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方法論記事

インビトロ 病原体誘導性好中球トランス上皮移動を評価するコーカルチャーアッセイ

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DOI:

10.3791/50823

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2014年1月6日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology, MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

この記事について

サマリー

粘膜細菌感染に応答して好中球トランス上皮移動は、上皮損傷および臨床疾患に寄与する。この現象を調整する分子機構の解明に向けた研究を容易にするために、トランスウェルフィルター上で成長した病原体、ヒト好中球、偏光ヒト上皮細胞層を組み合わせた in vitro モデルが開発されました。

要約

粘膜表面は、病原性生物に対する保護障壁として機能します。自然免疫応答は、主に好中球の炎症性細胞を移行させる組織の浸潤につながる病原体を感知すると活性化される。このプロセスは、過剰な場合や未解決の状態で保持されている場合、組織に破壊的になる可能性があります。 培養イン ビトロ モデルは、病原体誘導性好中球トランス上皮移動に関与する独自の分子機構を研究するために利用することができる。このタイプのモデルは、実験設計において、病原体、上皮バリア、または好中球の制御された操作の機会を持つ汎用性を提供します。透過性トランスウェルフィルター上で成長した偏光上皮単層の有端表面の病原性感染は、バソラテラル表面に適用される好中球の有端な経上皮移動に生理学的に関連するバソラターレを扇動する。本明細書に記載の in vitro モデルは、病原性 P.緑素吸 虫(PAO1)に感染した偏光肺上皮単層を横切って好中球の移動を実証するために必要な複数のステップを示す。ヒト由来肺上皮細胞による透過性トランスウェルの播種および培養は、全ヒト血液からの好中球の単離およびPAO1および非病原性K12 大腸菌 (MC1000)の培養と共に記載されている。 病原性感染に応答して動員された好中球の移行過程および定量分析は、陽性および陰性対照を含む代表的なデータで示されている。この インビトロ モデルシステムは、他の粘膜表面に操作し、適用することができます。過剰好中球浸潤を伴う炎症反応は、宿主組織に破壊的であり、病原性感染がない場合に起こり得る。本明細書に記載の インビトロ 共培養アッセイシステムの実験的操作を通じて好中球トランス上皮移動を促進する分子機構をよりよく理解することは、炎症性疾患と同様に感染性の様々な粘膜の範囲に対する新しい治療標的を同定する重要な可能性を有する。

概要

粘膜表面は、環境1,2に広がった外部の脅威に対する保護を提供する物理的および免疫学的障壁として機能する。この保護上皮障壁は、病原性生物が2に侵入すると損なわれる可能性がある。細菌病原体の場合、この遭遇はしばしば自然免疫系を活性化し、好中球2-4として知られている最初の応答者顆粒球の急速な動員を引き起こすことによって炎症過程を誘発する。好中球の採用を促進する化学戦術剤は、問題の病原体2-4の宿主を取り除こうとする粘膜上皮細胞によって部分的に産生される。粘膜上皮表面の過剰または未解決の好中球浸潤は、重大な病理1,5を引き起こす可能性がある。これは、抗細菌性好中球兵器5-7によって引き起こされる非特異的組織損傷の結果である。このような場合、好中球の細菌クリアランス能力は、感染性の侮辱の間に宿主組織の破壊によって影を落とす。 保護上皮バリア機能の破壊は、微生物および/または毒素への基礎組織の暴露の増強をもたらし、病態8,9をさらに悪化させる。これらの結果は、肺および消化管1,5を含む多臓器系で観察することができる。さらに、喘息の重篤な発作、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、および炎症性腸疾患(IBD)などの非感染性炎症性疾患は、過剰好中球応答4,5,10-12による粘膜上皮バリアの病理学的違反によって特徴付けられます。

粘膜感染後の好中球の採用の複雑なプロセスは、いくつかの区画化ステップ1,5,13,14を伴う。第一に、好中球は、経内皮移動を促進する一連の細胞間相互作用を介して循環から逸脱しなければならない1,13。好中球は次に細胞外マトリックス1,14を含む既存の間質空間をナビゲートする。感染した粘膜の内腔に到達するには、好中球は上皮バリア1,4,5を越えて移動しなければならない。この複雑な多段階現象は、多くの場合、生体 内 感染の動物モデル15を用いて集合的に調査される。このようなモデルは、ケモカイン、接着分子、または全体的なプロセスに関与するシグナル伝達経路などの特定の因子の必要性を確立するのに有用であるが、各区分化ステップ16に対して重要な分子寄与を解決するのには大きく不十分である。好中球のトランス内皮、トランスマトリックス、またはトランス上皮移動をモデル化したイン ビトロ 系の共培養は、この点1,14、16、17において特に有用であった。

