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方法論記事

酵母発光測定とアフリカツメガエル卵母細胞電気生理学的検定試験

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DOI:

10.3791/50816

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2013年12月31日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

この記事について

サマリー

TRPV4のを研究するためによく使用されるメソッドを補完するために、二つの方法が記載されている：その機械的感受性は、低浸透チャレンジの際に遺伝子組換え酵母中のCa 2 +-エクオリン発光測定により研究することができる。また、オンセルまたは切除されたモードでクランプ全細胞の2電極電圧クランプまたはパッチによりアフリカツメガエル卵母細胞に注入TRPV4-RNAで検査することができる。

要約

TRPV4（一過性受容体電位バニロイドファミリー、タイプ4）が広く脊椎動物の組織において発現され、機械的な力によるものを含むいくつかの刺激によって活性化される。特定のTRPV4の変異は、人間の複雑な遺伝性骨や神経細胞の病状を引き起こす。野生型または変異TRPV4導入遺伝子は、一般的に培養された哺乳動物細胞で発現し、フラ-2蛍光法により、電極によって検査されています。機械的感受性のメカニズムと疾患の分子基盤の面では、現在の文献は混乱し、物議を醸している。既存のメソッドを補完するために、我々はTRPV4の分子特性を調べるために二つのメソッドを記述します。 （1）ラットTRPV4およびエクオリン導入遺伝子は、出芽酵母に形質転換する。形質転換体の人口の低刺激osmticショックはTRPV4チャネルを通じて放出によるCa 2 +を持つイクオリンの組み合わせに発光測定信号が得られます。ここでは、TRPV4は通常の哺乳類のパートナータンパク質から分離されているそして、独自の機械的感受性を明らかにする。 （2）TRPV4のcRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に注入される。適当なインキュベーション期間の後、TRPV4巨視的な電流は、2電極電圧クランプを用いて試験される。卵母浴からの不活性浸透圧調節物質の除去の際に電流の上昇は機械的感受性の指標である。卵母細胞からのマイクロアンペア（10 -6 A -4〜10）の電流が明確に定量化し、より多くの自信を持って評価を得培養細胞からナノアンペアサブナノへ（10 -10 A -9〜10）の電流よりもはるかに大きい。個々のチャネルタンパク質の活性を反映微視的電流も上に直接細胞または切除されたモードでは、パッチクランプの下に登録することができる。同じ卵母細胞は、より良いデータ複製が可能、複数のパッチのサンプルが用意されています。パッチに適用される吸引は直接機械的感受性を評価するためにTRPV4を活性化することができる。これらの方法は、TRPチャネルの他のタイプの研究に有用であるはずである。

概要

のTRP（一過性受容体電位）が感覚機能を、1,2を果たす陽イオンチャネルの7のサブファミリーを構成する。哺乳類では、TRPV、のTRPのバニロイドサブファミリーは、6種類があります。 TRPV4（タイプ4） の3,4熱に反応する、特定の化学物質、浸透圧膨張、またはせん断応力。 TRPV4遺伝子を繰り返し、候補遺伝子および/ ​​または5-8発現クローニングによって単離した。後者の方法は、低刺激浸透圧モル濃度の遺伝子産物の応答を行った。 TRPV4は、開発、生理学、または多くの異なる細胞型の病理3,4のほぼ全ての器官および機能に発現される。

印象的には、末梢神経障害および/ ​​または骨格異形成（骨格の発達の異常）9月11日に発生し、> 50人の常染色体優性のTRPV4変異である。セベ軽度brachyomiaタイプ3（タイプ3小人症）、spondylometaphyseal異形成コズロウスキータイプから骨格異形成範囲異形成RE、いくつかは、新生児または胚死を引き起こす。メカニズムのすべてのマナーが可能に見えるけど、どれも多様性、複雑性、多様性、およびこれらの疾患4の時々の重なりを説明していません。

