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方法論記事

実験的自己免疫性脳脊髄炎の成体マウスにおけるガラス脊髄窓の埋め込み

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⸱

DOI:

10.3791/50826

⸱

2013年12月21日

 ,  ,  , 
1Developmental Biology Institute of Marseille-Luminy (IBDML), Aix Marseille University, 2Campus de la Timone, European Research Center for Medical Imaging (CERIMED)

この記事について

サマリー

実験的自己免疫性脳脊髄炎を研究するために、成体マウスの露出した脊髄にガラス窓を埋め込み、維持する方法を説明します。これらのウィンドウは、2光子顕微鏡を使用して生きた動物の細胞内レベルで細胞動態を監視するための脊髄への慢性的な光学アクセスを提供します。

要約

成体のげっ歯類における実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症などの自律神経脱髄疾患を研究するための標準的な実験モデルです。ここでは、生体内顕微鏡検査に適した低コストで再現性の高いガラス窓移植プロトコルと、EAEを持つ生きた成体マウスの細胞内分解能による脊髄細胞構造のダイナミクスの研究を紹介します。簡単に言うと、椎骨T12-L2を外科的に露出させ、シアノアクリレートと歯科用セメントの組み合わせを使用して、露出した椎骨の周りにチャンバーを構築します。椎弓切除術をT13からL1まで行い、透明なシリコーンエラストマーの薄層を露出した脊髄の背側表面に塗布します。ガラスが直接脊髄に接触しないように注意しながら、露出した脊髄に修正ガラスカバースリップを埋め込みます。窓と脊髄の間の炎症細胞の浸潤を減らすために、移植後最初の 10 日間は 2 日ごとに抗炎症治療が行われます (倫理委員会の推奨により)。EAEは、抗炎症治療の中止後わずか2〜3週間で誘発されます。

このアプローチを使用して、窓を埋め込んだ動物の87%でEAEを誘導することに成功し、Thy1-CFP-23マウス(背側脊髄の青い軸索)を使用して、EAEの進行全体にわたる軸索の損失を定量化しました。まとめると、このプロトコルは、さまざまな細胞集団の動員、およびそれらの相互作用ダイナミクスを、細胞内分解能で長期間にわたって研究するのに役立つ可能性があります。この生体内イメージングモダリティは、EAEなどの自己免疫性脱髄疾患を治療するための治療戦略を開発するための貴重なツールを表しています。

概要

多発性硬化症は、進行性のミエリンと軸索の損傷を引き起こす中枢神経系の自己免疫疾患です。CNS自己免疫性脱髄疾患の標準的な研究モデルは、成体げっ歯類のEAEです。しかし、EAEの進行の根底にある動的な細胞イベントは、ほとんど解明されていません。1つのアプローチは、生体内2光子顕微鏡を使用して、EAEの成体マウスの脊髄に蛍光マーカーを持つ細胞集団を長期間視覚化することです。

Intravital Two-photon Microscopesは、細胞生理学、細胞相互作用、および細胞内分解能1で生きている動物の疾患のダイナミックな進行を研究するための強力な方法です。ただし、このアプローチの大きなハードルは、関心領域への光アクセスが必要なことです。例えば、頭蓋ガラス窓は、脳内の同じ微細構造を数週間にわたって繰り返しイメージングするための確立された方法論である2,3。しかし、この方法論を脊髄イメージングに適応させることは容易ではなく、関節椎骨内の背側脊椎組織を固定するためには、いくつかの技術的な修正が必要です。

以前は、脊髄への光学的アクセスには、各イメージングセッションの開始時に脊髄を外科的に再露出させ、各セッションの終了時に閉じた皮膚を縫合する必要がありました4-12。これらの繰り返しの手術は、動物にとって外傷性であり、画像セッションの数と長さを制限し、機械的な摂動による炎症や脊髄の損傷などの手術関連のアーティファクトの可能性を高めます。これらの欠点を克服するために、我々は最近、外傷性脊髄損傷を有する成体蛍光トランスジェニックマウスの露出した脊髄上にガラス窓を埋め込むプロトコルを開発した 長期間のin vivo二光子顕微鏡実験 繰り返し手術なしで13。ここでは、成体マウスにおけるEAEの進行の根底にある動的細胞イベントを研究するためのアプリケーションのコンテキストで、移植プロトコルの詳細な適応を示します。