病原性感染に応答して好中球トランス上皮移動を担う機構を解読することを目的とした強固な共培養アッセイシステムが開発された。このモデルは、分極化したヒト上皮細胞層の有端表面を細菌病原体に感染させ、続いて新たに単離されたヒト好中球をバソラショナル表面18〜22に適用することを含む。好中球は、病原性感染後に分泌される上皮由来の化学戦術産物に応答して上皮バリアを越えて移動する18,21-23.このモデルシステムは、適切な組織特異的細菌病原体に曝露された腸及び肺上皮培養物を用いて採用されており、粘膜感染時の好中球の採用過程において重要である可能性が高い新しい分子機構を明らかにした3,8,19,24-28。この in vitro の共培養モデルの強みは、還元的アプローチにより、研究者が十分に制御され、高度に再現性の高い、かなり安価なシステムで病原体、上皮バリア、および/または好中球を実験的に操作することを可能にすることです。このアプローチから収集された洞察は、 生体内 感染モデル22,29,30を用いた好中球募集中の区分化事象の集中分析を効果的に行うために活用することができる。

本稿では、病原体誘導性好中球越上皮移動を探求するために、この再現可能なモデルを確立するために必要な複数のステップを示す。病原体 シュードモナス・エルギノーザ に感染した肺上皮障壁はこの記事で紹介されています。しかし、他の組織上皮および病原体は、軽微な修飾で置換することができる。逆コラーゲン被覆透過性トランスウェルフィルター上の偏光性肺上皮細胞層の播種および培養は、病原性 P.緑素吸除の 成長および全血からの好中球の単離と同様に、本明細書で詳述される。これらの成分を組み合わせて病原体誘導性好中球トランス上皮移動を観察する方法は、適切な陽性および陰性制御と共に提示され、再現可能なアッセイを確立する。このアプローチの多様性は、病原体誘導性好中球トランス上皮移動の様々な側面を調べるための、文献における特定の研究を参照して議論される。

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プロトコル

ステップ(1-3)は、層流フードの下で滅菌環境で行われるべきである。

1. コラーゲンコーティングトランスウェル

  1. 30 μg/ml のコラーゲン溶液を作ります。0.2 μmフィルター単位を通過した60%エタノールで3mg/mlコラーゲンストック1:100を希釈します。
  2. ボルテックス希釈30 μg/ml溶液。注:この溶液は非常に粘性であり、気泡が導入され、ピペット時の精度が低下する可能性があるため、3mg / mlコラーゲンストック溶液をボルテックスする必要はありません。
  3. 外側の包装から3μmの細孔サイズの0.33 cm2 成長領域トランスウェルを取り除き、12個のトランスウェルを含む24ウェルプレートをフードの内側に逆さまに置きます。
  4. 底板を持ち上げて脇に置きます。注:トランスウェルズは24ウェルプレートの蓋の上に逆さまに休むようになりました
  5. ブンゼンバーナーをオンにします。無菌のための炎の止まり金と冷ましましょう。
  6. 無菌止止めで、トランスウェルを150 mm x 25 mmのペトリ皿に移し、反転した位置に保ちます。注:上皮細胞で播種された後、トランスウェルを収容するために使用される空の24ウェルプレートと蓋の無菌性を維持してください。
  7. 30μg/mlコラーゲン溶液のピペット70μlを、各反転トランスウェルのフィルター膜上に取り付けます。注: 下側のサーフェスにアクセスする際に、フィルター膜の周囲に壁が存在しなくなっていますので、表面張力はこの量のソリューションを維持する必要があります。コラーゲン溶液がトランスウェルの側面に滴り落ちないようにし、コーティング手順中にトランスウェルを動かさないように注意してください。
  8. ペトリ皿の蓋を最低4時間はずし、エタノール溶液を蒸発させます。このプロセスの間に無菌性を維持するためにフードファンと紫外線をオンに保ちます。
  9. トランスウェルが乾燥した後、ペトリ皿カバーが所定の位置にあり、無菌性が維持されていれば、すぐに使用するか、室温で最大1週間保存することができます。

2. トランスウェルを播種するための上皮細胞のパッセージフラスコ

(このプロトコルは、トランスウェル上で成長した上皮バリアの生成のための肺上皮細胞株H292の取り扱いについて具体的に説明する。他の上皮細胞株は、わずかな変更で使用することができます。