他のTRPチャネル1と同様に、TRPV4は四量体である。ラットまたはヒトTRPV4では、各サブユニットは871残基から構成されている。その中心的な要素は、おそらく電位依存性K +チャネルと同様に配置された6つの膜貫通ヘリックス（S1-S6）である。そこでは、S1〜S4は、周辺領域を形成し、S5およびS6は、透過孔のドメインを形成する。 TRPV4のS5、S6の間、おそらく陽フィルタを形成するために収束そのうちの4つのシーケンスLDLFKLTIGMGDL、続く短いポアへリックスである。 470残基のN末端細胞質セグメントは、タンパク質または小リガンドを結合することが知られている6アンキリンリピートを含んでいます。 C末端152残基の細胞質セグメントは、OT結合する他の候補地の中でカルモジュリン結合配列を含む彼女の要素3。

TRPV4は、基本的に陰イオン1を除いた陽イオンチャネルである。その生理的機能は、Ca 2 +流入に刺激を伝達することですが、それは、P カルシウムの二価に有利、またアイゼンマンIV透過性配列と他の陽イオンを透過させる。P ナ 〜7 12。単一チャネルコンダクタンスは、〜90 psの外側へと〜40 psの内側6,13,14で整流する。異種発現（下）現在は低浸透腫れ、せん断応力、または暖かさ15によって活性化することができる。また、多価不飽和脂肪酸は16,17及び合成ホルボールエステルが18を 4αPDDによって活性化される。現時点では、どちらも高スループット、低分子スクリーニングによって発見された、10 -9〜10 -8 Mの20に効果的で、最も強力なアゴニストはGSK1016790A 19で、アンタゴニストはGSK2193874です。

TRPV4研究の二つの主要な分野は混乱のまま：TRPV4は、主にその機械的感受性のために研究されていても（1）、その分子基盤は、物議を醸している。 1つのモデルは、低刺激オスモル濃度が何らかの方法でエポキシゲナーゼによって酸（EET）をエポキシエイコサトリエンに変換される多価不飽和脂肪酸（PUFA）、アラキドン酸（AA）を生成するために、ホスホリパーゼA2（PLA2）を活性化し、EET ​​の結合は、TRPV4 16を活性化について説明17。しかし、TRPV4自体が直接簡単な説明を提供する、膜ストレッチ14（下）に応答することが示されている。 （2）TRPV4変異体の病状は途方に暮れるです。財団では、人は病気が消失、縮小、またはチャネル活動の増加によるものであるかどうかを知る必要があります。でも、ここで、文献は遠い透明からです。複数の骨格異形成の対立遺伝子は高い活性を有することが報告されたが、（機能獲得、GOF）4,21は 、いくつかは、活動（機能喪失、LOF）10,22が低下していると報告された。 14対立遺伝子の体系的な研究は、それらを発見すべてのGOFする変異（下）23。 TRPV4機能の完全な損失にもかかわらず、わずかな欠陥を持つ実行可能か、肥沃であるノックアウトマウス、、、 -いくつかのLOFSある主張は、TRPV4-/の表現型と矛盾するように思われる。

これらの論争の一部は方法論的な起源を持っています。研究所では、異なる方法、または1つの方法のバリアントを使用し、異なる判断基準を採用する。最も一般的には、TRPV4一過 （HEK、CHO、HeLa細胞）およびアゴニストまたは低張性刺激の際、内部の[Ca 2 +]の上昇をのCa 2 +感受性蛍光染料、フラ-2に登録されている培養哺乳動物細胞で発現される。この蛍光分析上の過度の依存は、1を批判されている。異なる集団における発現レベルは、その中に分布、ならびに効果的な色素濃度は、制御され、文書化される必要がある。より信頼性の高い、直接電気生理学的検査である。これさえ、commonlなどYは、練習問題もなくもありません。個々の培養細胞における発現レベルの制御が困難であるため、全細胞電流は大きな変動を有する。電流が小さいため、さらに、信頼できる統計は、多くの場合、実用的ではない大規模なサンプルサイズ、に依存する必要があります。パッチクランプ試験はほとんど行われていない。いくつかのそのような記録は、16,17に挑戦統計的評価を行い、活動のバーストのクラスタを示しています。

