方法論記事

C.エレガンスゲノムへの高透過率の染色体外アレイを組み込むための迅速なプロトコール

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DOI：

10.3791/50773

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2013年12月9日

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1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

この記事について

サマリー

このプロトコルは、紫外線(UV)照射を使用して、トランスジェニック染色体外アレイを線虫ゲノムに組み込むための迅速かつ低材料消費の手順を説明しています。さらに、このプロトコールは、染色体外アレイを高速で伝達するトランスジェニックラインに特に適しています。

要約

Caenorhabditis elegansの合胞体性腺の細胞質にDNAをマイクロインジェクションすることは、染色体外アレイの部分的および可変的な伝達速度を次世代に示すトランスジェニック系統を確立するために使用される主要な技術です。さらに、トランスジェニック動物はモザイク状であり、さまざまな数の細胞でトランスジーンを発現します。染色体外アレイは、UV照射を使用してC.エレガンスゲノムに組み込むことができ、導入遺伝子の透過率が100%の非モザイクトランスジェニック株を確立することができます。その範囲で、UV照射トランスジェニック動物のF1子孫は、導入遺伝子のヘテロ接合統合を有する動物についてスクリーニングされ、F2子孫への75%のメンデル伝達率につながります。この方法の課題の1つは、統合前(X%トランスジェニック動物)と統合後(≥75%トランスジェニックF2動物)の集団における導入遺伝子伝達の割合を区別することです。したがって、この方法では、トランスジェニック動物の割合がメンデルの分離である75%よりも大幅に低い非統合トランスジェニック系統を選択する必要があります。したがって、次世代への染色体外アレイ伝達率≤60%)を持つ非統合型トランスジェニック系統が通常、統合に好まれ、高感染株への導入遺伝子統合は困難である。ここでは、透過率の高いトランスジェニック系統(≥80%)を使用すると、ゲノムへの染色体外アレイの統合効率が向上することを示しています。記載されたプロトコルは、高い染色体外アレイ透過率を示すトランスジェニック線虫のUV照射後にゲノムへのホモ接合性導入遺伝子統合を有するいくつかの独立した系統の容易な選択を可能にする。さらに、この方法は非常に高速で、材料消費量が少なくて済みます。特定の統合された導入遺伝子を発現する異なる系統を迅速に作製する可能性は、遺伝子発現パターンと制御、タンパク質の局在化、過剰発現に焦点を当てた研究、および細胞内マーカーの開発にとって非常に興味深いものです。

概要

トランスジェネは、C. elegansの幅広い用途に広く使用されています。トランスジェニック株は、典型的には合体雌雄同体の生殖腺1,2へのDNA注入によって生成される。目的の導入遺伝子を運ぶDNAは、共注入マーカー1,3,4をコードするプラスミドと共に共注入されます。共注入マーカーは、蛍光タンパク質の発現または特定の行動表現型または形態学的表現型のいずれかにつながる確立された導入遺伝子です。注入されたDNAは、マルチコピーの染色体外アレイを形成するように再配列されます。したがって、目的の導入遺伝子と共注射マーカーは一緒に伝染します5,4。トランスジェニック系統は、共注入マーカーの発現によって誘導される表現型(蛍光または特異的表現型)1に従うことにより、注入された動物のF2世代で選択されます。トランスジェニック系統は、染色体外アレイの次世代への部分的および可変的な伝達速度を示します。系統にもよりますが、動物の10〜100%(100%はまれなイベント)が染色体外アレイを受け継ぎます。さらに、トランスジェニック動物はモザイク状であり、さまざまな数の細胞でトランスジーンを発現します。このモザイク現象は、次世代への伝播率と相関していると考えられる。実際、生殖細胞と体細胞の両方で、伝達速度は細胞分裂中の染色体外アレイの分離に依存します。この問題を回避する1つの方法は、導入遺伝子をゲノムに組み込むことです。古典的には、導入遺伝子の染色体への統合は、染色体外アレイ3を保有するトランスジェニック線虫の照射(紫外線またはガンマ線)に依存している。簡単に言うと、50〜100匹の雌雄同体の動物がL4幼虫の段階で照射されます。F1世代では、200-800頭のトランスジェニック動物を選抜し、プレート上で個別に培養します。メンデルの分離によれば、トランスジェニックF1動物がトランスジェニックF1動物にヘテロ接合性でゲノムに組み込まれた場合、トランスジェニックの子孫の1/2が統合型アレイのヘテロ接合性であり、トランスジェニックの子孫の1/4が統合型アレイのホモ接合性であり、アレイを統合していない子孫の1/4が産生されます(図1).したがって、F2世代を含むプレートは、共注入マーカーの発現によって観察されるように、≥75%のトランスジェニック動物について視覚的にスクリーニングされる。統合候補として選択されたF2動物の約1/3は、統合アレイのホモ接合体であり、ホモ接合体のF3動物を100%産生すると仮定されます。したがって、選択された各プレートから、3〜8匹のトランスジェニックF2動物を個別に培養し、トランスジェニック子孫が100%のプレートが選択されます。次に、8匹のF3動物を個別に培養し、導入遺伝子の100%の遺伝を確認します。

