バークホルデリア属のメンバーは、臨床的に重要な病原体である。我々は、機械的破壊、およびその後のプロテオーム解析のための2-Dゲル電気泳動を用いて、全細菌タンパク質抽出するための方法を記載している。
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この記事について
サマリー
要約
細菌種の細胞内タンパク質レベルの調査は、これらの生物によって引き起こされる疾患の発症機序を理解するために重要である。ここでは、リン酸緩衝生理食塩水、エチレンジアミン四酢酸及びフェニルメチルスルホニルフルオリドの存在下でガラスビーズを用いた機械的溶解に基づいて、 バークホルデリア種からのタンパク質抽出のための手順を記述している。この方法は、異なる増殖条件のために、異なるバークホルデリア種のために使用することができ、それは、他の細菌のプロテオミクス研究に使用するのに適している可能性が高い。タンパク質抽出に続いて、二次元（2-D）ゲル電気泳動プロテオーム技術がこれらの生物のプロテオームのグローバル変化を研究するために記載されている。この方法では、分子量に基づいて分離を行い一次元で等電点電気泳動による等電点に応じてタンパク質の分離、で構成されています第二次元におけるアクリルアミドゲル電気泳動による。分離されたタンパク質の可視化は銀染色によって実施される。
概要
バークホルデリア属以上 62種、ニッチの広い範囲から単離されたグラム陰性菌を含み、それは、2つの主要なクラスター1,2に分割される。最初のクラスタは、ヒト、動物およびphytotrophic生物を含み、ほとんどの研究は、それらの臨床的重要性は、この群の病原性種に焦点を当てている。最も病原性のメンバーはBである。疽菌とB （それぞれ類鼻疽及び鼻疽を引き起こす） 鼻疽菌 3,4および嚢胞性線維症（CF）および慢性肉芽腫症（CGD）の病気を引き起こす日和見病原体5（バークホルデリア·セパシア複合体、BCCの17定義された種）、1。 30以上の非病原性の種と第二のクラスタは、植物が、環境に関連する細菌が含まれており、ホスト2に対して潜在的に有益であると考えている。
数多くの合併症はFRをemergeこのような理由例6-9のほとんどで根絶するのは難しいことの抗生物質に固有または獲得抵抗性の患者、病気の蔓延や治療の失敗の間に病原体の伝達などのバークホルデリア属の病原性メンバーとOM細菌感染。そのため、細菌感染の確立のための基礎をより明確に理解を得ることは、これらの生物によって引き....
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プロトコル
1。培養増殖（日1 2）
- 一晩37℃の回転装置で、スナップトップ15ミリリットルチューブにルリア·ベルターニ（LB）ブロス3ミリリットル：スターターカルチャーを育てる。 OD 0.6の600に一晩成長を希釈します。 250mlのエルレンマイヤーフラスコ中のLBブロス100mlにこの希釈液1mlを加える。バッチ培養においては、より良好な近似のために、固定相（SP）内に16時間、250rpmで振盪しながら37℃でインキュベートし、感染条件等のrpoS、クォーラムのような固定相信号因子の制御下で、その細菌の病原性因子を確実にするために検出、発現される。あるいは、初期のSPまたは中期又は後期対数期で増殖させた細菌は、細菌の適応期についての情報を得るために使用することができる。
- 16時間後、OD 600を測定し、文化が同一条件下で以前に構築成長曲線と比較することによって、SPに達していることを確認してください。
2。タンパク質抽出（3日目）
- 一晩冷蔵庫にあらかじめすべてのメディアとソリューションを冷やす。すべての手順は、アイスバケット内チューブを用いて実施されるべきである。 Prechill微量とベックマン·コールター高性能遠心分離機（または同等品）を4℃にし、内側の回転子（ローター= JA-20、遠心分離機= J2-HS）。
- 新鮮な0.1Mのフッ化....