  1. 10%の熱不活性化胎児胎児血清(HI-FBS)と1xペニシリン/ストレプトマイシンをRPMI 1640に加えて培地を調製した。
  2. 37 ºC水浴での温かい媒体、トリプシンEDTA(T-EDTA)およびD-PBS。
  3. インキュベーターから細胞を含むT-75フラスコを取り除き、逆顕微鏡で合流を視覚的に評価します。注: H292 細胞を使用する場合、フラスコは、近いまたは完全にコンフルにする必要があります。
  4. フラスコから吸引媒体。キャップを緩めたボンネットで次の溶液を持つことによって細胞が乾燥している時間の長さを減らす。
  5. T-75フラスコに5mlのD-PBSを加え、旋回します。バブルを作成しないでください。吸引によってPBSを除去する。
  6. T-75フラスコに3mlのT-EDTAを加え、底を覆うために渦巻きます。
  7. T-EDTAの大部分を取り除き、T-75フラスコに約0.3mlを残します。
  8. T-EDTAの小さな残りの体積を細胞の表面積に分配し、標準的な培養条件下で加湿インキュベーターに入れる(37ºC、5%CO2)。
  9. 一定期間後、インキュベーターからフラスコを取り出します。注:細胞は、フラスコの側面を軽くタップすることによって、フラスコの表面から容易に取り外す必要があります。顕微鏡下で視覚化すると、セルは丸め、浮かび上がっていいはずです。H292細胞の平均時間は5-10分です。
  10. 10 mlの培養培地を添加して、T-EDTAを中和し、細胞を再懸濁させます。細胞溶液をピペットチップに引き上げ、細胞を含むフラスコの表面に約5回排出し、全ての細胞を再懸濁する。
  11. トランスウェルを播種するための15mlチューブに再懸濁細胞を移す。注:この方法で調製された再懸濁されたH292細胞の濃度は、約1 x 106-1.8 x 106 細胞/mlの範囲でなければなりません。

3. 上皮細胞でコラーゲンコーティングトランスウェルを播種

  1. 15 mlチューブから各反転したコラーゲンコーティングトランスウェルに再懸濁細胞溶液70 μlを加えます。注:1 x 106-1.8 x 106 細胞/mlの濃度範囲を有するH292細胞溶液は、約70,000-120,000細胞/トランスウェルをもたらす。
  2. 細胞懸濁液を定期的にゆっくりと反転して混合し、トランスウェルを播種しながら細胞が15mlチューブの底に落ち着かないようにします。注意:渦細胞を使用せず、ピペットチップがコラーゲンコーティングされた膜フィルターに直接接触しないように注意してください。
  3. すべての反転トランスウェルが上皮細胞で播種されたら、ペトリ皿カバーを交換し、慎重に組織培養インキュベーターに配置し、加湿、37ºC、5%CO2。コラーゲン被覆フィルター膜に添加された細胞懸濁液を乱さないように注意してください。
  4. 組織培養インキュベーターで逆変性トランスウェルを維持し、加湿、37ºC、5%CO2を一晩維持する。注:細胞を含む液体の泡は、一晩のインキュベーション全体にわたってトランスウェルの透過性フィルター膜に関連付けられたままであるべきです。液体の蒸発や、液体がトランスウェルの側面に滴り落ちるためにフィルター膜が乾燥した場合、上皮層が正常に成長しないことがあります。
  5. 翌日、元の滅菌24ウェルプレートに1mlの培地を加え、滅菌ヘモスタットを使用して各反転トランスウェルを1mlの培地を含む各ウェルに反転させます。
  6. 各トランスウェルの上部チャンバーに0.2 mlの培地を加え、組織培養インキュベーターに戻り、加湿   、37ºC、5%CO2.
  7. H292反転トランスウェルは、播種後8日から1ヶ月まで使用できます。注: 上皮単層が完全に形成され、機能的な障壁を示すことを確実にするために、トランスウェルの播種後最低8日間待つことをお勧めします。1つは、バソラターレ表面18に添加した後に、単層がタンパク質馬根ペルオキシダーゼ(HRP)のトランス上皮フラックス(HRP)を制限することができるかどうかを判定することによってH292上皮障壁を試験することができる。