よりよい分子機械的感受性を理解するためには、TRPV4を調べるために2追加のシステムを開発しました。 （1）離れて通常の哺乳類のパートナーからTRPV4を単離するために、我々は、酵母24出芽にラットTRPV4を表明している。この進化的に遠い文脈におけるTRPV4の機能的発現は、それはまだ通常のパートナーなしで、浸透力に対応できることを示した。酵母は、AAまたはEET何らPUFAを行いませんし、そのゲノムは、PLA2またはエポキシゲの遺伝子を持っていない、このexpreので、ssionはまた、TRPV4力を感知するためにそれらが必要とされないことを示している。分子生物学的に最も影響を受けやすい真核生物では、TRPV4を持つことは、効率的な順方向または逆遺伝子操作25を可能にします。 （2）TRPV4の詳細な生物物理学的な分析のために、我々はアフリカツメガエル卵母細胞においてTRPV4を表明した。 NA（10 -10〜10 -9 A）の電流にサブ-NAをもたらす培養細胞とは異なり、卵母細胞はμAの（10 -6〜10 -4 A）の電流を表現しています。ノイズの上はるかに大きい信号がより良く定量化し、より多くの自信を持って比較することができます。 TRPV4は、そのように発現され、またパッチクランプを使用して、個々の分子として調べることができる。シングル卵母細胞は再び定量化は、より信頼性の高いことが繰り返さパッチのサンプリングを可能にします。このような研究は、TRPV4チャネル自体を直接、膜延伸力14によって活性化され得ることを示した。分析はまた、14の代表的な骨格異形成対立遺伝子がすべての機能獲得型突然変異であることが示された。さらに、DEGRこの構成のCa 2 +漏れのeeは、骨格疾患23の重大匹敵する。

ため、その新規性や有用性は、これらの2つの方法の詳細な手順は、TRPV4または類似のチャネルでの今後の研究で複製を可能にするためにここに組み立てられる。

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プロトコル

1。酵母ルミノメトリー方法

Saccharomyces cerevisiaeのひずみBYYTを使用してください。それはBY4741（MATA、ura3D0、his3D1、leu2D0、lys2D0、yvc1 :: HIS3、tok1 :: kanMX4）のyvc1-tok1-誘導体である。 Batiza ら 26とLoukin ら 24に記載されているように、 レイが選択可能なエクオリン発現プラスミドpEVP1/AeqとURA-選択可能なラットTRPV4発現プラスミドp416GPDV4で細胞を形質転換プラスミドの構築およびトランスフォーメーション27の使用標準的な方法。酵母株およびプラスミドのリクエストも承ります。

  1. 一晩1Mソルビトールを補足したLeu-URA-」DCD「ドロップアウト培地28（CMD-レイ-URA媒体29の硫酸塩が枯渇した変異体）、30℃のシェーカーにおけるポスト対数相への酵母細胞の培養2ミリリットル。 luciferi2μMの補充した新鮮な培地の1.8ミリリットルにこれらの培養液200μlを接種n個のセレンテラジン。振とうせずに、別の24時間室温で暗所に育つ。
  2. 蒸気圧浸透圧計を使用して（下）（通常1,400ミリオスモルで）文化の浸透圧を測定し、他のソリューション。
  3. 単管照度計のための12ミリメートルのルミノメーターチューブに一定分量新鮮な培養液20μlを。
  4. 低張性ショックのために、必要なショックの程度に応じて25 mMのNaEGTA液（pH 7.2）または名前（pH7.2）にし、500から100のNaCl、（1,200-400ミリオスモルの合計オスモル濃度）を含む、溶液200μlを加える。連続して前に発光を監視し、少なくとも120秒の浸透downshockた後、唯一の簡単な希釈操作によって中断。相対発光単位（RUL）などのデスクトップコンピュータ上の照度計の出力を登録します。

