変更されたカフ法を用いたマウス子宮頸心臓移植モデル

サマリー

マウスの子宮頸心臓移植モデルは、免疫学的ならびに虚血再灌流障害の研究によく適している。私たちは、非縫合カフ技術を使用して手順を変更し、このアプローチに1,000以上の成功移植を行った。

ここで、私たちはビデオを補足するためにこの技術のさらなる詳細を提供する。

要約

マウスモデルは、モノクローナル抗体の多種多様なため、研究に特別な関心のものであり、商業的に近交系定義され、ノックアウト株は、 インビボ研究の機構を実行するために利用可能である。縫合技術を用いた心臓移植モデルは最初に成功したラットで開発されたが、同じように広範囲に使用されたマウスと同等への翻訳は、顕微手順の技術的な複雑さにより達成されていませんでした。対照的に、また、ラットで最初に開発非縫合カフ技術は、正常マウス^1-3で使用するために適合させた。血行再建術のためのこの技術は、2つの主要な段階I）は、ポリエチレンカフを介して受信者の容器を外転を伴う。 II）以前は裏返し受信者の容器の上にドナー容器を引っ張って、周タイで所定の位置に保持している。これは内皮層、短い動作時間と非常に高い開通率⁴の連続性を保証します。 血管吻合のためにこの技術を使用してT ">私たちは95％の全体的な成功率で1,000以上の子宮頸心臓移植を行った。動脈の流入のために総頸動脈及び近位大動脈弓を移植した心臓の逆行性灌流が生じる吻合した。静脈排出のために、移植片の肺動脈は、受信者⁵の外頸静脈と吻合した。

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概要

心臓移​​植は、異なる末期心疾患に罹患している患者のための選択の治療法を表す。外科技術、感染症のより効果的な予防法、および新規の免疫抑制レジメンの進歩は、臓器移植⁶の著しく改善された成果が得られた。しかし、長期移植片生存は、過去数年にわたって厳密⁷改善されていない。移植動脈硬化を特徴とする慢性拒絶反応は、長期的な移植片の生存^8-11の大きな障害であり続けている。

マウスでの異所性心移植のモデルは、急性時の免疫学的メカニズムを解析するための重要かつ有効なツールとしてだけでなく、慢性拒絶^12-15を提供しています。

今日までに最も頻繁移植モデルは、縫合技術を用いて腹部マウスの心臓移植は依然としてある。ドナー心臓の上行大動脈はa側に吻合さbdominal大動脈と肺動脈をレシピエントの下大静脈に吻合される。縫合モデルの顕微困難の多くは^16,17を縫合される船舶の小さなサイズに基づいています。

縫合糸モデルとは対照的に、心臓は、外頸静脈を肺動脈および総頸動脈ドナーの大動脈に吻合されるレシピエントの頸部に配置される。

カフ技術を用いて子宮頸部心臓移植モデルの開発の理論的根拠は、このモデルの広範な適用を可能にする基本的な顕微スキルの高い成功率を達成可能にする動物モデルを、持っていることであった。縫合モデル¹⁸と比較した場合、この方法の主な利点はかなり少ない出血および血栓症などの吻合関連の合併症を発生している。

プロトコル

動物は、バリア病原体フリーの施設に収容されている。すべての動物は、医学研究のための国立協会策定した「実験動物管理のプリンシパル」に準拠したヒューマンケアを受ける」と「実験動物の管理と使用に関する指針」は、全米科学アカデミーによって調製し、全国で公開衛生研究所（NIH公開番号86から23は、1985年改訂）。全ての実験は、オーストリアの文部科学省科学文化によって承認されています。

1。受信者の準備

1. キシラジン（5 mg / kg体重）およびケタミン（100 mg / kg体重）の筋肉内注射で、レシピエント動物を麻酔。
2. 動物の左右頸部のすべての髪を取り外し、chlorhexdineを使用して術野を3回スクラブ。
3. 術野での仰臥位でマウスを置きます。
4. 次頸静incから皮膚切開を作る右下顎骨にision。
5. 続いて、ぶっきらぼうに右外頸静脈（EJV）を動員し、合字の間に枝を分ける。
6. そして、カフの体の上の近位断端を裏返すのに十分な長さを残して確認して合字の間EJVを分割。
7. 次に顎下腺の右葉を取り除く。
8. 静脈吻合のためにポリエチレンカフを通じてEJVの近位端を通過し、マイクロクランプでカフのハンドルに固定します。
9. 、容器の最後で合字を削除カフの上に内腔を裏返すと8-0シルクループ（ 図1a）で固定します。
10. 続いて総頸動脈へのアクセスを得るために、バイポーラ焼灼右側胸鎖乳突筋を横断する。
11. 次の総頸動脈を動員し、合字の間に血管を切った。
12. 次の総頸動脈を動員し、合字の間に血管を切った。
13. DISを渡すTALカフを通して管の端部とは、動脈クランプで固定します。
14. 容器の最後で合字を削除し、血管dilatatorsを使用して内腔を膨張させる。次に、EJVと同様に、カフの上に動脈を裏返すと8-0絹ループで固定します。

