電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法

Summary

複雑な生体試料中のバイオマーカーの測定はますます意思決定臨床指導されています。私たちは、同時に心臓ミオシン結合タンパク質C、クレアチンキナーゼMB、および心筋梗塞と健常者の被験者からの血清サンプル中の心筋トロポニンIを測定する高感度な方法を説明します。

Abstract

バイオマーカーだけでなく、基礎科学、意思決定の臨床でますます重要になってきています。診断心筋梗塞（MI）は、主に心筋障害の指標として患者の血清または血漿中の心臓特異的タンパク質を検出することによって駆動される。心臓ミオシン結合タンパク質-C（cMyBP-C）はMI後に血清中で検出可能であることが最近示されたので、我々は、MIの可能性バイオマーカーとして提案している。バイオマーカーは、典型的には、従来のサンドイッチ酵素免疫アッセイによって検出される。しかし、この技術は、大規模なサンプル量を必要とする小さいダイナミックレンジを有しており、同時に複数のタンパク質を測定することができる。

ここでは、3つの心臓タンパク質を高感度で同時に測定することができる多重イムノアッセイを示す。クレアチンキナーゼMBや心筋トロポニンとともにuniplexでcMyBP-Cを測定するか、または私が同等の感度を示した。この手法は、メソスケールディスカバリーを使用しています検出のための電気化学発光と組み合わせる96ウェルプレートに多重化（MSD）メソッド。わずかなサンプル量が必要とされているが、高感度、広いダイナミックレンジが得られる。このテクニックを使用して、我々はcMyBP-C、クレアチンキナーゼMB、および心筋トロポニンMIと16科目からの血清サンプル中の私はレベルを測定し、16対照被験者と比較を行った。我々は、これらのサンプルのすべての3つのマーカーを検出することができたとMI後に増加するすべての3つのバイオマーカーを発見した。この技術は、したがって、血清サンプル中の心臓マーカーの高感度検出に適している。

Introduction

血清などの複雑な生物学的サンプル中のタンパク質の少量の測定は、患者管理のための成長臨床的重要性、並びに​​基礎科学である。例えば、このようなトロポニンなどの心臓マーカーの血清レベルの増加は、私は、臨床で急性心筋梗塞^（MI）1と一致する。それは、高感度を有しており、検体の絶対的定量を可能にするような血清試料中のタンパク質を検出するために、標準的な酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）は、最も頻繁に使用される技術である。しかしながら、従来のELISA法では、試料の比較的多量（典型的には100μl）を必要とするいくつかの生物学的液体中の高バックグラウンド信号を有し、ELISA ²ごとに1つだけの検体の測定に制限される。

最近では、新しい免疫測定技術は、これらの欠点の多くを回避することを導入されました。この修​​正されたアッセイは、MSDが開発した、electrochemiluminescを使用しています少量のサンプル量の使用を可能にする、非常に低いバックグラウンドおよび感度の向上を可能にする信号検出用リファレンス（ECL）。電気化学発光を検出抗体に添付されたレポーター分子ルテニウム（II）trisbipyridal、に基づいています。このレポーター分子は、それら³に一体化炭素電極を有する96ウェルプレートの底部の電気的な刺激により620nmで発光する。また、スポットコーティングを使用することによって、複数の捕捉抗体は、単一の試料⁴中の異なるタンパク質の同時定量を可能にする、1つのウェル（96ウェルプレート上で10まで）に塗布することができる。この技術は、近年、血清^5,6の炎症性サイトカインプロファイルを測定するために使用されている。 MSDから多重プレートは他のマルチプレックスアッセイプラットフォームに好意的に^7を比較します。

主要なアッセイプラットフォームとしてMSD使用して、我々はさらに3プレックスプレートCそのカスタムメイドを開発同時に心臓ミオシン結合タンパク質-C（cMyBP-C）、クレアチンキナーゼMB（CK-MB）、および心臓トロポニンI（cTnIの）のレベルを定量化し、その結果をcMyBP-Cのモノプレックス検出と比較した。 CK-MBとcTnIのはMIのための十分に確立されたバイオマーカーである。しかし、これらのバイオマーカーの増加はMI、 例えば心筋炎または腎不全⁸以外の病態が原因で発生することができます。これは、MI診断の特異性を増大させる付加的なバイオマーカーの付加のために主張している。我々は、最近cMyBP-Cはまた、MI ⁹の潜在的なバイオマーカーであることが示されている。 cMyBP-Cは心臓^、10-12でなく、骨格または平滑筋に発現しているタンパク質を関連付け太いフィラメントです。このように、循環系におけるcMyBP-Cの増加レベルは、心臓障害¹³の具体的な指標である。

本研究では、血清レベルのを測定するためのカスタム3プレックスアッセイの使用とcMyBP-Cのuniplex検出を比較したMI患者の血清中cMyBP-C、CK-MB、およびcTnIの。将来的には、この署名技術は、緊急治療室での胸痛を呈する患者で心筋梗塞を診断するために使用されるかもしれません。