この方法の主な欠点は、

  1. ≥75%トランスジェニックF2子孫には数百枚のF1プレートの視覚的スクリーニングが必要ですが、非統合染色体外アレイの伝達率が変動し、予測できないため、時間がかかります。あるいは、F1プレートのスクリーニングを避けるために、P0動物への照射後にいくつかのその後の飢餓ステップを実行することができる;続いて、100匹のトランスジェニック動物を選び、100%トランスジェニック子孫をスクリーニングします3。
  2. この割合を75%と区別するのが難しいため、60%を超える染色体外アレイ伝達の割合を示す株には適応されません。
  3. 比較的透過率の低い株しか使用できないため、多数のトランスジェニックP0動物を照射するとともに、多数のF1およびF2動物を観察する必要があり、これは非常に時間がかかり、かなりのプレート数を必要とします。

線虫の照射は、おそらくDNAの二本鎖切断を誘発し、DNA修復中に染色体外配列の染色体への統合が起こります。したがって、照射を介した統合が成功する可能性は、染色体外アレイを持つ生殖細胞の数に正比例する可能性があります。高い透過率を持つ株は、2で示唆されているように、低い透過率を持つ株よりも多くのトランスジェニックDNAアレイを含んでいる可能性があり、染色体外アレイを持つ生殖細胞の数が多い。したがって、透過率の高い系統では、伝播率の低い系統よりも導入遺伝子の統合が容易である可能性があると推論しました。しかし、標準的なプロトコルでは、非統合型染色体外アレイを持つトランスジェニック動物の割合は、導入遺伝子のヘテロ接合型ゲノムへの組み込みを持つF1動物の子孫の割合とほとんど区別できないため、高い伝達頻度で導入遺伝子を統合する可能性は排除されています(図1)。

ここでは、特定の導入遺伝子について、紫外線(UV)光の照射後に回復する集積線の数が、非集積アレイの透過率の初期パーセントに依存することを示しています。私たちは、導入遺伝子アレイの透過率が高い株に特に関連するUV照射を介した導入遺伝子統合のための改良されたプロトコルを提示します。

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プロトコル

1. 遺伝子組換え線虫の培養

1で説明したようにトランスジェニック系統を作製できます。これらのラインには通常、特定の発生段階で蛍光タンパク質の発現または特定の行動または形態学的表現型のいずれかにつながる共注入マーカープラスミドが含まれています1,3。この組み込みプロトコルは、蛍光または非蛍光共注射マーカーを発現する株に適用できます。以下の例では、蛍光共注射マーカーを有する株を使用しました。

