキソヌクレアーゼの異なるバッチを比較する場合など、再現性と標準化が向上することです。このアッセイを使用して、DmWRNexoヌクレアーゼ活性の詳細な分析を行い、ヌクレ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業[ES/G037086/1]に資金を提供してくださった評議会横断的なNew Dynamics of Ageing Programmeに感謝します。また、Fuji FLA-3000へのアクセスを提供してくださったオックスフォード大学生化学科のDave Sherratt教授

に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬/材料
カスタムオリゴヌクレオチドEurogentecこれらは、PAGE精製を使用して高純度例えばで取得する必要があります。
5'FLOフルオレセセイン-5' GAACTATGGCTCTC
GAGTGCTAGGACATGTGTGA
CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble
5'- GGTGACTTGTACGTgt
AGTCAGACATGTCCTAGCAC
TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 アクリルアミド溶液Severn Biotech20-2400-05注意:強力な神経毒なので、手袋は常に
着用する必要がありますHis-Trapカラム (1 ml)GE Healthcare17-5247-01
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参考文献

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