ロヨラ大学シカゴの機関審査委員会（IRB）はdeidentifiedヒトサンプルの使用とイムノアッセイの使用（LU＃20392）のための研究を承認した。

Protocol

1。 Uniplex cMyBP-Cアッセイ

1. 実験前日、コート捕捉抗体と96ウェルMSD裸標準プレート。 cMyBP-Cの場合は、リン酸緩衝食塩水（PBS）で希釈した5μgの/ mlの濃度でマウスモノクローナル抗cMyBP-C抗体（ゼラチン無料）30μlのボリュームを使用しています。
2. 、疎水性であるため、井戸の底の隅にソリューションをピペットで、次に全体を優に超えるソリューションを広めるために、プレートの側面をタップします。
3. プレートは、プレートシーラーで覆い、振とうせずに4℃でO / Nインキュベートする。
4. シンクの上にして、ペーパータオルのスタック上にソリューションをタップして、捕捉抗体溶液を除去。プレートへの非特異的結合を各ウェルに、PBS中の5％（w / v）のブロッカー（ハイグレードBSA）溶液を150μlを添加することにより遮断される。
5. 700 rpmで振とうしながら室温で1時間、プレートとインキュベートを封印。
6. ブロッキングステップの間、基準とsを準備amples。 1％（w / v）のブロッカー/ PBSで2,000 ngの/ mlでの出発濃度に - 換えcMyBP-Cタンパク質断片（271アミノ酸1）を希釈することによって標準のシリーズを作る。次いで、直列1％（w / v）のブロッカー/ PBSで5倍に希釈する。 7規格の合計+ 1ブランク（1％（w / v）のブロッカー/ PBS単独）を用いた。
7. ブロッキング溶液を取り出し、150μlの0.05％（v / v）のTween-20/PBSで3回プレートを洗浄。たびに、シンク上反転プレートによって洗浄溶液を除去。第三の洗浄ステップの後、精力的にシンク上のプレートをフリックして、それが完全に乾燥するまで、ペーパータオルの層の上に積極的にプレートをなでる。インキュベーション体積が小さいので、これは重要なステップであり、残りの洗浄溶液が大幅次のインキュベーションを希釈する。
8. ウェルに基準やサンプルのピペット25μlの。 1時間700rpmで振とうしながら、室温でプレートとインキュベートを封印。
9. 1％ブロッカー/ PBSで1μgの/ mlで検出抗体溶液を準備します。 CUMSDスルホ-TAG標識検出抗体として働くと - STOMはcMyBP-C抗体（14エピトープのアミノ酸2）を作った。キットは、任意の抗体を標識するための比較的簡単な手順で作り、スルホ-TAGの標識に利用可能です。
10. ステップ1.4で説明したように洗浄工程を繰り返します。
11. 、各ウェルに検出抗体溶液25μlの追加プレートを密封し、シェーカーは700rpmでセットプレート上で1時間室温でインキュベートする。
12. 潜伏期間中は、セクターイメージャとソフトウェア（試薬の項を参照）の適切な機能を確保するために、MSDのデモプレート（LEDライトが付いているプレート）を実行します。また、15リードバッファ4倍mlの蒸留水5mlを添加することにより、MSDによって提供され、読み取りバッファを希釈する。
13. ステップ1.4で説明したように洗浄工程を繰り返します。
14. マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに読み取りバッファー150μlのを追加します。気泡（リバースピペッ​​ティングが適切な方法である）を回避してください。読み取りバッファの添加後、直ちに分野におけるプレートをスキャンイメージャ。

