方法論記事

変換にマトリックス支援レーザー脱離/イオンイメージングのためのマトリックスとしてジスラノールはイオンサイクロトロン共鳴質量分析計をフーリエ

DOI：

10.3791/50733

⸱

2013年11月26日

 ,  , 
1University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

この記事について

サマリー

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ジスラノール（DT、1,8 - ジヒドロキシ-9,10 - ジヒドロアントラセン-9 - オン）は、以前に小分子の組織イメージングのためのMALDIマトリックスとして報告されている上に、内因性脂質​​のMALDIイメージングのためのDTの使用のためのプロトコル超高分解能四重極-FTICR機器上の正イオンMALDI-MSによる組織切片の表面は、ここで提供される。

要約

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質量分析イメージング（MSI）は、主にMALDI（マトリックス支援レーザー脱離/イオン化）ベースの分析技術を用いて、組織切片の表面上の化合物の空間的局在および分布パターンを決定する。低分子量（MW）の化合物の分析を向上させることができる小分子MSI用の新しい行列は、必要とされる。 MALDIバックグラウンドシグナルを減少させながら、これらのマトリックスが増大検体信号を提供すべきである。また、このようなフーリエとして超高解像度の器具の使用は、イオンサイクロトロン共鳴（FTICR）質量分析計を変換行列信号から検体信号を分解する能力を有し、これは、部分的に背景がMALDI由来に関連する多くの問題を克服することができる行列。 FTICR MSによる準安定マトリックスクラスターの強度の低下はまた、他の機器上にマトリックスピークに関連付けられた干渉のいくつかを克服するのを助けることができる。高解像度の依然として化学同定の信頼性を提供しながら、それらは、同時に多くの化合物の分布パターンを生成することができるようなFTICR質量分析計などの器具は有利である。ジスラノール（DTは、1,8 - ジヒドロキシ-9,10 - ジヒドロアントラセン-9 - オン）は、以前に組織イメージングのためのMALDIマトリックスとして報告されている。本研究では、哺乳類の組織切片の表面からの内因性脂質​​のMALDIイメージングのためにDTを使用するためのプロトコルは、正イオンMALDI-MSにより、超高解像度のハイブリッド四重極にFTICR機器が提供されている。

概要

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質量分析イメージング（MSI）は、組織切片1,2の表面に化合物の空間的局在と分布パターンを決定するための分析技術である。ペプチドおよびタンパク質の分析のためのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）MSIは、10年以上にわたって使用されており、試料調製、検出感度、空間分解能、再現性、およびデータ処理のための方法で3,4大きな改善があった。組織学的に染色した切片とMSIの実験からの情報を組み合わせることにより、病理医は、病態生理学的に興味深い機能5で特定の化合物の分布を相互に関連付けることができます。

外因性薬物及びそれらの代謝産物6,7 8-10を含む小分子の分布パターンはまた、MALDI-MSの組織画像11によって問い合わせされている。脂質は、おそらく最も広く研究されているCLA両方のMS 12月17日およ ​​びMS / MS 18のモードで、MALDIイメージングを有する化合物のSS、。小分子イメージングのためのMALDI MSIの使用は、いくつかの要因によって制限されてきた：1）MALDIマトリックスは、それ自体が豊富なイオンシグナルを発生する小分子（典型的には、M / Z <500）である。これらの豊富な信号は、小分子分析物のイオン化を抑制し、その検知19,20を妨害する可能性がある。無溶剤型マトリックスコーティング21、マトリックス昇華22、およびMALDI MS 23プレコートマトリックスは、とりわけ、小分子のMSIを改善するために開発されてきた。

低MW化合物の分析を改善することができる新たなマトリックスは小分子MSIに大きな関心である。これらのマトリックスは減少し、マトリックス信号が増加した検体信号を提供すべきである。陽イオンモードでは、2,5 -ジヒドロキシ安息香酸（DHB）及びα-シアノ-4 -ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）がMSI 24のための2つの一般的に使用されるMALDI MS行列である。分析物の空間的局在化を保持するように理想的なマトリックスは、小さな結晶を形成するであろう。 DHBしたがって昇華を使用して行列を適用することを部分的にこの問題を克服するために開発されており、リン脂質22,25の高感度画像化のためのこのマトリックスの使用を可能にした、より大きな結晶を形成する傾向がある。 9 -アミノアクリジンは、正イオンモード26におけるプロトン検体のMSIおよび負イオンモードで26-29のヌクレオチドおよびリン脂質のために使用されている。 2 -メルカプトベンゾチアゾール、脂質30の効率的なMALDI検出を与えることが見出されており、マウスの脳のガングリオシド31のイメージングのために使用されている。フーリエ変換の超高分解能は、イオンサイクロトロン共鳴（FTICR）質量分析計が多少行列信号32から検体信号を解決することによって、この問題を緩和することができる変換する。 FTICR-MSを使用することの別の利点は、準安定マトリックスクラスターの強度を削減していることであるまた、これらの干渉を27に減らし、ED 33、。

