ここでは、詳細な組織チョッパーを用いて下顎骨のスライスにおける培養歯胚へのメソッド。この方法は、より伝統的な培養法を用いて、利用できない、操作および系統の追跡のための素晴らしい機会を提供し、開発中に歯に固有のアクセスを許可します。
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この記事について
サマリー
要約
外植片培養物は、特定の時点で現像器官の操作を可能にし、従って、発生生物学者のための重要な方法である。多くの器官のために、ex vivoで培養中に監視できるように、発達中の組織にアクセスすることは困難である。形態形成運動に従うことができ、特定の細胞集団が、系統操作またはトレースの対象とすることができるようにスライス培養法は、組織へのアクセスを可能にする。
本論文では、種の範囲の歯胚の培養に非常に成功しているスライス培養する方法を説明します。この方法は、他の顎の組織に囲まれた、生体内で観察されたものと同様の速度にて開発歯胚への優れたアクセスを提供します。これは、歯と周囲組織との間の組織の相互作用を監視することを可能にする。本論文では、歯胚に集中していますが、同じプロトコルは数値の発展をたどるために適用することができますこのような唾液腺、メッケル軟骨、鼻腺、舌、耳などの他の臓器の。
概要
多くの実験のためには、培養組織ex vivoでの開発に従うことができることが重要である。組織を発症する培養物は、開発の定義された周期でアクセスを提供し、培養培地への因子の添加による遺伝子の操作、または装填ビーズ上、およびトランスフェクションおよびエレクトロポレーション1を用いて可能にする。多くの実験のために、それが成長するにつれて、組織は、形態形成を受けるように系統標識細胞の運命を追跡するために、例えば、組織を可視化できることが重要である。これは、胚からの組織のブロックを培養するときに明らかにされていません胚の中の深い開発組織に特に問題となり得る。彼らは下顎、上顎骨および前頭鼻プロセス内で開発するように歯が、この良い例です。全体顎骨を培養したときに歯の表面的な構造が見ることができますが、形態の変化は、固定された組織の切片化した後に分析することができます 2まで。私たちは、私たちが歯胚の発達に従うことを可能にし、開発中に歯の様々な部分へのアクセスを提供するライブスライス培養技術を適応している。修正されたTrowellの方法3を使用して気液界面での技術培養歯胚スライス、。これらのスライス培養を直接歯の形態形成に続いて、このようなエナメルの結び目と歯乳頭や毛包1,4-7などの個別のコンポーネントの系譜トレースを可能に非常に有用であった。技術は、マウス胚に限定されず、正常ブタの培養生のスライスとヘビ歯組織8,9に用いられてきた。....
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プロトコル
1。セットアップする
- （鉱物油で潤滑研ぎ石を使用して）解剖器具をシャープにし、70％エタノールスプレーや乾熱滅菌を使用して器官培養に使用する前に滅菌する。 12 V電源を使用して、2M水酸化ナトリウムで電気分解を使用して解剖針を研ぐ。
- 1％のグルタおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したアドバンスト·ダルベッコ改変イーグル培地、F12（DMEM F12キー）からなる、胚の器官の解剖と培養に用いる培養液を準備します。
2。胚解剖
- ホームオフィスやその他の管理機関によって承認されたスケジュール1の方法を使用して、時限交配、妊娠女性を間引く。下腹部の周りの皮膚を離れて解剖し、ハサミを使って腹部を開いてカット。下正中線で一緒に接続する2つの子宮角を見つけます。
- 氷の上の媒体で満たされたチューブ内の子宮と場所を解剖する。 WHEnは氷上で、組織は、数時間放置することができる。
- 子宮を取り出して、顕微鏡下で培地中のペトリ皿に置く。可能な胚の解離は、汚染を最小限に抑えるために層流フード内で実行されるべきある。
- 子宮から胚を解剖し、その胚体外組織からそれらを解放。
- タングステン針を使用して胚を斬首し、培地の新鮮な皿に頭を移す。
- 口腔内に針を配置することで、ヘッドから下顎を隔離し、頭の後ろ（ 図1A
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結果
第一大臼歯歯小嚢の動きに追従するためには、250μmの正面切片を上記の方法を用いて下顎を介して採取した。歯小嚢は、発生中の歯の外側のエナメル上皮（OEE）を取り囲む間葉の層であり、先に6の歯周組織の形成に関与することが示されている。顎はE14.5、歯の発生のキャップ段階で解剖した。スライスにおける歯科上皮の輪郭が明らかになった、と凝縮歯科間充織は、歯上皮（ 図4A）の周りに暗いリングとして同定することができた。のDiIは舌側（ 図4A）上の歯のスライスの外側のエナメル上皮の隣の間充織に注入した。標識後の切片を4日間培養した間隔（ 図4Bおよび4C）で写真撮影した。 インビボ歯胚に達したであろうE18.5によるベルステージと、別個のベル段形状がこの期間にわたって類似の進行を示す、切片で観察された。のDiIのスポットは、歯が（ 図4Bおよび4C）成長したように、外側の歯科上皮の周りに延びるセルの帯域に.......
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ディスカッション
歯の文化のこの方法は、歯胚へのアクセスの利点は、上皮または間葉内のビーズの正確な系譜トレースと配置を可能にする優れています。発展途上歯胚の決定された領域は、したがって、特に標的とすることができる。培養中に歯胚の変化形態を続けることができ、かつ操作の効果はすぐに評価した。
これらは正確に細断することができないような方法は、しかし、そのような象牙質及びエナメル質などの硬組織の実質的な形成の前に若い歯胚にのみ適している。 E15.5後顎のためには、チョッピングの前に骨を除去する必要がある。これは、潜在的に密接E16.5からの骨に関連付けられている歯胚を損傷させるという欠点がある。我々が正常に歯がエナメル質の堆積のためにカットするチョッパーのために硬くなりすぎた後、生後4、解剖歯胚をスライスしています。スライスMethodは蕾の段階1,6、つまり 、E13.5からの歯胚に適しています。歯は、上皮肥厚の段階にあるときに、この時点の前に、歯の細菌が発達行うが、成功率が低下し、形態が長期的に影響を受けることができる。
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開示事項
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
謝辞
サラA. Alfaqeehは歯科、高等教育省、サウジアラビア王国の種類サウド大学によって資金を供給される。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| エタノール | VWR | 101077Y | 100%エタノールを蒸留H2Oで70%に希釈した。 |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | 細胞標識溶液 |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Geminator 500 | Thomas | No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | スタンダードテーブル |
| オルガンカルチャーディッシュ (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm孔径) | BD Falcon | 353090 | PETトラックエッチング膜、6ウェルフォーマット |
| 金属グリッド(ステンレス鋼-AISI 304-メッシュ) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 インキュベーター | Nuaire NU-5500 | ||
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | シングルチャンネル ピコスプリッツァーIII |
| フィラメント付きガラスキャピラリー 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| タングステン線 0.1 mm | グッドフェロー | W005138 | |
| タングステン線 0.38 mm | グッドフェロー | W005155 | |
| アスピレーターチューブ | シグマ | A5177 | 口内吸引系統トレーサーに使用 |
参考文献
- Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
- Ferguson, C. A., et al.
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再版と許可