2ハート調達

1. キシラジン（5 mg / kg体重）およびケタミン（100 mg / kg体重）の筋肉内注射でドナーマウスを麻酔。その後、動物の腹部領域の全ての毛を削除します。 chlorhexdineを使用して術野3時間をスクラブ。次に、前述のように手術野での仰臥位でマウスを置きます。
2. 腹部正中切開の後、下大静脈（IVC）を露出させるために左に綿棒で内臓を撤回。
3. ヘパリン化のためのIVCに4ヘパリンナトリウム - ソリューション：1400μlのを注入。
4. 開胸を行い、ACCを得るために頭蓋の上に前胸壁を折る心臓にESS。
5. 次に、胸腺を除去して、左右の上大静脈内の切開を抜きます。
6. その後、腕頭枝のレベルで27 Gの注射器と大動脈弓のカニュレーションによる4°摂氏HTK溶液と逆行心臓を灌流。
7. 8-0絹糸で劣り、上大静脈を結紮し、合字に遠位にそれらを分ける。
8. 次に、前のカニュレーションのレベルで大動脈弓を分割し、肺動脈幹を自由に分析し、可能な限り遠位にそれを分割する。
9. バルクライゲーションと肺静脈を結ぶと、合字に遠位にそれらを分割していることを示します。
10. 最後に、ドナー部位から心臓を除去し、4℃摂氏HTK溶液（ 図1b）に格納します。

3注入

1. 逆さまの位置に受信者の首領域における心臓移植片を配置し（ 図1c ）。
2. 次に、受信者の静脈カフ構造体の上に、心臓の肺動脈幹を引っ張るとシルクループ（ 図1d）で固定します。
3. グラフトの大動脈と同じ方法（ 図1e）の中で、レシピエント動物の裏返し動脈間の吻合を実行します。
4. その後、動脈クランプし、続いて最初の静脈クランプを取り外します。心臓が再灌流され、1〜2分以内に暴行を開始します。再灌流の間、暖かい（35℃摂氏）生理食塩水で心を潤す。
5. 最後に6-0連続縫合（ 図1e）の持つ手術創を閉じる。

4。術後ケア、エンドポイント

1. 水分補給のために、手術後0.3ミリリットルに生理食塩水を腹腔あきらめ。
2. 麻酔から覚醒するまで加熱ランプの下で動物を置きます。
3. 目を覚ましたら、彼らは食料と水を自由に受け取るの住宅施設に動物を返す。
4. マイルへ最初の7術後日間nimize痛みはカルプロフェン（4mgの/ kgを12時間ごとに皮下（SC）を管理するとともに、5日間右操作後12時間毎にBuprenorphin（0.1ミリグラム/ kg）を与える。
5. 適切な栄養摂取のために評価するために、各レシピエント動物を毎週の重量（g）を取得します。以上の10〜15％の体重減少の証拠は手術日、無気力、壊滅的または非常に曲がった奥の重量と比較がある場合には、臨床的なエンドポイントに到達する前に、端末イソフルラン吸入を用いて動物を生け贄に捧げる。心が拒絶された後に、動物を生け贄に捧げる。

結果

図2は、完全にMHCミスマッチのC57BL / 6レシピエントへの移植後のBALB / cドナーからの心臓同種移植片の代表的生存データを示す。心臓を移植後7日目±1に拒否されます。移植された同種移植片の指触診は、同種移植片拒絶反応の時間依存のコースを検出するための感度の高い方法である。私たち直列に実行されたすべての同系心臓移植が無限に生き残った（> 150日）。

図1：術中画像レシピエント準備中に（a）の手術フィールド調達（b）の後に心臓移植片（c）は上下逆の位置に受信者の首領域に配置された心臓移植片の（d + e）の前に、ドナー部位。。。。移植...

ディスカッション

血管化同種移植片の拒絶反応は不十分にしかin vitroモデルを用いて評価することができる異なる工程の茄多を伴う。受信者の増感、二次リンパ器官における抗原処理だけでなく、免疫担当細胞の分化、増殖などの現象は、生体内でよりよく特徴付けている。動物モデルは、それによってトランスレーショナルリサーチ¹⁶のための理想的なツールです。トランスジェニックおよび遺伝子ノックアウトマウスの広い範囲が利用可能であり、免疫学的および診断ツールの数が多いマウス¹⁸専用に開発されてきたので、マウスモデルは、依然として基本的な移植および免疫研究のゴールドスタンダードを表します。ネズミ子宮頸心臓移植モデルは、問題に対処し、虚血再灌流障害、免疫抑制、急性および慢性拒絶反応および寛容誘導^{1-3、17、22}に関連する機構研究を実行するためのユニークなツールを提供しています。

縫合技術を用いて、マウス腹部心臓移植モデルは、最初コリーらによって記載された1973年^19。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Yasargilクリップミニパーマネント	7mmAesculap	FE720K
マイクロベッセルクリップ	S&T	B1 00396 V
マイクロシザー	FST	14075-11
Vesseldilatator	S &T	D-5A.2 00125
マイクロ鉗子	FST	デュモン11271-30
クリップアプリケー	ターS&T	CAF-4 00072
マイクロベッセルクリップ	S &T	B1 00396 V