トランスウェル上の上皮層の感染に対する細菌の調製

  1. 実験の1日前に、シュードモナス分離寒天プレートから P.緑膿菌 PAO1のコロニー1コロニーを抽出し、ルリア・ベルタニ(LB)寒天プレートからK12 大腸菌 MC1000のコロニーを1コロニーに抽出し、3mlのLBスープを含む別々のチューブに入れる。注意 :P.エルギノーザ はヒト病原体であり、この生物を取り扱う際には標準的なBSL2安全対策を採用する必要があります。
  2. 37 ºC環境で225 rpmで一晩振ります。
  3. 翌日、密な細菌培養物から1mlを取り出し、1.5mlのエペンドルフチューブに入れる。
  4. マイクロフュージで15,800 x gで5分間スピンし、上清を取り除く。
  5. ハンクスのバランス塩溶液をカルシウムとマグネシウム(HBSS+)で事前に準備してください。9.5 L蒸留水に23.8 g HEPESと97.5 gのHBSS+粉末を加えます。7.4の安定したpHに達するまでpHを監視しながら、溶液に10 M NaOHの少量を追加します。10 Lまでボリュームを持ち、4 ºCで保管してください。
  6. 各細菌ペレットを1 ml HBSS+で再懸濁します。ボルテックスは、均一な細菌懸濁液が達成されることを確認する。
  7. 15,800 x g で再び 5 分間回転し、上清を取り除きます。
  8. 0.6 ml HBSS+ と 0.5 ml HBSS+ の MC1000 ペレットで PAO1 ペレットを再中断します。細菌の懸濁液をボルテックス。
  9. さらに、PAO1およびMC1000をHBSS+で1:100の再懸濁されたペレットを希釈する。例えば、0.6 ml PAO1 再懸濁ペレットを 5 ml HBSS+に 50 μl 加えます。注: 光学密度(OD)測定を用いて、培養密度と標準的なコロニー形成ユニット(CFU)希釈めっき方法を決定し、この方法で調製されたPAO1およびMC1000ソリューションは、3 x 107-6x 107 CFU/mlの間で一貫して収量を得る。細菌培養の密度は、600 nmで培養物のOD測定と正の相関を持ち、この相関を使用して細菌細胞濃度を推定することができる。細菌細胞濃度を確認するために、培養物を非常に低い推定濃度に希釈し、プレート上に30〜200個の細菌細胞が存在することを期待するような寒天プレートにメッキすることができます。細胞はプレート全体に広がり、各細胞が目に見えるほどの大きさの細胞の個々のコロニーを形成し、その後コロニーを数えることができるように、37 ºCで一晩インキュベートされる。

