方法論記事

MTTアッセイにより合成と細胞毒性の評価：抗がん金属錯体

DOI：

10.3791/50767

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2013年11月10日

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1Institute of Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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空気に敏感チタン及びバナジウム抗癌剤の合成のための方法は、MTTアッセイによるヒト癌細胞株に対するそれらの細胞傷害活性の評価と共に、記載されている。

要約

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チタン（IV）とバナジウム（V）錯体は、非常に強力な抗癌剤である。それらの合成における課題は、それらの加水分解不安定性を意味するので、それらの調製は、不活性雰囲気下で行われるべきである。これらの複合体の抗癌活性の評価はMTTアッセイにより達成することができる。

MTTアッセイは、それが生存可能な細胞に曝露されたときにMTTホルマザンに分子の酵素的還元に基づく比色生存率アッセイである。還元の結果は、MTT分子の色変化である。対照と比較して吸光度測定は、化合物の抗癌活性とそのIC 50値に変換される試験した化合物、様々な濃度の彼らの治療後の生癌細胞を残りの割合を決定。 MTTアッセイはその正確性、迅速性、および比較的単純による細胞毒性試験で広く一般的です。

ここに、我々は事前に細胞プレートの調製、細胞と化合物のインキュベーション後、MTTアッセイを用いて生存率を測定し、IC 50値の決定を含む空気に敏感な金属系薬物および細胞生存率の測定、の合成のための詳細なプロトコルを送った。

概要

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化学療法は、依然として様々な癌疾患の診療所で採用治療の主なコースの一つであり、研究のこのよう膨大な量の新しい改良抗がん剤の開発を目的とした世界的に行われている。このような研究は、主にin vitroでの細胞毒性の特性の生物学的評価に続いて、化合物の設計と準備して、化学的なレベルで開始します。細胞生存率は、細胞活性1〜2についての情報を提供する様々なアッセイにより評価することができる。

シスプラチンは、広く精巣および卵巣癌3-4向けに効率的な治療法と考えられている化学療法薬として使用される白金錯体の一例である。しかしながら、狭い活性範囲および重篤な副作用は、他の強力な遷移金属錯体5-8の研究を誘発する。中でも、チタン（IV）とバナジウム（V）錯体は、高活性の有望な結果を示し、減少し毒性9月16日 。 TI（IV）錯体は、これらの特性のために、シスプラチンの後に臨床試験に入ることが最初でしたが、それらは、製剤の困難や加水分解不安定に試験を失敗している。耐水性15,17-21高い抗癌活性を組み合わせることができるこれらの金属錯体の改善された誘導体を開発するための電流が必要とされている。

チタン（IV）およびV（V）錯体の調製における課題は、前駆体試薬の加水分解不安定性を指し、従って、不活性雰囲気が維持....

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プロトコル

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  1. V（V）錯体（ 図2）の製造、18の行為は、グローブボックス内の1.1から1.4を繰り返し、グローブボックスが使用できない場合は、2（2.1から2.6）の手順の代替に進んでください。
    1. リガンドの0.42ミリモルの乾燥THF中のH 2 Lを溶解し、THF中のVO等量の撹拌溶液（O I PR）3に追加します。
    2. 15分間室温で反応混合物を撹拌し、そして真空下で揮発物を除去。
    3. 冷ヘキサンを加え、真空下でそれを削除します。濃い紫色の粉末を定量的収率で得られるべきである。
    4. エッペンドルフバイアル中で得られた化合物8mgを秤量する。 3に進みます。
  2. シュレンクラインを使用して、V（V）錯体を準備します。
    1. セプタムキャップで乾燥シュレンクフラスコに乾燥THF中の配位子のH 2 Lを0.42ミリモルを溶かし、シュレンクラインに接続し、真空/不活性ガス（N 2またはAr）環境を交互に適用され、それが3秒を適用することを推奨しますラウンドをUCHと真空段階で2〜5分間待ってください。
    2. セプタムキャップを通して注射器を経由して乾燥THFを追加します。
    3. 、ラインに適切な乾燥シュレンクフラスコに掛け不活性環境を塗布およびそれにバナジウム溶液からのシリンジを介して試薬を....

