自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

サマリー

結核、マラリア、人間と熱帯の貧しい集団における罹患率および死亡率の主要な原因の中で最も流行している感染症の2つです。我々は、感染の彼らの自然な経路を経て、両方の病原体攻撃後のマウスにおけるマラリア結核の重複感染の結果を研究するための実験的なモデルシステムを確立した。

要約

同時感染は自然に病原性生物の別個のタイプの地理的なオーバーラップのために発生します。同時感染はほとんどの場合、各単一病原体に対するそれぞれの免疫応答を調節することにより、病因および疾患の転帰に影響を及ぼし得る。重複感染患者は、抗感染介入に示差的に応答することができる。サハラ以南のアフリカの多くの地域でcoendemicが、どちらもマイコバクテリア、マラリア原虫マラリア原虫によって引き起こされるように結核の間の同時感染は、詳細に研究されていない。マラリア結核の同時感染は宿主免疫し、各疾患の経過を調節する方法に挑戦が、科学的、臨床的に関連性の高い質問にアプローチするために、我々は、私たちは共感染宿主内で両方の病原体に対する誘発される免疫応答を分析することを可能にする実験的なマウスモデルを確立。注目すべきは、最も正確に模倣自然に獲得したヒト感染するために、我々は実験的な実行それぞれ感染の彼らの自然なルート、 すなわちエアロゾルおよび蚊に刺され、両方によって病原体によるマウスの感染。

概要

ヒト集団はほとんど唯一の病原体にさらされていない。特に、サハラ以南のアフリカなどの感染症の発生率が高いとの地域では、同時感染は、プライムが、非常に過小な公衆衛生上の問題を表している。結核、マラリア、それぞれ、ヒトにおいて最も一般的な細菌や寄生虫感染であり、熱帯の貧しい集団における罹患率および死亡率の主な原因であり続けている。結核、マラリアとの重複感染のリスクのある多数の個人間の広い地理的なオーバーラップにもかかわらず、非常に少ないが、様々な、多くの場合、同時に重複感染個体ではマラリア原虫と結核菌に対して惹起される免疫調節因子およびエフェクターを打ち消すの間の相互作用について知られている。

混合感染の齧歯類モデルは、このように相互インフルに光を流して、1ホスト内の異なる病原体に対する差分免疫反応を特徴づけることができまた、治療と予防のための新しい提案を識別するのに役立ちます変調病理及び個々の疾患の臨床結果を、ences。私たちは、同じホスト¹内の結核菌（MTB）との同時感染によって引き起こされる波及効果やげっ歯類のマラリア原虫種を調査することを可能に実験用マウスモデルを確立している。重要なのは、可能な限り厳密に自然に獲得したヒトの感染をエミュレートするために、我々のモデルは、両方の病原体によって使用される感染の自然経路を実装しています。結核は、したがって、主に肺に現れる空気感染、です。それらは咳やくしゃみの間に感染性エアロゾル小滴を放出するとき原因物質は、Mtbのエアロゾル経路を介して活動性疾患を持つ人々によって送信される。従って、エアロゾル感染は自然感染を模倣するために選択される方法である。 マウンテンバイクを含有する浮遊粒子の発生を使用することによって達成することができる吸入暴露システムの。この全身曝露室は、感染が²開始され、肺の肺胞に吸入されるMTB-含む感染性エアロゾル液滴（ 図1）に実験動物を暴露できます。

一方、マラリア原虫は、自然に女性ハマダラカ蚊に刺さによって送信されたアピコンプレックス寄生原虫によって引き起こされる媒介疾患である。血粉中に、感染スポロゾイトは、ホストの皮膚の下に寄託され、その後、血流を通して肝臓に達する。肝細胞の中に彼らは開発し、急速に肝臓段階のシゾントに掛けます。最終的には、成熟したシゾントは破裂し、それらが赤血球侵入、複製、赤血球破裂、およびreinvasion ³の進行サイクルを開始する場合、血流への病原性の第一世代のメロゾイトの数千人を解放します。 マラリア原虫のライフサイクルコンチン一部のメロゾイトなどのUEは、性的寄生虫段階に血食事中に蚊によって撮影することができます男性と女性の生殖母細胞を、開発しています。蚊では、 マラリア原虫スポロゾイトは蚊の中腸内に存在するオーシスト以内に発症し、最終的に別のホスト^3,4に前方送信のための唾液腺に移行する。