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結果
2別の機会に同じ細菌培養から抽出したタンパク質プロファイルの比較解析が成功したタンパク質抽出を示す同様のパターンバンディングを示した。抽出された高分子量のタンパク質は、10〜150 kDaの範囲であった。 バークホルデリアmultivoransから全細胞タンパク質抽出の1に示す代表的なクマシーブルー染色ゲル（BCCの部材） 図1bまたは酵母/マンニトール（YEM）ブロスで成長した臨床分離株固定相から回収した。
2-Dゲル電気泳動分析のために、 疽菌からの全タンパク質200μgの（ 図2）を用いた。この病原体は、疾病管理予防のための25の米国センターによるB型生物兵器剤として認識されているので、タンパク質調製手順は、標準的な操作手順に応じてバイオセーフティレベル3の封じ込め実験室で実施した。タンパク質は、再水和溶液に再懸濁し、24 cmの長さに固定化pHを4-7勾配及びタンパク質はそれらの等電点（pI）に従って分離して適用.......
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ディスカッション
タンパク質の調製のための方法は、再現性よくバークホルデリアタンパク質の大部分を抽出することができることが記載されている。これは、 図1に示すように、LB又はYEMブロス中で増殖させた同一の細菌培養物を使用して、異なる日に実施された2つの独立した調製物から同一のタンパク質プロファイルを得ることによって実証される。しかし我々はプレート上で増殖させた細菌のためにこの方法をテストしていません。抽出は、液体培地中で増殖させた細菌のための効率的であった。この方法は、プロテオミクスツールを使用して、さらなるタンパク質の特徴づけのために使用した、我々のグループは正常に（のiTRAQ）プロテオーム技術15,23,24相対的および絶対的定量のために2-Dゲル電気泳動および同位体タグを用いたプロテオームの変化を研究している。後者の場合、タンパク質は、15のiTRAQ実験でのPMSFの干渉を避けるために、PBS中の0.5 M EDTAを含む緩衝液中に抽出した。
それは、REMにとって重要であるタンパク質抽出処理.......
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開示事項
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
謝辞
この作品は、（BV）はブリティッシュコロンビア大学からの学生の身分および嚢胞性線維症カナダ、（DPS）は健康の研究のカナダの協会からの補助金によって支えられている。私たちは、プロトコルの初期準備のためにジャクリーンチョンに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬 | |||
| フェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF) | シグマ | P7626 | |
| アセトン | フィ | ッシャーA18-1 | |
| PBSバッファーバイオ | サイエンス | R028 | |
| チレンジアミン四酢酸(EDTA) | フィッシャーBP118-500 | 有毒 | |
| ガラスビーズ(0.1mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge 遠心分離管、ポリカーボネート (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA タンパク質抽出キット | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml 円錐形 スクリューキャップ キャップ付き キャップとOリング | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D クリーンアップキット | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| 尿素 | Invitrogen | 15505-050 | 刺激性 |
| CHAPS | アマシャム バイオサイエンス | 17-1314-01 | |
| ジチオスレイトール (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 刺激性 | |
| イモビリン ドライストリップ pH 4-7 24 cm | アマシャム バイオサイエンス | 176002-46 | |
| デュラクリル | プロテオミクス ソリューション | 80-0148 | 非常に有毒で発がん性物質 |
| 過硫酸アンモニウム | Fisher | BP179-100 | 可燃性、毒性、腐食性 |
| N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | 可燃性 |
| ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) | Fisher | BP166-500 | 急性毒性、可燃性 |
| アガロース | Invitrogen | 15510-027 | |
| エタノール | フィ | ッシャーHC1100-1GL | 可燃性、有毒 |
| な酢酸 | フィ | ッシャーA491-212 | 、腐食性 |
| グルタルアルデヒド | フィ | ッシャーG151-1 | 非常に有毒で腐食性、環境に危険です |
| テトラチオン酸カリウム | シグマ | P2926 | 刺激性酢 |
| 酸ナトリウム | EM科学 | 7510 | |
| 硝酸銀 | シグマ | 209139 | 、環境に危険 |
| ホルムアルデヒド | シグマ | 252549 | 有毒 |
| チオ硫酸ナトリウム | シグマ | S7026 | |
| トリスベース | EMD | 9230 | |
| グリシン | MPBiomedical、LCC | ||
| グリセロール | MPBiomedical、LCC | 800688 | |
| メタノール | フィ | ッシャーA412-4 | 、有毒、健康被害 |
| ナトリウム無水EMD | SX0400-3 | 有毒 | |
| 鉱物油 | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20超遠心ローター | ックマンコールター | 334831 | |
| ミニビーズビーターBiospec | 製品 | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II等電点電気泳動システムおよびアクセサリ | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| >Ettan DALT大型縦型電気泳動システム | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
参考文献
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Commo....
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