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結果

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錯体はNMRおよび元素分析によって評価することができる確立された方法18,28およびそれらの純度に基づいて調製した。

MTTアッセイから受信されたデータは、化合物18,21の細胞毒性を評価するために分析される。最初に、すべての他の値からブランク対照吸光度値の減算が行われる。阻害化合物は増殖を添加しないように、第2の、THF溶媒対照値を100％生存に設定される。他のすべての値は、制御に応じて実行可能性のパーセンテージに変換されます。濃度が適用され、算出された相対生存率は次いで可変勾配（4変数）モデル（ 図4、表1）29の非線形回帰に基づいて、IC 50値を決定するために、グラフパッドプリズムソフトウェア（または同等のもの）に挿入される。

測定範囲に対して行われるべきである各台地上の少なくとも3点、3点をスロープ（ 図3、グラフA）を定義するには、次の分岐点の分布を示すグラフ.......

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ディスカッション

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本稿に記載された方法は、生物学的細胞生存率アッセイによる化学合成を組み合わせる。生存細胞に関する任意の生物学的方法と同様に、層流フード内で作業し、滅菌有機溶媒の使用を含む無菌状態を維持することが重要である。また、加水分解に不安定な金属系薬物の製造及び貯蔵は、グローブボックス又はシュレンクライン技術が利用されるべき、不活性条件下で行われるべきである。

不活性環境下で動作するための技術の選択は、グローブボックスの可用性に主に依存している。利用可能な場合、室温条件を必要とするすべての合成は、その中に実行することは非常に便利である。加熱を必要とする合成は、通常のシュレンクフラスコに、箱から取り出され、シュレンクラインに取り付けられている。グローブボックスが利用できない場合には、すべての操作はSchleに厳選されたガラス製品を用いて実施することができるnkのライン、乾燥雰囲気を維持する真空/不活性ガス（N 2またはAr）の操作を使用している。

細胞傷害性評価プロセスでは、実験を通して細胞の出現を検討する必要がある。.......

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開示事項

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著者は、彼らが競合する金融利害関係はありません宣言します。

謝辞

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資金は、欧州共同体のセブンス枠組み計画（FP7/2007-2013）/ ERCグラント契約がない[239603]の下で、欧州研究評議会から受け取った

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬/材料
ウシ胎児血清 (FBS)生物産業04-007-1A
ヘキサン ARガドット830122313溶媒乾燥システムを使用して乾燥
HT-29 細胞株ATCCHTB-38
イソプロパノール ARガドット830111370
L-グルタミン生物産業03-020-1B
MTTシグマ・アルドリッチM5655-1G
ペニシリン/ストレプトマイシン 抗生物質生物産業03-031-1B
RPMI-1640 フェノールレッドと L-グルタミンシグマ・アルドリッチR8758
RPMI フェノールレッドなし生物産業01-103-1A
テトラヒドロフラン(THF)ARガドット830156391溶剤乾燥システムを使用して乾燥
Ti(OiPr)4Sigma-Aldrich205273-500ML湿気に敏感な
トリプシン/EDTA生物産業03-052-1B
VO(OiPr)3Sigma-Aldrich404926-10G水分sensitive
Equipment
12チャンネルピペット30-300 μlThermo Scientific
12チャンネルピペット 5-50 μlフィンピペット
75 cm2フラスコNUNC156472
96ウェルプレート 蓋付き(平底)NUNC167008
CO2 インキュベーターバインダーAPT.line C150
カウンターチャンバーマリエンフェルト・スペリオル650030
エッペンドルフ・バイアルKARTELL
グローブボックスM. Braun
層流フードADS LAMINAIREOPTIMALE 12
マイクロプレートリーダー 分光光度計Bio-TekEl-800
顕微鏡ニコンエクリプス TS100
ピペット 20-200 μlフィンピペット
ピペット 5-50 μlフィンピペット
させます

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
  2. Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor ce....

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