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プロトコル

1. 窓と支持構造の準備

  1. 窓の準備 - 移植のために、さまざまなサイズ(幅= 1.8-2.2 mm、長さ= 4.5-5.2 mm)のいくつかの窓を準備します。
    1. カバーガラスを切断するための修正ドリルバリを作る - たっぷりの歯科用セメントを使用して、ドリルバリをシャフト(この場合は古いブルドッグクランプ)に取り付けます。取り扱いを容易にするために、バリがシャフトに対して~45°であることを確認してください。
      注:ダイヤモンドスクライブは、カバーガラスの切断にも適しています。
    2. スライドAを作る - 標準的な顕微鏡スライドを使用して、スライドの底に短い定規紙(~2 cm)をテープで貼り付け、ガラス越しに定規が見えるようにします。次に、定規の0mmマークの端に沿ってテープを配置して、次のステップでカバーガラスの固定具として機能します。
    3. 修正されたドリルバリ、スライドA、および未修正の顕微鏡スライド(スライドB)を使用して、カバーガラス(厚さ1.5番)をスライドAの0mmマークに配置します。スライドBは、カバーガラスを固定し、意図したカットラインの治具として使用します。カバーガラスを約5 x 22mmの長い長方形にカットします。カットしたガラスを90°回転させ、長方形を~2 x 5 mmの小さな長方形にカットします。
  2. ステープルの変更 - 2 つの変更されたステープルが埋め込まれ、窓室を支えて椎骨に固定します (セクション 2.7-8 を参照)。
    1. 標準的な小さなステープル(リューズ= 8 mm、脚部= 4 mm)を使用して、リューズの中央を~90°曲げて、脚の先端がほぼ接触
      2. するようにします。
    2. 脚の先端を中間点で~45°外側に曲げて、脚の遠位半分が平行になるようにします。
    3. 脚の遠位半分をステープルの平面に対して~30°上向きに曲げます。滅菌のために手術の前に、修正されたステープルをエタノールに入れます.
      注:ステープルは、エチレンオキシドを使用して滅菌したり、オートクレーブ滅菌したりすることもできます。
  3. ペーパークリップの改造 - チャンバーの一部として埋め込み(セクション2.9-10を参照)、手術やイメージングの保持クリップとして機能するように、1つの改造ペーパークリップを準備します。
    1. 標準の25mmペーパークリップを使用して、細長いU字型を残して小さな曲がりを取り除きます。
    2. ペンチまたはニードルドライバーを使用して、先端を平行に保ちながら、曲げの直径を~2mmに縮小します。
    3. 曲げから約8〜10mmで先端を外側~90°に曲げます。平らになるように必要な調整を行います。