ジスラノール（DT、1,8 -ジヒドロキシ-9,10 -ジヒドロアントラセン-9 -オン）の使用は、組織のイメージングのためのMALDIマトリックスは、以前に報告34されているように。この現在の研究では、詳細なプロトコールは、正イオンモードでは、ウシのレンズ組織切片の表面上の内因性脂質​​のMSIのためのDTの使用のために提供される。

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プロトコル

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1。組織セクショニング

  1. フラッシュフリーズ問題片を、（送料が必要な場合）を1回採取し、液体窒素を用いて、ドライアイスでそれらを出荷し、組織切片まで-80℃で保管してください。 （市販の試料が使用される場合、サンプルはこの方法で調製されることを保証する。）
  2. MALDIターゲットに合​​わせて管理可能なサイズに臓器を切った。臓器の不要な部分を切り落とす。ここで説明する本研究のために、仔ウシレンズは、組織切片の前に前述の手順35を使用してカプセル化が解除された。
  3. -80℃の冷凍庫から、全体の臓器を取り出して、極低温組織切断ステージに固定します。子牛レンズを修正するには、クライオスタットの組織の切断、ステージ上の水の1〜2滴を配置します。それが凝固する前にすぐに水にレンズを配置します。あるいは、最適な切削温度（OCT）化合物はまた、切削ステージに組織を固定するために使用することができる。のOCT化合物が使用される場合、ミニ、OCTの発作量が適用されるべきであると注意を切断組織切片を分析物5,36,37のイオン化及び検出を妨害する可能性のOCT化合物で汚染されないように注意しなければならない。
  4. クライオスタット内の温度が-18℃に平衡化させる冷たいまたは暖かい温度はそれぞれ、軟らかい又は硬い組織に使用することができる。その後、厚さ20μmのスライスに赤道組織を切断。ほとんどの組織のために10から15ミクロンの厚さのスライスを使用します。しかし、ウシ水晶体組織の脆弱な性質のために、厚さ20μmのスライスを使用した。ウシ水晶体組織の場合は、最初の組織切片を破棄し、唯一に近いか、赤道面にあるスライスを使用しています。
  5. 眼の水晶体組織を撮像した場合には、インジウムスズ酸化物（ITO）被覆ガラススライドの表面を濡らすためにギ酸（純度98％、LC-MSグレード）1.5μLを使用する。
  6. 慎重にITO - コの表面に組織切片を転送するクライオスタット内部のガラスの顕微鏡スライドをated。組織切片を迅速に解凍し、スライド表面にしっかりと貼り付けられなろう。通常、複数の組織切片は、このように同一のITOコーティングされたスライド上に搭載することができる。
  7. MALDIマトリックスの適用の前に15分間、スライドを凍結乾燥する。
  8. マトリックステストのために、適切な溶媒中での個々の行列を溶かす。手動で組織切片上に、各マトリックス溶液1μLを発見。さらに、MALDI感度を検証するための組織上に小分子校正標準を見つける。
  9. 修正流体ペンでITO被覆ガラススライドの非導電性の表面に書き込むことで、ITO被覆ガラススライドに3教授マークを追加。フラットベッドスキャナを使用して、組織スライドの光学像を取得し、TIFFやJPGなどの適切な形式で保存。