  1. 培養プレートを準備します。
    1. 約500 mmの大きなシャーレを調製し、各10mlの線虫成長培地(NGM)6,7を無菌的に注ぎます。
    2. 各プレートに0.3mlの飽和大腸菌OP50培養液を標準的な手順6,7に従って播種します。
  2. 統合するトランスジェニックラインの伝送速度を評価します。
    1. 各トランスジェニック系統について、7で説明したように、ワームピックを使用して、蛍光立体視鏡の下で10個の別々の培養プレートに10個の蛍光妊娠成体を選びます。
    2. 15〜25°C(遺伝的背景によって異なります)のワームインキュベーターで動物を培養し、ワームが繁殖できるようにします。
    3. 毎日子孫を観察して、共注射マーカーが発現し、最もよく観察できる発達段階を評価します。.現在使用されている共注射マーカーのほとんどの発現は、L4幼虫期または成体期に観察されます。.
    4. 蛍光ステレオスコープでの観察により、蛍光子孫の割合を決定することにより、子孫の透過率を評価します。
  3. 導入遺伝子統合のためのトランスジェニックラインを選択してください。
    1. できるだけ高い透過率(理想的には≥80%)のトランスジェニックラインを選択します。
  4. 統合のためにL4幼虫期に同期したトランスジェニック動物の集団を取得します。
    1. 蛍光性の妊娠した成体30匹を5つの培養プレート(プレートごとに6匹)に選びます。
    2. ワームに15°Cで3〜4時間卵を産ませます。
    3. プレートごとに少なくとも30個の卵の存在を確認した後、成虫をプレートから排除します。
    4. 子孫がL4幼虫期(15°Cで96時間または25°Cで36時間)に達するまで、15〜25°Cのワームインキュベーターで動物を培養します。

2. トランスジェニック線虫の紫外線照射と回復

  1. ワーム照射:
    1. 30-100匹の蛍光トランスジェニックL4動物を別々の培養プレートに選んでください(プレートごとに15-20匹)。
    2. 蓋を外した状態でプレートをUV架橋剤に入れます。線虫に0.012J/cm2を照射します。ひずみは多かれ少なかれUVに敏感であり、結果は使用するUV照射器によって変動する可能性があることに注意してください。0.010-0.015 J/cm2の線量範囲を試験することができます。
  2. 照射後のワームの回復:
    1. 放射線を照射したワームをプレートに一晩15°Cで置き、回収します。
    2. 生きている動物の数を確認してください。私たちの手では、約80〜90%の生存率が効率的な照射に適応しています。
    3. ステップ1.2で確立したように、子孫が発生段階に達するまで、照射した動物を15〜25°Cで成長させ、共注入マーカーの発現を観察できるようにします。

3. 統合型トランスジェニック系統の単離

  1. F1動物の選択:
    1. 150-200蛍光F1動物を1匹ずつ別々の培養プレートに保管します。送信率の高い回線(≥80%)には、100匹のF1動物で十分です。
    2. これらのF1プレートは、子孫が蛍光F2動物の観察に適した段階に達するまで、15〜25°Cに保ちます。
    3. i)子孫がいない(F1動物が不妊または死亡したことを示す)、またはii)蛍光性のF2動物が存在しないか、またはほとんどない(F1動物が期待された速度で導入遺伝子を伝達しなかったことを示す)F1プレートをすべて廃棄します。このステップは迅速であり、≥75%の蛍光子孫を示すF1プレートを選択するために蛍光F2線虫の割合を推定する必要がある標準プロトコルと比較すると、真の利点を表しています(表1)。
  2. F2動物の選択:
    1. 選択した各F1プレートから4匹の蛍光トランスジェニックF2動物を1匹。蛍光導入遺伝子(mCherry8、gfp9、dsRed10など)を使用する場合は、これらの動物が統合アレイに対してホモ接合であることを示す可能性があるため、高レベルの蛍光を持つF2線虫を選択してください。F2動物を選別する際には、次のステップで偽陰性を避けるために、卵や幼虫を持ち込まないようにすることが重要です。
    2. F2動物を15〜25°Cで育てます。
  3. 統合されたトランスジェニック株の単離とバリデーション:
    1. 100%蛍光トランスジェニックF3線虫用のスクリーニングF2プレート。1つの非蛍光線虫の存在は、プレートを捨てるべきであることを示しているため、スクリーニングは非常に高速です。統合された導入遺伝子のF2動物ホモ接合体は、100%ホモ接合体蛍光子孫を与えます。
    2. 選択したプレートから8匹の蛍光F3動物を1匹採取し、導入遺伝子の100%の遺伝を確認します。理論的には、このステップでは1匹の動物を選ぶだけで十分です。しかし、不妊または不健康な動物の選択を避けるためには、蛍光F3を8匹選ぶ必要があるかもしれません。なぜなら、放射線照射は、線虫の生理学に重要な遺伝子に影響を与える突然変異をランダムに誘発する可能性があるためです。
    3. 可能であれば、いくつかの独立した統合トランスジェニック株、すなわち異なるF1動物から回収された株を保管してください。

