外植片培養での歯胚の開発に続いてのためのスライス培養法

サマリー

ここでは、詳細な組織チョッパーを用いて下顎骨のスライスにおける培養歯胚へのメソッド。この方法は、より伝統的な培養法を用いて、利用できない、操作および系統の追跡のための素晴らしい機会を提供し、開発中に歯に固有のアクセスを許可します。

要約

外植片培養物は、特定の時点で現像器官の操作を可能にし、従って、発生生物学者のための重要な方法である。多くの器官のために、ex vivoで培養中に監視できるように、発達中の組織にアクセスすることは困難である。形態形成運動に従うことができ、特定の細胞集団が、系統操作またはトレースの対象とすることができるようにスライス培養法は、組織へのアクセスを可能にする。

本論文では、種の範囲の歯胚の培養に非常に成功しているスライス培養する方法を説明します。この方法は、他の顎の組織に囲まれた、生体内で観察されたものと同様の速度にて開発歯胚への優れたアクセスを提供します。これは、歯と周囲組織との間の組織の相互作用を監視することを可能にする。本論文では、歯胚に集中していますが、同じプロトコルは数値の発展をたどるために適用することができますこのような唾液腺、メッケル軟骨、鼻腺、舌、耳などの他の臓器の。

概要

多くの実験のためには、培養組織ex vivoでの開発に従うことができることが重要である。組織を発症する培養物は、開発の定義された周期でアクセスを提供し、培養培地への因子の添加による遺伝子の操作、または装填ビーズ上、およびトランスフェクションおよびエレクトロポレーション¹を用いて可能にする。多くの実験のために、それが成長するにつれて、組織は、形態形成を受けるように系統標識細胞の運命を追跡するために、例えば、組織を可視化できることが重要である。これは、胚からの組織のブロックを培養するときに明らかにされていません胚の中の深い開発組織に特に問題となり得る。彼らは下顎、上顎骨および前頭鼻プロセス内で開発するように歯が、この良い例です。全体顎骨を培養したときに歯の表面的な構造が見ることができますが、形態の変化は、固定された組織の切片化した後に分析することができます 2まで。私たちは、私たちが歯胚の発達に従うことを可能にし、開発中に歯の様々な部分へのアクセスを提供するライブスライス培養技術を適応している。修正されたTrowellの方法^3を使用して気液界面での技術培養歯胚スライス、。これらのスライス培養を直接歯の形態形成に続いて、このようなエナメルの結び目と歯乳頭や毛包^1,4-7などの個別のコンポーネントの系譜トレースを可能に非常に有用であった。技術は、マウス胚に限定されず、正常ブタの培養生のスライスとヘビ歯組織^8,9に用いられてきた。歯の発生を可視化することができるという利点に加えて、スライス方法はまた、組織の薄いスライスをインキュベーターから媒体と空気から栄養分へのアクセスが増加しているという利点を有する。これが改善され、生体内での開発と一致する歯胚の成長、およびshow invasになり乳頭⁷への内皮細胞のイオン。これとは対照的に、全体の下顎の文化で歯胚は、 生体内でのものよりも遅く発展と文化の中心地は、多くの場合、長期培養中に壊死性である。スライス培養において、歯は、顎のスライス内で発達し、周囲の現像骨および他の組織との相互作用を監視することができる。本手法では、組織は、直線支持媒体^10,11に埋め込 ​​む必要はありませんし、チョッピングブロックに組織を取り付けるための任意のシステムを必要とせず、解剖後に切り刻まれている。方法は、多くの下顎骨が1セッションで区分けすることができるように、そのための非侵襲的かつ迅速である。

プロトコル

1。セットアップする

1. （鉱物油で潤滑研ぎ石を使用して）解剖器具をシャープにし、70％エタノールスプレーや乾熱滅菌を使用して器官培養に使用する前に滅菌する。 12 V電源を使用して、2M水酸化ナトリウムで電気分解を使用して解剖針を研ぐ。
2. 1％のグルタおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したアドバンスト·ダルベッコ改変イーグル培地、F12（DMEM F12キー）からなる、胚の器官の解剖と培養に用いる培養液を準備します。