2. 窓の埋め込み

注:すべての外科的および動物的なケア手順は、欧州共同体理事会の指令に従って実施され、フランスの国立動物研究委員会(承認番号13,300)によって承認されました。

  1. マウスに麻酔(Ket/Xyl;導入用量:120 mg/kg、12 mg/kg;補助用量:40 mg/kg、4 mg/kg)を投与し、眼に軟膏を塗布します。
    2. 胸部の
  2. こぶを中心に、背中を幅約~2cm、長さ~5cmに剃り、露出した皮膚をヨウ素石鹸とヨウ素溶液できれいにします。90%エタノールをスプレーして手袋を清掃します。
  3. ティッシュハサミを使用して、背側の皮膚を椎骨T11からL1(~2 cm)にわたって縦方向に切ります。メスを使用して、T11 から L1 までの棘突起と横突起の間に両側の縦方向の切開を行います。注: 手袋や器具が動物の毛皮や皮膚に触れた場合は、90% エタノールや Germ-X などの冷間滅菌器を使用して手袋や器具を再洗浄してください。
  4. マウスを脊椎フォーク定位固定装置に吊るします - まず、右上の脊椎フォークを所定の位置に固定します。Adson鉗子を使用してT11をつかみ、T11の横突起を固定された脊椎フォークの上に配置します。椎骨を所定の位置に保持しながら、反対側の脊椎フォークを反対側の横突起の下に固定します。
  5. ステップ2.4と同じ手順で、L1を脊椎フォーク内に配置します。
  6. メス(No.23)を使用して、T11からL1までの棘突起と横突起の間の筋肉をやさしく削り取り、椎弓板がはっきりと見えるようにします。T11の茎をよりよく見るには、横突起の先端から吻側に突き出た腱を切ります。
  7. 修正したステープルをPBSですすぎ、ステープルの先端をT11とL1の椎骨茎の外側に挿入し、先端間の距離を調整して、椎弓根に軽く触れるようにします
    注:デキサメタゾン(0.1%)、ペニシリン(1,000 U / ml)、およびストレプトマイシン(1 mg / ml)を含むPBSのみを使用して、術後の炎症を軽減し、窓の明瞭さを改善します。.
  8. 各挿入ポイントにシアノアクリレートを少量滴垂らしてステープルを所定の位置に接着し、マウスを脊椎フォークから取り外します。
  9. 皮膚の切り口と、きれいになった椎骨の周りの露出した筋肉にシアノアクリレートの薄層を塗布し、椎骨を接着しないように注意します。変更されたペーパークリップの先端を曲げて、埋め込まれたステープルの突出部分の下に入り、孤立した脊柱の長軸と平行に静止してこの位置から離れます。
  10. 皮膚と筋肉の界面から始めて、露出した椎骨を除く開口部全体を覆うように歯科用セメントを数層塗布し、ペーパークリップを歯科用セメント内にしっかりと埋め込むようにします。
  11. 歯科用セメントが硬化したら(5〜15分)、埋め込まれたペーパークリップの露出部分でマウスを「クリップホルダー」に取り付けます。鉗子を使用して、露出した椎骨の棘突起と椎弓板の間の筋肉やその他の軟組織を切除します><。 注:ペーパークリップの露出部分をクリップ/チャンバーにストレスを与えることなくしっかりとつかむことができ、手術中にマウスの向きを変えるために操作できるデバイスは、「クリップホルダー」として使用できます。
  12. 骨除去ドリルを使用して、T12とT13の椎弓板を両側に薄くします。背骨を切除するには、鈍い鉗子で棘突起をつかみ、脊髄に向かって下向きの力がかからないように注意して持ち上げます。骨が簡単に剥がれない場合は、棘突起が簡単に除去できるようになるまで、椎弓板を薄くし続けます。
  13. 骨除去ドリルを使用して、椎骨の横方向のエッジを形作り続けて、窓の支持構造を形成します。鈍い鉗子を使用して、硬膜に触れているすべての小さな骨片をそっと取り除きます。PBSを使用して硬膜の湿度を維持するようにしてください。
  14. 椎弓切除術の開口部よりもわずかに幅が広い準備された窓の1つを選択し、露出した骨にどれだけうまく載っているかをテストします。理想的には、窓の中央が硬膜に接触するように、窓は両側に両側に載ります(図1a)。ただし、窓を脊髄に向かって押しても、窓が脊髄を圧迫してはいけません。ウィンドウが不均衡であるか、硬膜より上にある場合は、手順2.13を繰り返します。
  15. 椎弓切除術に満足したら、硬膜の乾燥を防ぐためにPBSに浸したオートクレーブ処理したティッシュペーパーの小片を脊髄に置き、マウスを脇に置きます。
  16. 窓の掃除 - 窓をウィンドウクリーナーの溶液に数秒間入れます。顕微鏡のレンズティッシュを使用して、窓を拭いて乾かします。手術用顕微鏡で窓がきれいであることを確認し、そうでない場合はクリーニングプロセスを繰り返します。手順2.19でウィンドウをすばやく取得して配置できるように、ウィンドウを簡単にアクセスできる清潔な場所にウィンドウを配置します。
  17. マウスを取り出し、ティッシュペーパーを取り出します。鈍い鉗子を使用して硬膜から破片をそっと取り除き、硬膜がわずかに粘着性になるまで乾かします。
  18. シリコン(Kwik-sil)ミキサーチューブをすばやく充填し、先端から気泡が出なくなるまでシリコンをきれいなスライドに押し出します。露出した脊髄の正中線に沿ってシリコンの小さなビーズをすぐに投与します。
  19. 鈍い鉗子を使用して清掃された窓を回収し、すぐにシリコンの上に置きます。鈍い鉗子を使用して、窓に少量の圧力を加えて、シリコンを窓の端に広げ、~1分間所定の位置に保持します
    注:混合する前に、シリコーンは27°C未満で保管する必要があります。そうしないと、硬化時間が大幅に長くなり、窓や硬膜に付着せず、光学的透明度が低下します。
  20. 窓からゆっくりと圧力を解放します。ウィンドウが動かない場合は、すぐに手順 2.21 に進みます。ただし、圧力が解放されたときに窓が上昇する(つまり、椎骨が動く)場合は、窓を所定の位置に保持するための圧力を維持しながら、ステップ2.21に進みます。
  21. シアノアクリレート吻側と窓の尾側に適用します。シアノアクリレートが窓の吻側と尾側の端を覆っていない場合は、つまようじを使用して、液体シアノアクリレートの一部をこれらの端に導きます。次に、接着剤を窓の横方向の縁に沿ってガイドし(図1a)、周囲のすべての筋肉を覆います。注:シアノアクリレートは、窓の外縁の表面を覆う必要があります。シアノアクリレートが多すぎると光学的透明度が損なわれる可能性があり、シアノアクリレートが足りないと、シリコンと窓の間に気泡が発生します。
  22. シアノアクリレートを保護し、チャンバーの構造的完全性を高めるために、シアノアクリレートで覆われたすべての領域に歯科用セメントを塗布します(図1a)。シアノアクリレートと同様に、吻側と尾側の端から始めて、小さな木の棒を使用して窓の端に沿って歯科用セメントをガイドします。