2。マトリックスコーティング

2.1。自動化されたマトリックスコーティング

  1. AP自動的ブルカーImagePrep又は類似の電子マトリクス噴霧器を用いて組織切片の表面に、溶媒としてアセトニトリルまたは混合アセトニトリル/水を含有するプライマトリックス溶液。
  2. マトリックスはコートスライドのエッジをしないようにテープでITO被覆ガラススライドの表面の縁部を覆う。これは、反対側の面に教示マークが組織スライドアラインメントのために使用することができることを保証する。これらはITOでコーティングされたスライドの導電性を維持するために、接触点として使用されるようなマトリクスを有するスライドのエッジをカバーしない。
  3. コー​​トマトリックスコーティング（2秒の噴霧、30秒のインキュベーション、および各サイクル60秒の乾燥時間）の20サイクルを用いてガラススライド。

2.2。手動マトリックスコーティング

  1. 電子マトリックス噴霧器の製造材料と互換性のない有機溶媒（ 例えば 、クロロホルム、酢酸エチル）はrequiである場合赤、行列を適用するために、空気圧アシストエアブラシ噴霧器を使用しています。エアブラシ銃の溶剤タンクに準備されたマトリックス溶液を追加し、プラ​​イムスプレーに加圧された窒素ガスの穏やかな流れを適用します。
  2. マトリックスはコートスライドのエッジをしないようにテープでITO被覆ガラススライドの表面の縁部を覆う。これは、反対側の面に教示マークが組織スライドアラインメントのために使用することができることを保証する。これらはITOでコーティングされたスライドの導電性を維持するために、接触点として使用されるようなマトリクスを有するスライドのエッジをカバーしない。
  3. 安定であり、微細なスプレーは、組織切片、それを完全に被覆するようにマトリックスを手動スプレー、観察された後。かろうじて可能な分析物の非局在化を防止するために、各サイクル中に表面を濡らすために必要なマトリックス溶液の最小量を適用する。一般に、コーティングするために組織切片をマトリックススプレーの約10サイクルを使用し、サイクル数である組織型とマトリックス組成に依存。

3。 MALDI MS

  1. 水（最終混合物中の0.1％ギ酸を含む）：60:40イソプロパノール中1:200倍「ESチューニングミックス」標準液を希釈することにより、質量キャリブレーション溶液を調製する。
  2. 2μlの/デュアルモードエレクトロスプレーイオン化（ESI）ESI側からFTICR質量分析計の/ MALDIイオン源内へ希釈し「ESチューニングミックス」溶液の分を導入する。
  3. ブロードバンドの検出および1024キロバイト/秒のデータ収集サイズで、正イオンESIモードでFTICR機器を操作してください。典型的なESIパラメータは、キャピラリエレクトロスプレー電圧は、3,900 Vであり;シールド電圧3,600 Vスプレー、ネブライザーガス（N 2）フロー、2 L /分、乾燥ガス（N 2）の流れ、温度、4 L /分、200°C;飛行時間（TOF）、0.009秒;、衝突ガス（Ar）流量、0.4 L /秒;ソースイオン蓄積時間は0.1秒で1電圧、15 Vスキマー;衝突セルのイオン蓄積時間、0.2秒。良好な時間領域自由誘導減衰（FID）信号を維持しながら、のm / z 200〜1,400質量範囲にわたって分析感度を最大にするために同調FTICR動作パラメータ。一般的に、ICR動作パラメータが相棒電圧、8 Vである。相棒オフセット電圧、8 V、10の励起増幅;励起パルス時間、0.01から0.015秒、フロントトラッププレート電圧、1.5 V、背トラッププレート電圧、1.6 Vと分析器の入口電圧-4 FTICR動作パラメータのセットが決定された後V.、ESI質量スペクトルを取得し、「ESチューニングミックス」溶液中の標準化合物の質量基準を使用して機器を較正する。
  4. チューニングする楽器MALDI操作のため、各1μMの濃度でマトリックス溶液中で混合テルフェナジンとレセルピン標準溶液を数1μlを溶かしてTISSUの1に直接これらのソリューションを見つけるITOコーティングされたスライド上に搭載された電子部（ すなわち、試験組織切片）。組織スライドアダプタにITO被覆スライドを置きます（ つまり特別なMALDI標的）とデュアルESI / MALDIイオン源へのMALDI側からアダプタをロードします。各質量走査のためのMALDI信号の蓄積などのためのレーザパワーとレーザショット数に適したMALDI動作パラメータを最適化する典型的なMALDI動作パラメータは次のとおりです。レーザーショット、50、および300 VのMALDIプレート電圧
  5. 、チューニング校正、およびMALDI-MSI実験のために測定器を最適化した後、画像処理ソフトウェア内での記録された光学像を撮像すべき組織切片の物理的な位置に合わせます。三点三角測量法を使用して、この位置合わせのために、以前にITOコーティングされたスライド面とは反対側に配置された三つの "補正流体」マーク（ステップ1.9）を使用する。
  6. 同時ESIおよびMALを行うDI動作各質量スペクトルは、ポスト取込み内部質量較正のための「ESチューニングミックス」溶液の基準質量ピークを含むようにする。これは、MALDI MSの中の最も正確な質量測定になります。 ESIの較正信号は依然として内部質量較正のために十分に高いながらMALDI信号がスペクトルを支配するまで、これを行うには、最初のキャピラリー電圧を減少させることによってESI信号を減衰させる。
  7. 次に、レーザ照射のための自動化されたラスタ方式を設定します。撮像される組織領域を定義し、適切なレーザーラスタステップサイズを設定する。小さいラスタステップサイズは、より高い解像度の組織画像を提供することに留意されたいが、かなり長い質量スペクトルの取得時間とより多くのデータ·ストレージ·スペースを必要とする。画像のピクセル数を設定するには、レーザーラスターステップサイズおよび組織のサイズに依存している。 1cm 2の組織サイズを有する代表的なウシのレンズについては、組織像は、典型的には約構成されている。 5000画素200μmのレーザラスタステップサイズFTICR機器で使用されている場合。これは実験中の段階的な信号減衰による位置ベースのバイアスを防ぐように、「ランダムスポット」の分析を使用してください。