2。胚解剖

1. ホームオフィスやその他の管理機関によって承認されたスケジュール1の方法を使用して、時限交配、妊娠女性を間引く。下腹部の周りの皮膚を離れて解剖し、ハサミを使って腹部を開いてカット。下正中線で一緒に接続する2つの子宮角を見つけます。
2. 氷の上の媒体で満たされたチューブ内の子宮と場所を解剖する。 WHEnは氷上で、組織は、数時間放置することができる。
3. 子宮を取り出して、顕微鏡下で培地中のペトリ皿に置く。可能な胚の解離は、汚染を最小限に抑えるために層流フード内で実行されるべきある。
4. 子宮から胚を解剖し、その胚体外組織からそれらを解放。
5. タングステン針を使用して胚を斬首し、培地の新鮮な皿に頭を移す。
6. 口腔内に針を配置することで、ヘッドから下顎を隔離し、頭の後ろ（ 図1Aおよび図1B）に向かってカットスルー。チョッピングを待っている間に単離されたあごを一時的に氷上で媒体に格納することができる。
7. 全体下顎のスライスラインステージのためE11.5-E15.5歯胚培養のための理想的です。 E15.5の後に下顎骨の途上骨は、チョッピングのためにあまりにも難しいです。歯のスライスは、まだすることができますが、骨（歯骨や歯槽骨を形成する）は、最初にして除去されなければならない^{9チョッピング}の前に解剖。タングステン針とピンセットを使って慎重に骨を除去。

3。胚スライス

1. 標準テーブル組織チョッパー（ 図1C）を使用して、下顎骨組織切片を準備します。約200顎後に新鮮な刃を使用し、それが低下したときにはディスク装着と同一平面にあることを確認してください。
2. 使用前に70％エタノールでディスク装着し、ブレードを清掃してください。マシンを使用している場合、ブレードは非常にシャープでよう注意が必要があります。
3. 標本の年齢に応じて200〜400ミクロンの間の切断距離でチョッパーを設定し、全体の歯胚が必要であるかどうかに応じて。最大でブレード力を設定。
4. ピペットまたはピンセットを用いてプラスチック製の取り付けディスクに下顎を転送します。向きがまだ明確で確認して、ディスク上に下顎を配置します。現像舌配向を決定するのに有用なランドマークとして使用することができる。臼歯ためのAFを使用切歯のために、彼らは（ 図2Aにチョッピングの面を参照）成長するにつれて、これらの歯の様々な方向を反映するように、下顎の矢状スライスを使用している間rontal /横方向（ 図1（b）にチョッピングの面を参照）。
5. 少し取り付けディスクに下顎を乾燥させるために、ろ紙を用いて組織の周りから過剰な培地を除去。
6. すぐに乾燥させた後、チョッパーの円形のステンレス製のテーブルの上にディスクを置きます。マシンの電源を入れ、[開始]を押します。表は、同時にブレードを担持するチョッピングアームを上昇さ/分、最大200ストロークで滴下しながら左から右に自動的に横断する。
7. 組織が完全にスライスされた後、マシンの電源をオフにします。ブレードアームが上昇位置にあることを確認して、ディスクを取り出します。ブレードアームの下に指を入れたりチョッピング時に無人の機械を放置しないでください。
8. ディスク装着を取るとすぐにメディアトンを追加過度の乾燥を防ぐために、ディスク上のスライスO。注意深く培地の小さなペトリ皿（ 図2A）内にタングステン針、次いでピペットを用いて、ディスクの底からスライスされた組織を取り除く。
9. 針を使用してスライスを分離した後、実体顕微鏡（ 図1D、1E、および図2B）の下で、目的の組織を含む組織切片を選択します。培地で新鮮な培養皿に選択したスライスを配置します。

4。スライス文化

1. 、脱水を防ぐために、外側のウェルにオートクレーブ処理水約2mlを添加して皿の中央を横切って金属グリッドを配置することによって、培養の準備が中央ウェル器官培養皿を準備し（ 図3Aおよび3B）。
2. ステンレスメッシュのシートからX 1.5センチメートル約4センチのストリップを切断した金属グリッドを準備します。中央に穴を作るために穴パンチを使用し、曲げ千鳥エンドを作成するための側面。グリッドは、ディッシュ（ 図3Aと図3B）の底に平行に横たわって、中央だけでなく全体に平らに適合する必要があります。使用前に滅菌するグリッドをオートクレーブ。
3. グリッドの穴を​​カバーするのに十分な大き透明なポリエチレンテレフタレート（PET）膜（孔径0.4μm）での片を切り取る。選択されたスライスと皿にカット膜を置きます。
4. 膜の上にスライスを配置し、慎重に中央に平らにスライスして、媒体からメンブレンを持ち上げます。
5. 中央にある円形の穴の上にグリッド上にフィルターを置き、膜のレベルまで、ウェルに培養液に約1ミリリットルを追加。
6. 操作のために（例えば^、8）を培地にタンパク質または小分子阻害剤を追加します。
7. 文化の日の0時に形態学のレコードのスライスを撮影しています。
8. 5％のCOの加湿雰囲気中で食器を置く 2 UB。
9. 平均して7日間、定期的に文化を撮影しています。培養液ごと48〜72時間を変更します。写真撮影のための下（ 図2C-E）からの光源を用いてスライスを表示します。