しないトランスジェニックTRPV4の研究のためのけれども、我々は、酵母株の多数の応答を調べるために、自動化システムにおいて上記のプロトコルの変形を使用している。研究Oマイクロプレートルミノメーターを用いて低刺激30または酵母deletome（4906酵母単一遺伝子deletantsの集まり）の高浸透圧31刺激に対する応答Fと対応するソフトウェアで解析が成功している。

2。と3。卵母細胞電気生理学方法

電気生理学は、基本的な方法32を使用しています。 PCRは、野生型または変異TRPV4は 、高忠実度PfuUtraポリメラーゼを使用しpGH19 33に統合のオープンリーディングフレームを増幅する。これは、 アフリカツメガエルの β-グロビン遺伝子およびT7 RNAポリメラーゼプロモーターの下流の5 'および3'UTRの間のORFの正確な挿入を伴う。 3 'UTRの下流及びインビトロ T7 RNAポリメラーゼ反応においてテンプレートとして使用される構築物を線状化。標準の分子生物学的技術34を使用してください。

XからステージV〜VIの卵母細胞を使用ツメガエル 。畜産、部分的ovariecto私、defolliculation、そして卵黄エンベロープ除去は、標準的な手順を32,33,35に従ってください。ドラモンドNanoinject II自動マイクロインジェクターを使用して、卵母細胞当たりのcRNA液の2-40 NGを注入する。実験の各セットのために〜30卵母細胞を注入する。 TRPV4-cRNAを注入した後、ゲンタマイシン（100μg/ ml）をしてND96培地中で卵母細胞をインキュベートし、1μMのルテニウム14レッド 。

2。二枚の電極電圧クランプ

  1. ピペットプラーで個別に精度使い捨て100μlのマイクロピペットからホウケイ酸ガラス記録ピペットを引き出します。
  2. 電圧測定の両方を引いて、現在の注入ピペット電極は、〜1μmの直径の先端の開口部を持つように引っ張られる。
  3. 2 M KClを埋め戻し電極は、0.1〜0.2mΩの抵抗を生じる。一緒VG-2Ax100仮想接地風呂クランプで、Digidata 1440デジタイザを通じてGeneClamp 500アンプインターフェイスに接続されているHS2Aのヘッドステージ、にマウント。取得する pClamp10ソフトウェアを用いてデータを記憶する。
  4. 20Xの倍率で解剖顕微鏡のステージ上に取り付け作製したプラスチックチャンバー内の1ml浴中で試験される卵母細胞を配置する。浴溶液を3MのKCl寒天橋と塩素化銀線により、仮想接地されている卵母細胞の近くに配置し、VG-2A仮想接地段に接続。
  5. ソリューション入口と出口のようなプラスチックチューブで連続灌流用チャンバーを構築します。入口管は、6の50mlシリンジの殻、異なる溶液が充填された各々のマニホールドで製造された灌流システムに接続され、接続する。いかなる特定のソリューションの重力供給速度を制御していると〜2-3配管の「ケック」ランプクランプを使用してml /分。
  6. マイクロマニピュレータ上でのヘッドステージで両方の電極をマウントします。マイクロマニピュレーションによる卵母細胞の電極の貫通を実行します。

3。直接機械的感受性のパッチクランプ試験

">ピペット製剤、GΩシールを形成し、オンセルの形成または切除されたモードを含むパッチクランプの基本的な方法は、ハミルらのものである。36及び32のConn。

  1. 98のKCl、1mMのMgCl 2、及び10 mMのK +-HEPES、pH7.2で、先端に〜1μmの直径の開口（気泡数5-6）とホウケイ酸ガラスピペットを埋める。
  2. また、圧力計に、5ミリリットルの注射器にプラスチックチューブを通過して、T-ジョイントを介してパッチクランプピペットを取り付けます。電極と圧力計の出力の両方を処理するためにコンピュータを使用しています。 10kHzでデータを取得し、その後、分析のために1 kHzで8極ベッセルフィルタを介して再生する。
  3. 異なるパッチが繰り返し同じ卵母細胞から切り出すことができる。この慣習は、TRPV4の分子活性の検査は、より効率的で信頼性の高いことができます。