5. 全血からの好中球の分離

  1. 酸クエン酸デキストロース溶液(ACD)は、抗凝固剤として使用され、6.9gのクエン酸、12.5gクエン酸ナトリウム、および10gのデキストロースを500ml蒸留水に添加して調製した。すべてのコンポーネントが溶解すると、ACD溶液は0.2 μmのフィルター単位を通過することによって滅菌されます。4 ºCでACDソリューションを保存します。
  2. 血液を引く前に、5mlのACDを50mlのシリンジに加え、チューブに12で21 x 3/4 Gの蝶の針を取り付けます。
  3. 止血帯を塗り、アルコールで静脈を拭き、針を挿入します。注: ヒトの被験者を含む研究議定書は、機関審査委員会によって承認され、書面によるインフォームド・コンセントは、各献血者から提供されなければならない。例えば、このプロトコルを使用して行われた実験は、マサチューセッツ総合病院機関審査委員会によって承認され、プロトコル#1999-P-007782を割り当てられた。
  4. ゆっくりと45mlの血液を引き出し、血液が注射器に一度ACDと混ざっていることを確認する。
  5. 45mlが引き出されたら(総体積50ml)、針を取り外す前に止血帯を解きます。針を取り除くとすぐに滅菌ガーゼで傷口に圧力をかける。
  6. 約5〜10秒間に50mlチューブの側面をゆっくりと血液を移す。
  7. 1,000 x gで遠心分離機でスピンし、ブレーキは室温で20分間非アクティブ化します。注:PBS中の全血の希釈を含む追加のステップ-および遠心分離前にフィコル・パクに希釈された血液の慎重なオーバーレイは、顆粒球8からより効率的にバフィーコートを分離することによって好中球純度のわずかに高いレベルを達成するために採用することができる。このステップを省略すると、このアッセイの目的で収率や純度に大きな影響を与えることなく時間を節約するのに役立ち、したがって、私たちはフィコル・パクのステップに血液オーバーレイを含まないことを好みます。
  8. 血液が回転している間、非常にゆっくりと50ミリリットルの加熱ハンクスのバランス塩溶液に1gゼラチンを加え、カルシウムとマグネシウム(HBSS(-))を使用せずに2%のゼラチン溶液を調製します。ソリューションを 37 ºC に保ちます。
  9. Sigmacoteで処理されたガラスピペットチップを使用して、血液の50 mlチューブから血漿を吸引し、廃棄します。
  10. リンパ球を含む白血球を含むバフィーコートを除去するために非常に慎重に吸引を続ける。
  11. バフィーコートがゆっくりと除去されると、赤血球(RBC)層の上の白っぽい黄色の曇りの材料は消えます。バフィーコートを取り除き、RBC層をチューブの上から見たときに明確に視覚化できる一度吸引を停止します。
  12. 顆粒球、主に好中球としてRBC層を乱さないようにしてくださいが、RBC層の表面の近くにありますが、目に見えません。
  13. 15 ml の RBC 層の体積に、30 ml の温かい 2% ゼラチン溶液 (RBC 層の 2 倍の体積) を加えます。
  14. 気泡の形成を最小限に抑えるために注意して、混合するチューブを反転します。
  15.  37 ºCで25分間インキュベートする 注:RBCsは集約し、底に落ち着く必要があります。ゼラチンの代替として、大きな分子量デックストランスは、沈下RBCs8に採用することができる。
  16. インキュベーション後、顆粒球を含む最上層の軽い赤みを帯びた溶液をピペット付きの新しい50mlチューブに移し、移管中に沈着した暗いRBC層を乱さないことに注意する。分離したら、暗い RBC 層を破棄します。
  17. スピンは、ペレット細胞に対して室温で10分間ブレーキを作動させた1,000 x gの遠心分離機に顆粒球といくつかのRBCを含む軽赤色溶液を移した。
  18. 遠心分離後に形成される赤みを帯びた細胞ペレットが一般的に緩んでいるように、上清を慎重に注ぎ出すか、吸引する。
  19. RBC溶解バッファーを事前に調製し、8.29 g 塩化アンモニウム (NH4Cl) 1 g 重炭酸ナトリウム (NaHCO3) 、0.038 g EDTA から 1 L 蒸留水をビーカーに加えて 4 ºC で保管します。RBCのリシスバッファーを4 ºCに保存します。
  20. 冷たいRBCのライシスバッファーの少量で赤みを帯びた細胞ペレットを再中断し、分解します。細胞ペレットが溶液に入ったら、RBC溶解バッファーでチューブを50mlに充填します。注: この時点で、今後は、セルを氷上または 4 ºC に保ちます。
  21. 4 ºCで10分間300 x gで遠心分離機でスピン   し、上清を注いだり吸引したりします。注: 上清は、Lysed RBC を含むやや赤みを帯びた赤みを帯びる。ペレットは、この時点で黄色がかった白でなければなりません。赤みを帯びたペレットで示されるように有意なRBCがペレットに残っている場合、ステップ5.20-5.21を繰り返すことができる。ステップ5.20からの赤みを帯びたペレットが十分に分解されない場合、有意なRBCは細胞ペレットに残る。
  22. HBSS(-)の少量で白っぽいペレットを再中断して分解し、その後HBSS(-)でチューブを50 mlに充填します。注: HBSS(-)ではなくHBSS+は、白っぽい細胞ペレットを再中断するために使用する必要があります。HBSS(-)はカルシウムとマグネシウムを欠いている。
  23. 4 ºCで10分間300 x gで遠心分離機で再び回転   します。
  24. 上清を注ぎ、ペレットを1ml HBSS(-)の最終容積に再中断します。
  25. 1 ml セル懸濁液の 5 μl を 1.5 ml のエッペンドルフチューブに 250 μl HBSS(-) を加え、ピペットで上下に軽く混ぜます。
  26. 25 μl希釈セル懸濁液を25 μl 0.4%トリパンブルーに加えます。
  27. 標準のヘモサイトメーターの各側に12 μlの混合物を加えます。
  28. トリパンブルー染料を除外し、ヘモサイトメーターの両側の真ん中の正方形に存在している生きている細胞の数を数えます。
  29. 細胞の濃度を計算するには、2つの正方形の平均に100(希釈因子)を掛け、104 を掛けて細胞/mlの数を求めます。
  30. 5 x 107 細胞/mlに最終濃度を調整します。5 x 107 セル/mlより大きい場合は、HBSS(-)を追加して調整します。少ない場合は、細胞をペレットし、適切な体積に再懸濁する。
  31. 移行アッセイの準備ができるまで、細胞を氷の上に置いてください。注:これらの細胞は、白血球の顆粒球集団を表す。ヒトの血液から分離された顆粒球の大部分は好中球である。細胞は静止状態に維持するために、移行アッセイに加わるまでHBSS(-)に懸濁した氷の上に保持されます。