4。データ解析

  1. 最初の比較のために内部キャリブレーションを使用して、MALDI質量スペクトルを校正し、MS / MSのピークを選択する。デ同位体およびカスタマイズされたVBAスクリプト38を使用して、前述したようにモノアイソトピックピークを選択します。
  2. エクスポートモノアイソトピックピークリストとMETLIN 39および/ ​​またはライブラリエントリを持つマスマッチングのためHMDB 40メタボロームのデータベースへの入力で測定m / z値を生じた。 ±1ppmでの許容質量誤差で、データベース検索の際に（M + H）+、（M + Na）の+、および（M + K）+イオンを考えてみましょう。
  3. IMAGを使用して、全組織切片全体で検出された脂質のエンティティのすべてのためのMALDIの画像を生成するピーク頂点で1 ppmの質量フィルタ幅と電子解析ソフトウェア。
  4. 画像は、データベースエントリに一致するすべてのm / z値のために生成されたら、後で調査することができるユニークな分布パターンを探すために、並びに、他のすべてのピークについての画像を生成する。

5。イメージされ脂質の身元の確認

  1. MALDI-MS/MSにより、FTICR機器（リン脂質など 184.073）を用いて検出することができる特徴的なフラグメントイオンを有する高存在脂質のアイデンティティを確認してください。直接組織に衝突誘起解離（CID）を使用してMALDI-MS/MSを実行します。
  2. 直接MALDI-MS/MSにより確認することができないそれらの脂質種に対しては、q-TOF質量分析計34に接続されたUPLCシステムを使用する。
    1. 手動で対象となる種がローカライズされた地域からの組織〜10 mgのアリコートを分析。 2に、これらの組織のアリコートを配置mlの遠心管。
    2. 2つの5のステンレス鋼金属ボールミキサーミルを用いて、水250μlの各組織アリコートを均質化する。
    3. クロロホルム - メタノール溶液（1:3、v / v）を、ボルテックスチューブを1ml加える。次に、10分間、12,000×gで微量遠心を用いてチューブを遠心する。
    4. 上清を収集し、回転速度真空濃縮器でそれらを乾燥させます。
    5. 水：30:70イソプロパノール100μlに残基を溶解する。勾配溶出を用いた分離のためのUPLCカラムに10μlのアリコートを注入する。
    6. 以前に34公開されているオンラインの脂質LC-MS/MS用のクロマトグラフィー条件を使用してください。
    7. 生成抽出イオン電流（XIC）は理論上の質量中心に±50ppmのウィンドウで、理論的なm / z値を使用して、クロマトグラム。
    8. これらの脂質の本物の化合物が利用可能である場合、対応のものと本物の化合物の保持時間と一致する組織サンプルからXICピークをsponding。化合物が同じである場合、保持時間およびMS / MSスペクトルが一致する必要があります。
  3. 本格的な化合物が使用できない場合は、このようなMETLINやHMDBなどメタボロームデータベースから標準のMS / MSスペクトルと一致するように検出された脂質の断片化パターンを使用しています。脂質の可能な構造を決定するために新たに質量スペクトルの解釈を使用してください。

