我々は、迅速な抗生物質感受性試験のためのマイクロ流体プラットフォームを開発した。液体はマイクロ流体チャネルの底に固定化された細菌の上に高速で渡される。ストレスと抗生物質の存在下では、細菌の影響を受けやすい株は急速に死ぬ。しかし、耐性菌は、これらのストレスの多い条件を生き残ることができます。
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この記事について
サマリー
要約
ストレスベースの環境下での抗生物質感受性試験のための迅速な微小流体法を開発しました。液体はマイクロ流体チャネルの底に固定化された細菌の上に高速で渡される。ストレスと抗生物質の存在下では、細菌の影響を受けやすい株は急速に死ぬ。しかし、耐性菌は、これらのストレスの多い条件を生き残ります。この方法の背後にある仮説は新しいです:抗生物質の標的である生化学的経路のストレス活性化は、抗生物質感受性検査を加速することができます。標準的な抗生物質感受性試験方法と比較して、抗生物質の適用中に、速度制限ステップ(細菌増殖)は省略される。この方法の技術的実装は、標準的な手法と革新的なアプローチの組み合わせです。この方法の標準的な部分には、細菌培養プロトコル、ポリジメチルシロキサン(PDMS)におけるマイクロ流体チャネルの定義、蛍光による細胞生存率モニタリング、細菌カウント用のバッチ画像処理が含まれる。この方法の革新的な部分は、機械的ストレスアプリケーションのための培養培地フローの使用、細菌を損傷するが殺さない酵素の使用、細菌の付着のためのマイクロアレイ基質の使用にある。開発されたプラットフォームは、抗生物質および非抗生物質関連の医薬品開発および試験に使用することができます。標準的な細菌懸濁液実験と比較して、薬物の効果は、制御された期間にわたって繰り返しオンとオフを切り上げることができる。同じ実験の過程で同じ細菌集団の反復観察が可能である。
概要
細菌耐性の上昇は、最後の手段の私たちの薬を保護するために、速い表現型ベースの抗生物質感受性テストの必要性を強化します。標準的な感受性テストは、完了するまでに複数の(8-24)時間を要する抗生物質の存在下での細菌増殖阻害に基づいている。我々は、抗生物質の作用を加速するために生合成経路のストレス活性化に依存する微小流体プラットフォーム上で新しい抗生物質感受性試験を開発した。
マイクロ流体スケールでの抗生物質感受性試験は、少数の細菌を必要とするため、効果的なサンプル使用の利点を運びます。さらに、マイクロ流体デバイスは、複数の条件1,2の下で複数のサンプルをテストするために多重化することができます。最近、抗生物質感受性検査のための微小流体法の数が報告されている3-9.これらの方法では、細菌はナノおよびピコリットル液滴3,7の内部で増殖し、マイクロ流体チャネル4〜6、8の全容で、またはチャネル9の底面に電気的に局在する単一細菌として増殖する。これらの検査はマイクロ流体チャネルで行われますが、それらはすべて従来の方法と同様の抗生物質の存在と不在で微生物の成長を監視します。成長の測定は光学密度、pH敏感な色素、または明るい視野/位相のコントラストまたは蛍光のイメージ を介して 取られる。これらの検査のいくつかは従来の方法よりも速いが、それらはそれぞれ受動的に抗生物....
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プロトコル
1. PDMS レイヤを作成する(図1)
- PDMSと硬化剤を10:1比で激しく混合する。気泡を除去するには、真空チャンバー内の粘性混合物を室温で1時間脱気する。
- スケールで、アルミニウムモールドの上にゆっくりとPDMSを注ぎます。中央から注ぎ、金型を平準化してください。ピンを隠したままにしてください。目標重量が達成されたら、注ぎ込み停止します。
当社の金型は、PDMSの4 gと硬化試薬の0.4 gを必要とします。 - オーブン内の金型を平準化し、一晩で37°Cで硬化します。
代替硬化時間は、60°Cで2時間、または90°Cで1時間である。 - 金型の端に沿って硬化したPDMS層を解剖し、一対の鉗子で鋳型表面から慎重に剥がします。70%エタノールとQチップで金型表面を洗浄します。
2. 図2に従ってフローセルを組み立てる
ガラススライド付きPDMSの標準アセンブリは、PDMSと顕微鏡ガラススライド間のリークフリー結合を保証する両方の表面の酸素プラズマ処理によって行われます。提示されたプロトコルでは、プラズマ処理はガラススライド上の化学コーティングを破壊するであろう。そのため、スライドはプラズマ処理ではなく圧力密閉されています。
- フローセルポケットにガラ....
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結果
図4に示すデータは、抗生物質含有微小流体チャネルにおける経時の影響を受けやすい黄色ブドウ球菌株の応答を示す。1分および1時間実験の最後に取得した位相コントラスト画像を図4AおよびBに示す。分析された1時間のデータは、赤色で強調表示された細菌(合計5,828)で図4Cに示されています。対応する蛍光画像を図4DおよびEに示す。分析した1時間のデータを図4Fに示し、蛍光細菌を赤色で強調表示した(死者174個)。
この一連のイメージは、いくつかの点を示しています。最も重要なことは、蛍光細菌の数の有意な増加が実験の終わりまでに観察される( 図4D と Eで1分と60分の明るい蛍光スポットの数を比較する)、チャネル内の細胞死を示す。これらの結果は、影響を受け.......