6. 移行アッセイのための上皮細胞層の調製

(これらのステップは、無菌フード内で実行する必要はありません。

  1. 少なくとも8日間トランスウェルフィルター膜の下側で培養された上皮層を支持するインキュベーター24ウェルプレートから除去する。
  2. 各トランスウェルの端を止血で持ち上げ、24ウェルプレートから持ち上げ、廃棄物バケツの上にトランスウェルを反転させ、トランスウェルの内側のチャンバーから培養培地を廃棄します。各トランスウェルをHBSS+を含む洗浄ビーカーに浸して、トランスウェルの内部チャンバーをHBSS+で満たします。内部チャンバーから廃バケツに液体を捨てます。
  3. HBSS+で2回目の洗浄を行う場合は、ステップ6.2を繰り返します。2回の打ち上げた後、各ウェルに1ml HBSS+を含む新しい24ウェルプレートにトランスウェルを入れる。注: すべてのワッシュは、37 ºCに加えられるHBSS+ で実行する必要があります。
  4. 各トランスウェルの上部チャンバーを観察して、上皮細胞層の完全性を評価する。注:HBSS+は、1mlのHBSS+を含む24ウェルプレートのウェルに入れたときに、トランスウェルの上部チャンバーに漏れて満たすべきではありません。
  5. 各トランスウェルを注意深く観察した後、0.2 mlのHBSS+を上部チャンバーに加えます。
  6. 37 ºCでインキュベーターに入れ   、5%のCO2 を加湿したチャンバーに30〜60分間入れ、上皮細胞層を平衡化する。

7. 好中球トランス上皮移行アッセイ

  1. HBSS+で平衡洗浄されたトランスウェルのインキュベーター24ウェルプレートから取り出します。
  2. 各トランスウェルを止血でつかみ、上の液体を廃棄物バケツに捨てます。
  3. 各トランスウェルを150 mm x 25 mmのペトリ皿に逆さまに置きます。
  4. 反転したトランスウェルズの6個に、HBSS+を25 μl加えます。3つの反転トランスウェルに、ステップ4で説明したように調製したHBSS+で希釈した25μl P.緑分(PAO1)に感染する。最後の3つの反転トランスウェルに、ステップ4で説明したように調製したHBSS+で希釈した25μl大腸菌K12(MC1000)に感染する。ステップ4で調製された細菌溶液の濃度は約3 x 107-6x 107 CFU/mlであるため、これは約0.8 x 10 6 -1.5 x 106 CFUs/上皮層です。
  5. 加   湿チャンバ内で37ºC、5%CO2で60分間インキュベートします。
  6. 5 ml HBSS+ に 5 ml HBSS+ に 5 μl の 10 mM fMLP ストックを加えて、好中球移動のための正のコントロールとして fMLP を準備して、10 μM のソリューションを提供します。
  7. 止血でつかみ、底の部屋に1 ml HBSS+を含む24ウェルの洗浄板にひっくり返すことによってトランスウェルを洗う。上部のチャンバーにHBSS+の0.2 mlを追加します。
  8. 止血でトランスウェルをつかみ、最初の洗浄板から取り出します。トランスウェルを1ml HBSS+を含む2つ目の24ウェル洗浄プレートに入れる前に、上の部屋から廃バケツに液体を捨てます。上部のチャンバーに0.2 mlのHBSS+を加えます。
  9. 合計 3 回の操作で、手順 7.8 をもう 1 回繰り返します。注:すべてのトランスウェルは、それらが細菌に感染しているかどうかにかかわらず、同じ取り扱いと洗浄レジメンを受けるべきであり、アッセイされているすべてのトランスウェルが同じ方法で操作されていることを確認する必要があります。PAO1またはMC1000のいずれによる60分の感染は、乳酸脱水素酵素ベースの毒物学アッセイおよびHRPフラックスアッセイによって評価されるH292単層のバリア特性をそれぞれ18,22に低下させたり、変化させたりしない。
  10. 24ウェルプレートの12ウェルに1ml HBSS+を加えて、24ウェル移行プレートを準備します。注:このプレートは事前に用意しておくことができます。
  11. 3回目の洗浄の後、上部のチャンバーから羊皮紙を止血剤を使用して廃棄物バケツに液体を捨て、感染していない3つのトランスウェルを1ml HBSS+を含む24ウェル移行プレートの3つの井戸に入れ、負のコントロールを表します。