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結果

典型的な発光測定実験では、400-1,200ミリオスモルダウン低張性ショックの範囲は、1400ミリオスモルでの培養液20μlに異なる低浸透圧ショック溶液を200μLを添加することによって達成される。空p416GPDV4プラスミド又はイオンフィルタ（ 図1）24における変異を有するTRPV4遺伝子を含むもので形質転換された酵母細胞：実験のRLU二つの陰性対照と比較したときTRPV4活性が明らかである。

典型的な2電極電圧クランプ実験では、卵母細胞が最初に66 KMeSO 4（単位：mm）を含む流れる等張浴溶液に浸されており、1.8 BA（のMeSO 4）2、5 K +-HEPES（pH7.2）にし、 100ソルビトール。ピーク電流は10秒ごとの-20 mVの保持電位から20 mVまで100ミリ秒の試験パルスの最後に評価される。低張応答フローを誘発するソルビトールを欠く類似の溶液に変化する。 T彼の低張応答は、ソルビトールが返されると可...

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ディスカッション

冒頭で述べたように、一般のTRPV4の機能を研究するために使用される方法は、時には矛盾し、論争となった。ここに記載された方法の二組は、いくつかの利点を提供し、既存の方法を補完することができる。我々はTRPV4でのみ研究を記載しているが、これらの方法は、他のイオンチャネルを研究するために拡張することができる。

1。酵母ルミノメトリー方法

出芽酵母は、脂質組成30に影響を与える突然変異によって増感されている低浸透ショックにネイティブのCa 2 +流入の応答を持っています。この信号は、外部のEGTAで消去することができる。このキレート剤は、Ca 2 +の浸透圧の際に細胞質に放出された小胞体のことしかし、チャネルは内膜で発現されていることを示す、異種発現TRPV4 24からの信号を消去しない可能性が最も高いショック。異種発現のトラフィックチャネルは、酵母において研究されていない。この方法は、他のTRPチャネル...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

私たちは、優れた技術支援のためのアンドレアKremsreiterに感謝したいと思います。マディソン - 私たちの研究室での作業は、NIH GM096088とウィスコンシン大学のラース·トラストによってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
蒸気圧浸透圧計WescorWescor 5500米国ユタ州ローガン
Sirius シングルチューブルミノメーター Titertek-BerholdSiriusHuntsville, LA, USA
マイクロプレートルミノメーターTitertek-BertholdMithras LB940ルイジアナ州ハンツビル 米国
ルイジアナ州ルミノメトリーソフトウェアTitertek-BertholdMikroWin2000米国ルイジアナ州ハンツビル
パッチクランプおよびソフトウェアAxon InstrumentHS2A ヘッドステージ、VG-2Ax100 バーチャル接地バスクランプ、GeneClamp 500 アンプ、digidata 1440 デジタイザー、 pClamp10 ソフトウェアUnion City, CA, USA
ManometerBio-TecWinooski, VT, USA
ピペットプーラーSutter Instrument CoModel P-97Novata, CA, USA
MicroinjectorDrummond ScientificNanoinject IIBroomall, PA, USA
Luciferin coelenterazineInvitrogenCarlsbad, CA,
USA T7 RNA ポリメラーゼ反応AmbionmMessage mMachineオースティン、テキサス州、米国
GentamicinSigma 
ルテニウムレッド シグマ 
マイクロピペット Drummond100 microliter micropipetsBroomall, PA, USA
High-fidelity PfuUtra polymerase StratageneLa Jolla, CA, USA (米国カリフォルニア州)

参考文献

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