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結果

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ITO被覆ガラススライド上に切片化し、解凍が搭載された組織サンプルは、目に見える引き裂きせず、無傷であるべきである。多くの組織は、ITO被覆ガラススライド上に直接マウント組織融解は許容される。直接融解の装着が（図1a）が使用されるとき、ウシレンズなどのいくつかの特定の組織、組織の広範な引き裂きがしばしば見られる。エタノールまたはギ酸でITOガラススライド（ 図1b）のプレコートは、組織取付時に組織切片の完全性を維持するのに役立つ。

マトリックスの選択は、溶媒の選択は両方とも、MALDIスペクトルの質に影響を与える重要な要因である。適当なMALDI MSスペクトルは組織切片から取得されると、質量スペクトルは、質量検出範囲（ 図2a）内の脂質シグナルに通常密である。それらは極性を有するようにマトリックス、溶媒を選択すべきであるONT-サイズ：14.399999618530273px;行の高さ：28px; ">目的の分析と同様に、MALDIプロセスは、マトリックス結晶中の検体の固...

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ディスカッション

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成功MALDI MSIのための最も重要な考慮事項は次のとおりである：1）組織調製、2）行列の選択、3）は、行列のアプリケーション、4）データの解釈と分析。試料とマトリックスを適切に調製する場合、MSデータの取得が自動化される。この種の実験からのデータ分析は、非常に労働集約的である。

適切な組織標本が成功し、MALDI MSIの実験のために非常に重要です。組織の供給源と取り扱いは、最終的な分析に大きな影響を与えることができます。サンプルは直ちに液体窒素中で凍結し、-80℃で保存し、いくつかの代謝物は-80℃であっても不安定であることができるように、それらは長期間記憶されるべきではないでフラッシュされなければならない

多くの哺乳動物の組織のために、10月15日厚組織切片をMALDI MSIのために推奨されています。これらの実験では、仔ウシレンズは厚さ20μmの組織Sに赤道切断した前述の手順35を用いたレンズカプセル解除を次のリス広場。それは、組織の切断中および組織中の両方の取り付け、レンズ組織切片の完全性を維持...

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開示事項

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我々は、開示することは何もありません。

謝辞

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著者らは、プラットフォームの資金調達、およびサポートのためにゲノムカナダ、ゲノムブリティッシュ·コロンビア州を承認したいと思います。また、原稿と編集支援の重要なレビューのために博士はキャロルE.パーカーに感謝します。 CHLもサポートしてくれてありがとうブリティッシュコロンビア州プロテオミクス·ネットワーク。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ラットのレバーPel-Freezの生物的変数56023-2
のウシの子牛レンズPel-Freezの生物的変数57114-2サンプルは使用前にDecapsulated29
Dithranol＆％Sigma-Aldrich10608MALDIマトリックス
&α;-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸(CHCA)Sigma-Aldrich70990MALDIマトリックス
2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)Sigma-Aldrich85707MALDIマトリックス
レセルピンSigma-Aldrich83580
テルフェナジンSigma-AldrichT9652
ギ酸Sigma-Aldrich14265
ギ酸アンモニウムSigma-Aldrich14266
水酸化アンモニウムSigma-Aldrich
トリフルオロ酢酸(TFA)Sigma-Aldrich302031
水Sigma-Aldrich39253
メタノールSigma-Aldrich34860
アセトニトリルSigma-Aldrich34967
酢酸エチルSigma-Aldrich34972
イソプロパノールSigma-Aldrich34965
クロロホルムSigma-Aldrich366927
アセトンSigma-Aldrich34850
エタノール市販アルコール95%
ES チューニングミックスAgilent TechnologiesG2431A
ITO コーティング ガラス スライドハドソン表面技術PSI1207000サンプルが導電性側に配置されていることを確認してください
ワイトアウト シェイクアンドスクイーズ 修正ペンビックWOSQP11
エアブラシ 噴霧器イワタエクリプ HP-CS
ImagePrepブルカー249500-LS
MALDI アダプターブルカー235380
320145

参考文献

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