2。 3プレックスcMyBP-C、CK-MB、およびcTnIのアッセイ

1. 96ウェル-3 - プレックス板と希釈溶液は、使用前に室温に平衡化させている。このプレートは、MSDによるcMyBP-C、CK-MB、およびcTnIのための捕捉抗体で予めコーティングされている。
2. 各ウェルに1％（w / v）のブロッカー/ PBS25μlのを追加します。全体をうまくが溶液で覆われていることを確認するために、プレートの側面をタップします。
3. プレートシーラーでプレートをシールし、プレートシェーカー上にプレートを置き、30分間700rpmで振る。
4. その間に、個々のカリブレータの希釈系列を調製する。各ウェル3捕捉抗体を持っているので3キャリブレータは混合されると、連続的に使用する前に希釈する必要があります。 2,000 ngの/ mlのcMyBP-C、100 ngの/ mlの一つのサンプルを作成するために1％を一緒に換えcMyBP-C、CK-MB（MSD）、およびcTnIの（MSD）（w / v）のブロッカー/ PBSを希釈CK- MB、および25 ngの/ mlのcTnIの（サンプル）。
5. 少なくとも100μlの最終体積は、各規格のために準備される。へスタンダードシリーズを完了し、順次サンプルが5倍に希釈している。試料を25μl使用100μlの1％（w / v）のブロッカー試料Cを作成するために、100μlの1％（w / v）のブロッカー/ PBSで、サンプルBを25μl使用その後、試料Bを作成する/ PBSでなどが挙げられる。 MIの16科目と16の対照被験者からのヒト血清サンプルをcMyBP-C、CK-MB、およびcTnIのレベルを測定するために使用された。これらのサンプルを1％（w / v）のブロッカー/ PBSで2倍希釈した。
6. 3プレックスプレートのウェル内に既に存在する25μlに25規格の添加および希薄化後のサンプルを追加します。また、空白にして（希釈剤のみ）を含めることが重要です。技術を確立するために、サンプルは技術的三連でロードされる。それ以外の場合は、重複で十分です。
7. 再びプレートをシール（プレートシーラーを再利用できる）、2時間室温でプレートシェーカー（700 rpm）でのインキュベート。
8. インキュベーションが完了する直前に、検出抗体溶液を調製する。使用される希釈剤は、PBS中1％（w / v）の遮断薬である。すべてTHReeのSULFO-タグ検出抗体は、1μgの/ mlの各々の最終濃度に一緒に希釈する。検出抗体は、典型的には50倍のストック濃度に設けられている。
9. フル96ウェルプレートの場合は、合計希釈液の2,700μlを（エラーが含まれているピペッティングで）必要とされる。 2,538μlの1％（w / v）のブロッカーPBS /に各検出抗体54μLを加える。
10. 2時間後、精力的にシンク上プレートをフリックでソリューションを削除します。のTween-20、PBS中の0.05％150μlのウェルに3倍を洗ってください。ウェルマルチチャンネルピペットを用いて各検出抗体溶液25μlを添加し、プレートの側面が全体ウェル溶液で覆われていることを確認するためにタップされている。
11. プレートを密封し、700rpmで振とうしながら1時間インキュベートする。
12. 潜伏期間中は、セクターイメージャとソフトウェアの適切な機能を確保するために、MSDのデモプレート（LEDライトが付いているプレート）を実行します。またの4倍の読み取り5ミリリットルを追加することで、MSDによって提供される読み取りバッファー、希釈15ミリリットルの蒸留水にバッファ。
13. ステップ2.8で説明した洗浄手順を繰り返します。
14. よくマルチチャンネルピペットを用いてそれぞれに読み取りバッファー150μlのを追加します。気泡を避けることが重要です（リバースピペッ​​ティングは、適切な方法である）。読み取りバッファーを添加した後、直ちにセクターイメージャでプレートをスキャン。

Results

3 -プレックスアッセイの基本的な原理およびワークフローを図1に示し、全体的なワークフローを表1に記載されている。 Uniplexアッセイは、底面全体が1つのウェル捕捉抗体で被覆されていることを除いて同じ原理に沿って動作する。信号検出は、電気信号​​がウェルの底部に適用したECLによって行われる。これは、順番に、検出抗体にSULFO-TAGラベルを読み取りバッファの化学反応を通る光の現地生産を開始する。これは、低バックグラウンドおよびアッセイの高感度につながる。 図2では、uniplexアッセイにおけるcMyBP-Cの標準曲線は、3プレックスアッセイにおいてcMyBP-Cのそれと比較される。両方のアッセイは、非常に高感度、高ダイナミックレンジを示す。検出レベルと定量化レベルは、 表2に示し、uniplexおよび3 -プレックスアッセイの両方に匹敵するている。 cTnIのとCK-MBの検出レベルは、ALSであるoが図3<...

Discussion

本研究では、患者からの血清中の複数の心臓のバイオマーカーの検出のためのマルチプレックスイムノアッセイの適用可能性を示しています。この技術は、伝統的なELISA比べて数多くの利点を有する。まず、アッセイキットでECLを比色検出の代わりに使用されている。 ECLにおいて、電気信号は、このような背景^14を減少させる信号から刺激イベントを切り離す、測定された特性（光）の現地生産を刺激する。これは、 表2に見られるように、高感度を可能にする。

アッセイを多重化すると、 図2及び表2に見られるように、cMyBP-Cを検出するための感度の損失をもたらさない。 uniplexで測定cMyBP-Cは、CK-MBとcTnIの¹³で同時に測定cMyBP-Cに匹敵する感度と検出範囲を示した。同時測定は、実質的measuremenに必要な試料の量を減らす希少生物試料と同様、複数uniplexアッセイを実行に費やす時間を減らすことで作業する際の重要な要因となりうるT...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) with Surfactant	Meso Scale Discovery	R92TC-2
トゥイーン-20	アクロス	9005-64-5
MSDブロッカーA	メソスケールディスカバリー	R93BA-1
リン酸塩緩衝生理食塩水、10X	Fisher BioReagents	BP399-4	フィルター使用前に
ミオシン結合タンパク質C抗体、マウスモノクローナル(E7)、ゼラチンフリー	サンタクルス	SC-137180L	コーティングの場合、抗体はゼラチンフリー
Plates and Equipment
Multi-Array 96ウェル標準プレート	メソスケール	ディスカバリーL15XA-3
プロトタイプの3プレックス、4スポット、96ウェルプレート、cMyBP-C、cTnI、CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
サーマシールシーリングフィルム	ライフサイエンスプロダクツ株式会社	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	メソスケールディスカバリー
MTS 2/4 デジタルマイクロタイターシェーカー	IKA	3208001