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ディスカッション
提示されたプロトコルは、メチシリン感受性およびメチシリン耐性 黄色ブドウ球 菌株10を用いた一連の実験において検証され、最適化された。したがって、このプロトコルは、細菌細胞壁生合成に影響を与える作用のメカニズムを有する S.アウレウス および他の抗生物質の他の株に直接適用されるべきである。 S.アウレウス以外の細菌タイプは、可溶性(酵素)および機械的応力のストレスパラメータの変動を必要とする場合があります。もし、ブドウ 球菌 以外の細菌種の試験で可溶性ストレッサーが望まれる場合、リソスタフィンはブドウ球菌特異的酵素であるため、別のストレス剤が必要となる。
せん断応力の量は液体の流量に比例し、チャネルのサイズに反比例するため、原理的には大きな値の範囲内で変化させることができる。応力の達成値は、次の実験要因によって制限されます:固定化基材がより高い流量下で細菌を保持する能力、漏れることなく高圧を維持するマイクロ流体アセンブリ、システム内の液体流動抵抗、流量を不安定にしたり、流.......
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開示事項
マイクロ流体法は特許出願中です:ザウアー・バッジA、シャロンA、カラシニコフM、ウィルツH、発明者;細菌抗生物質耐性/感受性特許PCT/US10/33523の迅速な検出のための方法および装置。
謝辞
フラウンホーファー製造イノベーションセンターのエンジニアと学生に感謝します。実験システムの設計、加工、自動化を支援するために、アンドレアス・プリンツェン、ホルガー・ヴィルツ、ダグ・フォス、デビッド・チャーギン、そしてスドン・シュー博士に感謝します。ジュリア・クッカーツ、メラニー・ツィンマーマン、ニコ・クレッツマー、ティム・ガンベル、ジョシュ・ビジャヌエバ、清水実、カタジナ・クリガの実験に関する研究に感謝します。私たちは、ハーバード大学ブロード研究所のイメージングプラットフォームのアン・E・カーペンター博士とマーク・アンソニー・ブレイ博士が、CellProfilerの画像分析ルーチンの開発に協力していることを認めます。このプロジェクトは、国立アレルギー・感染症研究所のR21AI079474および1R01AI101446の賞によって部分的に支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立アレルギー・感染症研究所または国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。プロジェクトはフラウンホーファーUSAによってもサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | 死細胞蛍光染色 |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | リソスタフィンの保存に使用 |
| 酢酸ナトリウム | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | リソスタフィンの保存に使用 |
| リソスタフィン | Cell Sciences | CRL309A | 1 mgの固体としてお届けします。保存用:20 mM酢酸ナトリウムに溶解します。BSA溶液と混合して、最終濃度を1%BSAおよび100μにします。g/ml リソスタフィンの貯蔵用 |
| オキサシリン塩 | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | 抗生物質 |
| ミューラー ヒントン ブロス | フィッシャー サイエンティフィック | DF0757-17-6 | |
| 塩化ナトリウム | シグマ アルドリクッシュ | S3014-500G | オートクレーブ前にミューラー・ヒルトン・ブロスに 2% |
| 1 ml、ルアーロック・シリンジ | BD(ベックトン、ディキンソン、コンプ) | 14-823-2F | |
| 2オンス、ルアーロックシリンジ | BD(ベックトン、ディキンソン、コンプ) | 309653 - 60 mL | オーバーフィル ~65 ml |
| 顕微鏡 | |||
| 倒立蛍光顕微鏡 オリンパス IX-70 | ケンブリッジ・サイエンティフィック | 9349 | |
| 60X, 蛍光/位相差対物レンズ | オリンパス | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12ビットモノクロCCDカメラ | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| 顕微鏡自動化 | |||
| シャッター 位相差/蛍光 | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| フォーカスモーター | PRIOR Scientific | H122 | |
| XYZ制御用ジョイスティック | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscanコントローラー | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| 画像取得ソフトウェア | フラウンホーファーCMI | ||
| フローセルアセンブリおよびPDMS | |||
| フローセル | BU科学機器施設/フラウンホーファーCMI | 3333-1044 | 設計図面はフラウンホーファーCMI |
| で作成されました ガラス窓 | フラウンホーファーCMI | 3333-1054 | ガラス窓はフラウンホーファーで適切なサイズにカットされました |
| ボロフロート窓 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| シーリングプレート | BU 科学機器 施設 | 3333-1045 | |
| エポキシガラススライド | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS マスター | フラウンホーファー CMI | 3333-1053 | マスター アルミニウムまたは真鍮で加工 UPM-0005 (ウルトラプレシシオンフライカッティングマシン) |
| PDMS スライドデザイン | フラウンホーファー CMI | 3333-1053 | |
| チューブ | |||
| ナット、スーパーフランジレスTinytight、ヘッドレス、1/16インチ、PEEK、緑 | IDEX健康科学 | M-644-03 | フローセルの入力/出力は、このフェルール |
| フェルール、Tinytight、1/16インチ、6-40、.030インチTH、PEEK w / SSロックリング、黒 | 色IDEX健康科学 | M-657 | |
| ナット、スーパーフランジレスTinytight、ヘッドレス、1 / 16-1 / 32インチ、1 / 4-28、PEEK、天然 | IDEX健康科学 | P-255フェ | |
| ルール、スーパーFalngeless、1/16インチ、テフゼル(ETFE)、黄色 | IDEX健康科学 | P-259 | は、ルアーロックアダプター |
| チューブ、テフロンFEP、.030インチx 1/16インチx 20フィート、緑 | IDEXヘルスサイエンス | 1520G | |
| アダプター、メスルアーをメス1 / 4-28、PEEK、赤 にクイック接続します。 | IDEXヘルスサイエンス | P-658 |
参考文献
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. ....
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