  12. 1 ml HBSS+ (100 nM) を含む 24 ウェル移行プレートの 3 つのウェルのそれぞれに fMLP の 10 μM 溶液のピペット 10 μl。
  13. 感染していないトランスウェルのうち3つを100 nM fMLPを含む24ウェル移行プレートの3つのウェルに入れ、これは単離された好中球の移行能力に対する肯定的な対照を表す。
  14. PAO1に感染した3つのトランスウェルとMC1000に感染した3つのトランスウェルを、それぞれ1ml HBSS+を含む24ウェル移行プレートの3つのウェルに入れる。すべてのトランスウェルの上部チャンバーにHBSS+の0.1 mlを追加します。
  15. 各トランスウェルの0.1 ml HBSS+の上に、ステップ5で説明したように調製した好中球懸濁液(5 x 107 細胞/ml)を20μl慎重に加えます。注:これは約1 x 106 好中球/トランスウェルを表します。
  16. 37 ºCでインキュベートし、加湿チャンバーに5%CO2を2時間培養し、好中球のトランス上皮移動を可能にする。
  17. 2時間後に移行した好中球の数を決定するための標準曲線を準備します。好中球懸濁液40μl(5 x 107 セル/ml)を2mlのHBSS(+)に加え、1mlHBSS(+)に1mlを移し、シリアル2倍希釈を8回実行し、約2,000セル/mlから1x106 セル/mlの範囲の合計10の標準を実行します。ブランクの場合は 1 ml の HBSS(+) を含めます。
  18. 2時間の移動の後、止血でつかんでトランスウェルを持ち上げ、24ウェル移行プレートの内側の壁にそっとタップします。トランスウェルを破棄します。
  19. 10Xの目的を使用して、24ウェル移動プレートのウェルを反転顕微鏡で見ることによって、ウェル内の好中球の移動を大きく評価します(各条件で移動した好中球の画像については 図1 を参照)。
  20. 24ウェル移行プレート、各標準、ブランクで使用される各ウェルに、10%トリトンX-100の50 μlを加えます。
  21. 24ウェル移動プレート、標準、およびブランクを低速で4 ºCで20分間回転   させます。
  22. 1 M クエン酸バッファーを事前に準備します。52.5gのクエン酸と73.5gのクエン酸ナトリウムを400mlの蒸留水に加えます。pHを4.2に持って行く。500 ml の最終的な解決のための蒸留水を加える。4 ºCでソリューションを保存します。
  23. その日新鮮なABTS基板ソリューションを準備します。3つのABTS錠剤(それぞれ10mg)と1Mクエン酸塩バッファー5mlを45ml蒸留水に加えます。錠剤が完全に溶液に溶解することを許可します。ABTS基質溶液が必要になるまで、過酸化水素30%の50μlの添加を差し控えます(ステップ7.27参照)。
  24. 24ウェル移行プレート、各標準、ブランクで使用される各ウェルにクエン酸バッファーを50 μl追加します。
  25. 各サンプルウェルの100 μlを96ウェルプレートに複製して転送します。注:96ウェルプレートに移動する前に、各サンプルの内容物を十分に混合することが非常に重要です。転送前に溶液を少なくとも5回上下にピペットします。
  26. 混合後、各規格100μl、ブランクを96ウェルプレートに移します(重複してブランク)。
  27. ABTS溶液と渦液に過酸化水素30%50μlを加えます。
  28. 96ウェルプレートの各サンプルに100 μlのABTS基板溶液を追加します。
  29. プレートが暗闇の中で5〜10分間発達するようにします。注:緑色は、各ウェルに存在する好中球の数と相関して、特定のウェルで発達する必要があります。
  30. マイクロプレートリーダーを使用して、波長405 nmで読み取ります。
  31. 標準として調製された既知の好中球数と405nmの光学密度で測定したペルオキシダーゼ活性の量との間に線形正の相関が存在するという基準を用いて、上皮層を移動した好中球の数を計算する(代表的なデータについては 図2 および3 を参照)。注:好中球定量のこの方法は、骨髄ペルオキシダーゼ発現に起因する好中球によって示される多量のペルオキシダーゼ活性を利用する。好中球を定量する別のアプローチは、放射能または蛍光化合物を用いた好中球の事前標識を伴う方法など、考慮され得る。

