私たちは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対するブドウ球菌カセット染色体メック(SCCmec)I-V型の迅速なスクリーニングとタイピングのためのシンプルなマルチプレックスPCRアッセイを実演し、このアッセイを個々の研究室に適応させるための重要なステップと手順のニュアンスを提供します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
訂正のお知らせ
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
サマリー
要約
????????????MEC(SCC MEC) ?????????????????????????MRSA(CA-MRSA)?????????????????????? (MRSA)????????????????????????????????????????PCR????????????MEC?CCR????????????????????SCC MEC?????????????????????????PCR?????????????????????????SCC MEC??V???????I?????????????????????????????PCR???????????????????????????????????????????????????????????????SCC MEC?????????????????????????????????????NAT????????????????????????????????????????????????URE?????????????? MRSA SCC MEC??????????????????????????????????????PCR?????????????????????????????????????????????????????
概要
?????????????? (MRSA)???????21??67-kb?????????????????????????(mecA??? )??????????????????1???????????????MEC(SCC MEC)?????? SCC MEC??????????????????2???????????(MEC?????????CCR??????)???J-??(?1)??????????????? CCR?????????SCC MEC?????????????(CCR / ccrAB)???????????????MEC????????431mec mecA??? ??????????mecR1?mecI?????????????IS???????????????1????2????MEC?????(mecB ??MECC)?mecA??????2?????????????????????????? SCC MEC??????????MEC?CCR?????????????????????????????J??(J1?J2????J3)?????????????????MEC??????(????B?C?D???E)???CCR????????(????1-8??)????????????????????????????????????SCC MEC????????????????????(IWG-SCC)?????????????????????SCC MEC?????????????????SCC MEC???MEC???CCR?????????????????????????????????J 1 DNA?????????????? MRSA????????????????????????(ST)???/ ??????????????????( ?? )?????( ??? ST8???(???/???)???????????????????????????????SCC MEC??????????????????????????-T008-MRSA-IVa)????????SCC MEC?????????????????????????MRSA(CA-MRSA)????????MRSA?????????????????????????????????????
???PCR????????????MEC?CCR????????????????????SCC MEC???????(20?30)????????????????????PCR??????????????????? ?????21????????SCC MEC I-IVb?3????????????????PCR??????????? subsequently CCR?MEC???J-?????????????????????????????????????????????????PCR???4?????????? SCC MEC???????????????????????PCR(M-PCR)???????????????PCR????????????????????Lencastre??SCC MEC I-IV???????????????M-PCR???????SCC MEC IV???????5,6,7????????????M-PCR??SCC MEC IV??????????????????????????????????????2???SCC MEC IV??????????????????????????????????????? SCC MEC???????????????????????SCC MEC?????????????????????????????PCR???????????????????I V 8????????????????B???????ecame 9??????????????????????SCC MEC???????????????????????(SCOPUS??337?2013?1?30???)????????????????????????????MRSA SCC MEC?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? MRSA SCC MEC???????????????????????????? SCC MEC?????M-PCR???????????????????????????????????????????????????
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
?????????????????????????2?????????????????????????????????????????????????????
1?????
- MRSA???????????????????? PCR???????????????????????MRSA?????????????????????(TSA)???????????????????????????????????????????????? 37?????????????
- 1.5 ml?????????????????75
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
この更新されたM-PCRでは、SCCmecタイプI-V、およびSCCmec IVの主要なサブタイプを決定（分類）することが可能です。本アッセイは、mecA遺伝子の検出と併せて、SCCmec I、II、III、IVa、IVb、IVc、IVd、IVEおよびVの固有かつ特異的な遺伝子座を標的としています。SCCmec VIおよびVIIIの暫定的な同定も可能ですが、確定にはさらなる検査が必要です。図3に、代表的なSCCmec I-VIおよびVIIIと、各エレメント内における標的部位の位置を示します。
タイプI特異的プライマー（赤）は、SCCmec IのJ1領域にあるorf E008（菌株NCTC10442; AB033763）を標的とし、タイプIIプライマー（濃緑）は、これまでに報告されているすべてのSCCmec IIおよびSCCmec VIIIのJ2に存在するorf NO43（菌株N315; D...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ここで説明するマルチプレックスPCRアッセイは、ブドウ球菌におけるSCCmec I-V のタイプと主要なサブタイプを分類するための簡単で信頼性の高い方法を提供し、同時にMRSAとMSSAを区別します。このアッセイは堅牢で、1回のPCR反応で便利に行われ、結果は簡単に解釈できます。このアッセイには、各SCCmec タイプ内の個々の遺伝子座を標的とするという点で制限がありますが、包括的な ccr および mec 複合体タイピングを提供しないため、ゴールドスタンダードとは見なされません。いずれにせよ、プロトコルの広範な検証により、MRSA に関する科学的および疫学的研究にとって貴重な分子ツールであることが証明されています。
アッセイの高度な性質と反応中に存在する多数のプライマーにより、このアッセイを個々のラボに適応させる際に困難が生じる可能性があります。各ラボには、プライマーの濃度や純度、サーマルサイクラーやPCR成分の変動など、アッセイの結果に影響を与える可能性のある独自の条件や要因があります。そのため、このアッセ...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利益相反は宣言されていません。
謝辞
この研究で使用したいくつかの参照株の親切な贈り物に対して、T. Ito、K. Hiramatsu、R. Daum、H. de Lencastre、およびD. Colemanに感謝します。この研究は、アルバータ州カルガリー/カルガリー研究所サービス/カルガリー大学の抗菌薬耐性センター(CAR)によって部分的に財政的に支援されました。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| トリプシン大豆寒天 | 培地 Fisher (BD) | CA90002-700 (236920) | |
| 滅菌蒸留水 | Life Technologies | 10977-015 | |
| Platinum Taq: 10x PCR buffer and 50 mM MgCl2 | Life Technologies | 10966-034 | |
| 100 mM dNTP | Life Technologies | 10297-018 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| ホウ酸 | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| EDTA | ライフ | テクノロジー15576-028 | |
| アガロース | ライフサイエンス | テクノロジーズ16500-500 | |
| グリセロール | ライフサイエンス | テクノロジーズ15514-011 | |
| モフェノールブルー | シグマアルドリッチ | B8026 | |
| 1Kb+ DNAラダー | ライフテクノロジー | 10787-026 | |
| 臭化エチジウム | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| 1.5ml 微量遠心チューブ | VWR (Axygen Scientific) | 10011-700 | |
| カルチャースティック | VWR | CA10805-018 | |
| PCR チューブ | Diamed | AD0210-FCN (new #: DIATEC420-1250) | |
| 遠心分離機 | エッペンドルフ | 5417c | |
| ヒートブロック | VWR | 13259-030 / 13259-286 | |
| サーマルサイクラー | Applied Biosystems (2720) | 4359659 | |
| ゲル型付き水平、水中ゲル電気泳動チャンバー | BioRad | 170-4469 | |
| 電源 | BioRad | 164-5050 | |
| ロッカーシェーカー | VWR | 40000-300 | |
| 分子イメージャーゲルドックシステム | BioRad | 1708170 |
参考文献
- IWG-SCC. Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).
- Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).
- Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community. Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).
- Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).
- Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).
- Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).
- de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification. Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).
- McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII. Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Posted by JoVE Editors on 3/19/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. There was a typo in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG