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結果

染色外アレイをほぼ同等の頻度（50-60%）で伝達する2つの異なる系統における導入遺伝子の組み込みを、標準プロトコルおよび改良プロトコルを用いて実施した（Table 1）。標準プロトコルでは、91匹の導入遺伝子保持L4動物にUV照射を行い、3つの独立した組み込み系統を回収した。一方、改良プロトコルでは、30匹の導入遺伝子保持L4動物にUV照射を行い、1つの組み込み系統を回収した。このことは、組み込み効率が両プロトコルで同等であることを示唆している（UV照射したL4動物30匹あたり1つの組み込み系統）。しかし、同一の導入遺伝子の組み込みについて比較した場合、一方のプロトコルが他方より効率的である可能性を排除することはできない。プロトコルの主な違いは、改良法では蛍光を発する子孫を持つすべてのF1プレートを、蛍光F2動物の割合に関わらず選択したのに対し、標準法ではF1プレートの目視スクリーニングを行い、導入遺伝子保持F2子孫が75%以上のプレートのみを選択した点にある。このスクリーニング工程は非常に時間がかかり、特に初期の伝達率が75%に近い場合に顕著である。改良プロトコルでは、導入遺伝子保持F2動物を含む各...

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ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、染色体外トランスジェニックアレイを C.エレガンスの ゲノムに組み込むための効率的な方法を提供します。同じ導入遺伝子 Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45)を異なる速度(10-15%、50-60%、および>80%)で伝達した異なる非統合株を使用して、UV照射後に回復された統合株の数が非統合株の初期伝達レベルに依存することを示しました(表2)。したがって、導入遺伝子は高い伝達率を示す系統に組み込むことが容易です。

統合導入遺伝子は、遺伝子制御や遺伝子発現パターンに関連する研究など、幅広い目的で関心があります。統合導入遺伝子は、蛍光細胞内マーカーを確立するための有用なツールでもあります。導入遺伝子を組み込む場合、複数の独立した系統を単離することが重要になる場合があります。いくつかの研究では、さまざまな遺伝的背景に導入遺伝子を導入する必要があります。ただし、導入遺伝子は、目的の遺伝子に近い染色体に挿入されたり、特定の遺伝的背景で望ましくない表現型につながる可能性のある突然変異...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言する。

謝辞

著者は、非統合Pdyc-1を生成してくれたClaire LecroiseyとLaurent Ségalatに感謝したいと思います::d yc-1::gfp;Pmyo-2::d sRedおよびPmyo-3::gfpトランスジェニック株。Pmyo-2::d sRedプラスミドを贈呈してくださったAndy Fire氏と、Pmyo-3::gfpプラスミドを贈呈してくださったPamela Hoppe氏に感謝します。この研究は、フランス国立科学研究センター(CNRS)とリヨンのクロード・ベルナール大学によって設立されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
NGM(線虫増殖培地)調製用寒天プロラボ20768.292
NGM調製用NaClChimie-Plus40045
NGM調製用バクトペプトンBD211820NGM調製用
KH2PO4Roth3904-1NGM調製用
K2HPONGM調製用4Prolabo26930.293NGM調製
MgSO4RothP027.2NGM調製用
CaCl2Prolabo22317.297NGM
調製用コレステロールレクタプール
LBブロスシグマL3022バクテリア
機器
U.V.架橋器フィッシャーサイエンティフィ波長 254 nm
顕微鏡 SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
シャーレ、60 mmCMLBPS55E6
Platinium wire 0.25 mmAlfa Aesar7440-06-4ワームのピックを作るには (7)
(6,7)用OP50の培養用ック

参考文献

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  4. Hobert, O. PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans. BioTechniques. 32, 728-730 (2002).
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  8. Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. A modular vector kit for transgenesis in C. elegans. International Worm Meeting. , (2007).
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UV F1 F2

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