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結果

いくつかの研究は、病原体感染上皮層が好中球トランス上皮移動を促進することを実証している3,8,19,24-28,31,32.これは、上皮細胞由来好中球化学修飾勾配3,23の病原体特異的誘導を介して起こる。例えば、肺上皮細胞の有端表面と相互作用する病原性 P.緑素球 は、上皮層18,22,25,26,33,34に渡ってかなりの数の好中球を移動させる。この臨床的に関連するアッセイシステムは、適切なコントロールと組み合わせると、主要な病原体および宿主分子寄与者を明らかにするために、さまざまな方法で操作することができる。

感染していない偏光上皮細胞層に添加された好中球は、かなりの数で移動できない。しかし、感染していない上皮層全体に化学誘引勾配を適用すると、かなりの数の好中球が広がる。感染した上皮層を越えて好中球の移動を調査する際には、各アッセイ内にこれらの陰性対照と陽性対照の両方をそれぞれ含めることが重要である。陰性対照は、シグナルが存在しない場合に上皮層を横切る好中球の背景数を確立する。この数は、培養上皮...

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ディスカッション

粘膜上皮表面を越えて好中球の移動は、細菌病原体3に感染した後の疾患病理における共通の特徴である。本明細書に記載された方法論は、細菌感染によって引き起こされる炎症過程の特徴をモデル化するヒト細胞由来 のインビトロ 共培養アッセイシステムを用いて、この離散事象を実験的に分離するための迅速で簡単なアプローチを提供する。このシステムは、もともと サルモネラ・チフィムリウム、 シゲラ・フレックスネリ、および様々な病原性 大腸菌8,19,24,27,28を含む腸内病原体に感染した分極化した腸上皮細胞を用いて開発された。これらの病原性生物のそれぞれは、逆コラーゲンコーティングされた透過性トランスウェルフィルター上で成長した偏光腸上皮単層を横切って好中球を駆動することができる。本実験系は、肺上皮障壁および病原体誘導性好中球トランス上皮遊走18,26を探索するための改変を用いて適応されている。H292以外のいくつかの気道上皮細胞株は、一般的に引用されたA549、BEAS-2B、およびカル3肺上皮細胞株22,2...

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開示事項

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、NIH(1 R01 AI095338-01A1)によって財政的にサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
NCl-H292 細胞ATCCCRL-1848
RPMI-1640 培地ATCC30-2001<
em>Pseudomonas aeruginosa PAO1ATCC#47085
Escherichia coli MC1000ATCC#39531
D-PBS (1x) 液体Invitrogen14190-144(カルシウムおよびマグネシウムなし)
熱不活化ウシ胎児血清Invitrogen10082-14710% 培地に添加
ペニシリン-ストレプトマイシンInvitrogen15140-122100x: 10,000 ユニットのペニシリンと 10,000 μ;g/mlあたりのストレプトマイシン。
トリプシン-EDTA (0.05%)Invitrogen25300-06250 ml アリコートは、-20°Cで冷凍保存されています。使用中のアリコートは4ºに保存できます。C短期.  
ハンクの平衡塩溶液 - HBSS(-)Invitrogen14175-079無菌、カルシウムおよびマグネシウムを含まない
トリパンブルー溶液Invitrogen15250-061.株式 = 0.4%
コラーゲン、ラットテールInvitrogenA10483-01標準プロトコルを使用して、ラットの尾から直接実験室で単離することもできます
クエン酸Sigma-AldrichC1909-500G1 Mクエン酸緩衝液および酸性クエン酸デキストロース(ACD)溶液
クエン酸ナトリウムSigma-AldrichS4641-500G1 Mクエン酸緩衝液の成分
無水デキストロースSigma-AldrichD8066-250G酸性クエン酸デキストロース(ACD)溶液の成分
塩化アンモニウムSigma-Aldrich213330-500G赤血球(RBC)溶解緩衝液の成分
重炭酸ナトリウムSigma-AldrichS6014-500G赤血球(RBC)溶解緩衝液
EDTAの成分 Sigma-AldrichED-100G赤血球(RBC)溶解緩衝液の成分
HBSS(+)粉末Sigma-AldrichH1387-10LHBSS+
HEPESSigma-AldrichH3375-500GHBSS+
SigmacoteSigma-AldrichSL2-25MLベンダーの指示に従ってガラスピペットチップをコーティング
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩 (ABTS)Sigma-AldrichA9941-50TABABTS基板溶液の主要成分
30% 過酸化水素溶液Sigma-AldrichH1009-100MLABTS基板溶液の成分
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLPまたはfMLF)Sigma-AldrichF-3506DMSO中の10 mMのストック溶液を調製し、アリコートを-20°Cで保存する必要があります。
ゼラチンB型フィッシャーサイエンティフィックM-12026
シュードモナス分離寒天 フィッシャーサイエンティフィックDF0927-17-1メーカーをフォローPIAプレート
Ficoll-Paque PLUSの作り方 フィッシャーサイエンティフィック45-001-749オプション、好中球の純度を向上させることができます
24ウェルマイグレーションプレートコーニングインコーポレイテッド#3524
24ウェルウォッシュプレートファルコン35-114770%エタノールに浸し、再利用する前に徹底的に洗浄すれば再利用できます
96ウェルプレートフィッシャーサイエンティフィ#12565501
トランズウェル透過性サポート コーニングインコーポレイテッド#3415ポリカーボネート;直径:6.5 mm;成長面積:0.33 cm < sup > 2< / sup>;ディッシュスタイル:24ウェルプレート。細孔径:3.0&マイクロ;m
ペトリ皿Falcon35-1013各ペトリ皿には、0.33 cm2 トランズウェルが24個入っています。  
500ミリリットル0.2μ;mフィルター/フラスコフィッシャーサイエンティフィック09-740-25A酸クエン酸デキストロース(ACD)溶液
5-3/4フィッシャーサイエンティフィック13-678-20A使用前にシグマコートでチップをコーティング
ヘモスタットフィッシャーサイエンティフィック13-812-14湾曲した鋸歯状の
インボトスコップ倒立顕微鏡ツァイス#342222
バーサマックスマイクロプレートリーダーMolecular Devices#432789
の主要コンポーネント のコンポーネント ック ガラスパスツールピペットでを滅菌するには

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