3. 術後ケア、EAE導入術、ウィンドウメンテナンス

  1. デキサメタゾン(0.2 mg / kg)とリマジル(5 mg / kg)s.q.を骨盤領域に注入します。.マウスをネスティング材で温めたケージ(~26°C)に移します。マウスは完全に可動性があり、ケージを探索し、麻酔薬の影響が完全に治まった後(通常は2〜3時間)に毛づくろいをする必要があります。動物を個別に飼育し、最初の1〜2日間は餌と水に簡単にアクセスできるようにします。マウスが麻酔薬から回復し始めたら、ブプレノルフィン(0.05 mg / kg)s.q.を注射します。麻酔薬から完全に回復した後、マウスは痛みの兆候を示さないはずです。注:麻酔薬から完全に回復すると、痛みや異常な運動活動の兆候は、窓が正しく埋め込まれていないことを示します。
  2. 手術後最初の10日間は、デキサメタゾン(0.2 mg / kg)とリマジル(5 mg / kg)を2日ごとに注射します(図1a)。マウスに窓を注射するには、誘導チャンバー内でイソフルランで動物を軽く鎮静させます(空気中で~1.75%イソフルランを1〜2分間)。.マウスをチャンバーから取り出し、すぐに薬を注射します。マウスは<1分で完全に覚醒するはずです
    注:窓が埋め込まれたマウスは、インプラントから皮膚が分離する可能性があるため、首筋を突かないでください。マウスを前足でケージの蓋をつかみ、後肢を静かに上げることで、鎮静剤を投与せずにマウスを注射することは可能です。ただし、この位置では、マウスが引き離され、埋め込まれた窓にストレスがかかることがあります。これにより、窓と脊髄の間の出血が発生し、光学的明瞭さが損なわれる可能性があります。
  3. EAEは、抗炎症治療の中止後2〜3週間(手術後3~4週間)に誘発することができます。手順3.2の説明に従って、マウスを軽く鎮静します。マウスを誘導チャンバーから取り外し、イソフルランマスクを鼻の上に置いて鎮静を維持します。.
  4. MOG35-55ペプチド(結核菌800μgを含むフロイントアジュバントに75μg)を3つの異なるs.q.位置(大腿骨の両側、および尾の付け根)に注入し、百日咳毒素(400 ng)i.p.14,15
    注:EAEのマウスは、窓のみのマウスと比較して、追加のケアが必要です。EAEマウスの体重を毎日測定し、常に餌と水に簡単にアクセスできることを確認してください。動物の水分補給と体重を維持するために、3%アガロースゼリーを配合してサプリメントを補給します。グルコース(1〜3%)をゼリーに追加してカロリーを追加することもできます。
  5. EAE 導入の 2 日後、ステップ 3.2 で概説した鎮静プロトコルを繰り返し、百日咳毒素 (400 ng) の 2 回目の投与を注射します。
  6. 脊髄を画像化するには、まずステップ3.2で説明したように動物を鎮静させ、ケタミン/キシラジン(100 mg / kg;10 mg / kg)i.p.で軽く麻酔します。これにより、~1時間のイメージングが提供されます。
  7. <2時間続くイメージングセッションの場合、光麻酔は、ケタミン/キシラジン(50 mg / kg;5 mg / kg)の補助注射で45〜60分ごとに維持できます。あるいは、より長いイメージングセッションの場合、マウスをイソフルラン(加湿空気中の0.75〜1.25%イソフルラン)で連続的に鎮静することができます。
    注:窓は、ティッシュの角または綿棒の先端で破片をやさしく拭き取ることにより、手術用顕微鏡で掃除できます。一部の種類の歯科用セメントを劣化させ、脊髄を冷やす可能性があるため、窓の清掃にアルコールを使用しないでください。
  8. 軽く麻酔をかけたら、マウスは埋め込まれたペーパークリップの露出部分によってクリップホルダーにしっかりと取り付けられます(図1b)。
  9. 脊髄は、ホルダー内のクリップの位置を調整し、ホルダーの位置を調整し、ステージの位置を調整することにより、対物レンズに対して垂直に位置合わせされます。脊髄の背側表面を迅速に画像化し、背側血管系を使用して脊髄の向きを決定します。