5。リネージュトレース

系譜トレースが必要な場合は、このようにDiIまたはDiOのような親油性染料は、ステップ4、スライス培養の前に歯胚に注入することができる。

1. ニードルプラーを用いてガラスキャピラリー針を引き出します。
2. ピンセットを用いて、針の先端を破壊し、ダウン色素溶液にチップを置く。染料は、毛細管現象によってチップを埋めながら、数分間のままにしておきます。
3. ホルダーに充填された注射針を配置し、注射器や口アスピレーターに管を介して取り付けます。
4. ラベルされることになったスライスの領域をタッチし、培地中の針の先端の位置を決めます。針ANから少量の染料を変位させる空気圧を適用する組織上にD。
5. 針を取り外し、蛍光下にラベルを確認してください。
6. 正常に標識されたスライスは、フィルターに移し、工程4に記載のように培養することができる。

結果

第一大臼歯歯小嚢の動きに追従するためには、250μmの正面切片を上記の方法を用いて下顎を介して採取した。歯小嚢は、発生中の歯の外側のエナメル上皮（OEE）を取り囲む間葉の層であり、先に⁶の歯周組織の形成に関与することが示されている。顎はE14.5、歯の発生のキャップ段階で解剖した。スライスにおける歯科上皮の輪郭が明らかになった、と凝縮歯科間充織は、歯上皮（ 図4A）の周りに暗いリングとして同定することができた。のDiIは舌側（ 図4A）上の歯のスライスの外側のエナメル上皮の隣の間充織に注入した。標識後の切片を4日間培養した間隔（ 図4Bおよび4C）で写真撮影した。 インビボ歯胚に達したであろうE18.5によるベルステージと、別個のベル段形状がこの期間にわたって類似の進行を示す、切片で観察された。のDiIのスポットは、歯が（ 図4Bおよび4C）成長したように、外側の歯科上皮の周りに延びるセルの帯域に...

ディスカッション

歯の文化のこの方法は、歯胚へのアクセスの利点は、上皮または間葉内のビーズの正確な系譜トレースと配置を可能にする優れています。発展途上歯胚の決定された領域は、したがって、特に標的とすることができる。培養中に歯胚の変化形態を続けることができ、かつ操作の効果はすぐに評価した。

これらは正確に細断することができないような方法は、しかし、そのような象牙質及びエナメル質などの硬組織の実質的な形成の前に若い歯胚にのみ適している。 E15.5後顎のためには、チョッピングの前に骨を除去する必要がある。これは、潜在的に密接E16.5からの骨に関連付けられている歯胚を損傷させるという欠点がある。我々が正常に歯がエナメル質の堆積のためにカットするチョッパーのために硬くなりすぎた後、生後4、解剖歯胚をスライスしています。スライスMethodは蕾の段階^1,6、つまり 、E13.5からの歯胚に適しています。歯は、上皮肥厚の段階にあるときに、この時点の前に、歯の細菌が発達行うが、成功率が低下し、形態が長期的に影響を受けることができる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エタノール	VWR	101077Y	100%エタノールを蒸留H2Oで70%に希釈した。
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
ペニシリン-ストレプトマイシン	Sigma	P0781
DiI (Molecular probes)	Vybrant	V-22885	細胞標識溶液
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO (Molecular probes)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	No. 3885A20	Dry-heat sterilization
McIlwain tissue chopper	Ted Pella, Inc.	10180	スタンダードテーブル
オルガンカルチャーディッシュ (Center-Well Organ Culture Dish)	Falcon	353037
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm孔径)	BD Falcon	353090	PETトラックエッチング膜、6ウェルフォーマット
金属グリッド(ステンレス鋼-AISI 304-メッシュ)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 インキュベーター		Nuaire NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	シングルチャンネル ピコスプリッツァーIII
フィラメント付きガラスキャピラリー 1 mm	WPI	TW100F-4
タングステン線 0.1 mm	グッドフェロー	W005138
タングステン線 0.38 mm	グッドフェロー	W005155
アスピレーターチューブ	シグマ	A5177	口内吸引系統トレーサーに使用