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結果

慢性的に埋め込まれたガラスウィンドウを、生体内2光子顕微鏡法およびEAEモデルと組み合わせて使用することは、自己免疫性脱髄疾患の病理の根底にある細胞メカニズムを理解するための有用なツールとなる可能性があります。我々の埋め込み法を用いたところ、ほとんどのウィンドウはEAE誘導時に透明であり、EAEの進行中も透明なままであることが分かりました（Figure 1c）。このアプローチを用いることで、ウィンドウは埋め込み後の全期間（平均～68 d±7 s.e.m.；n = 21匹のマウス）を通じて透明に保たれ、我々の手法ではEAE誘導の前後に、36日間で最大12回の繰り返し2光子イメージングが可能であることが分かりました。

この手法の実現可能性を検証するための第一段階として、ウィンドウを埋め込んだ動物と埋め込まなかった動物におけるEAEの臨床的進行を比較しました（図1d）。その結果、EAEマウスにおいて臨床症状の発現にわずかな遅延が見られましたが（図1e）、発現後の全体的な進行やピーク時の臨...

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ディスカッション

EAEの経時的な動的進行を研究するために、成体マウスの露出した脊髄にガラス窓を埋め込んで維持する方法について説明しました。同様のガラス窓移植アプローチは、脊髄損傷モデル13の研究に使用されており、神経膠芽腫、髄膜炎、または正常な脊髄の細胞生理学などの他の脊髄病状の研究にも役立つ可能性があります。私たちの方法では、ガラス窓をこの外骨格に固定しながら、しっかりと固定された4つの椎骨の周りに外骨格を構築することによって、椎骨の安定化が達成されました。これらの実験では、ウィンドウが椎骨レベル T13-L1 に埋め込まれました。いくつかの予備実験では、より吻側と尾側のレベルに窓を埋め込みましたが、これらの窓の信頼性の詳細な調査はまだ行われていません。椎骨内腔内の脊髄組織の動きは、硬膜を透明なシリコンの薄い層でガラスに接着することによって減少されました。したがって、このセメント、接着剤、シリコンのアプローチは、チャンバーのすべてのポイントとすべての動物にしっかりと密閉される独自の調整の可能性を提供します。気泡や接着力の損失を回避することで、動きだけでなく、蛍光イメージングの妨げとなる線維化組織の形成も最小限に抑えました。その結...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

C. Ricard, M-Cに感謝します。Amoureux、A. Jaouen、S. Meijia-Gervacioは有益なディスカッションをしてくれました。M. HocineとC. Meunier、およびIBDMLの動物とPicSILイメージング施設のスタッフは、技術サポートを提供します。この研究は、Centre National de la Recherche Scientifiqueからの機関助成金、およびAssociation de Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) (G.R. and K.K.F) から、Agence Nationale de la Recherche de la Recherche (ANR JCJC), Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) Institut de Recherche sur la Moelle Epinière (IRME) から FD への助成金によって支援されました。K.K.F.はARSEPフェローシップの支援を受けました。イメージングは、IBDMLのPIcSILイメージング施設で行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
骨除去ドリルワールド精密機器IDEAL MICRO-DRILLまた、ハーバードApparatus.
によって販売されています 高品質の外科用骨ドリルで十分です。
ドリルバリ(#1/4または1/2超硬丸バリ)ワールド精密機器501860(#1/4)
501860(#1/2)		もハーバード装置
プルズLyreco5.002.567クラウン= 8 mm
脚= 4 mm
ペーパークリップ任意の標準25 mmペーパークリップ
ニードルドライバーファインサイエンスツール12003-15
ティッシュはさみファインサイエンスツール14028-10
アドソン鉗子ファインサイエンスツール11027-121 x 2歯
鈍い鉗子ファインサイエンスツール11293-00
脊椎フォークハーバード装置724813
歯科用セメントGACD12-565 & 12-568
シリコーンエラストマー世界精密機器KWIK-SILCoherent ScientificおよびFisher Scientific
CyanoacrylateEleco-EFDCyanolit 201
MicroscopeZeiss7MPでも利用可能 当社の顕微鏡は直立型で、5つのNDD検出器が装備されています。
対物レンズZeissW Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mm作動距離 = 1.8 mm
ステーによって販売

参考文献

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