実験動物モデルにおいてエアロゾル、したがって、最も関連性の高い経路を介したMtbの送達は非常に一般的であるが、マラリア、結核重複感染^5-7研究を含む多くの実験齧歯類マラリア感染の研究は生じさせ、寄生さ赤血球をマウスに感染させることによって実施されている臨床的にサイレント肝臓段階のフェーズを排除しながら血液段階のマラリア感染へ。しかし、肝臓期は、抗マラリア原虫の免疫^8月11日のための感染症と関連する時に必須のステップです。我々は、肝のpHを含めるようにしてそれはそれゆえ重要と考えるそれぞれマラリアやマラリア、結核の同時感染は、両方の研究において、マラリア伝染とメンテナンスのASE。また、天然に送信されたスポロゾイトではなく、単離された唾液腺由来のスポロゾイトを注入するの蚊によってマラリア感染を確立することを促し、針感染^12、を介して送信されるものよりも感染性であることが示されている。マラリア原虫の天然の送信のための感染性の蚊を得るための唯一の方法は、脊椎動物宿主（ここではマウス）および蚊ベクターの両方において寄生虫のライフサイクル全体を維持することである。従って、寄生虫メンテナンスのための昆虫館へのアクセスは、 咬合天然伝送を行うために不可欠である。

ここに記載さ我々のプロトコルは、 マラリアとの同時感染は、慢性結核¹への影響をスポロゾイトか調査するために開発されました。そうするために、マウスをエアロゾルM.に感染している結核および40日後、ときM.結核感染は、慢性期に到達した、マウスマラリア感染蚊に曝される。重複感染動物におけるマラリア、結核の両方の結果はそれぞれ、組織中の血液寄生虫及び細菌負荷を監視することによって追跡することができる。我々のプロトコルでは、我々は彼らの自然感染ルートとどのように成功し、病原体の伝達を確認するために経由して、両方の病原体をマウスに感染させる方法を詳しく説明します。我々の手では、両方の実験的な感染のために一般的に達成感染率は100％である。これらのプロトコルは、最も挑戦的な人間の感染症の2間の重複感染をモデル化し、研究するために、我々がそうであるように、別々に感染または、両方の研究に適用することができます。このモデルは、このプロトコルに記載されているもの以外の他のマイコバクテリウムおよび齧歯類マラリア原虫種に適用可能である。

プロトコル

安全対策と倫理に関する声明

ここに提示された研究は、ヒトの病原体マウンテンバイクやげっ歯類のマラリア原虫のPlasmodiumベルゲイ（P.ベルゲイ）で作業を伴う。 マウンテンバイク （菌H37Rv株）およびP.を用いた実験ベルゲイは、適切な生物学的安全性条件下で行われなければならない。バイオセーフティレベル（BSL）2の研究室は、Pとげっ歯類のマラリア原虫のために必要とされるここに記載されているすべての共感染の研究のため、したがってベルゲイとMTB用のBSL 3と、。注：マウンテンバイクに感染したマウスはすぐ近く内の他のマウスに（私たち自身の観察）感染を拡大しないでください。実験者への普及は、したがって、除外することができますが、適切な防護服は、すべての回で、BSL 3研究室の内側に着用する必要があります。私たちのルールによると、実験者は、外側の1がいつAの破棄された手術用スクラブ、ヘアネット、使い捨ての呼吸器、および手袋の2ペアを着用rms値は、キャビネットから引き出される。新しいものを再度キャビネットに入る前に置かれる。二つの容器、2％Buraton（注：のMtbを不活性化するために承認された他の消毒剤が承認濃度で使用することができる）を有する1つの液体および感染性廃棄物および表面汚染除去のための一方は、実験の前に調製され、キャビネット内に配置される。また、ビニール袋は、固体非感染性廃棄物のために使用される。ドイツのルールに従って、 マウンテンバイクから派生したマウンテンバイクの文化や組織の取り扱いや処理に関連するすべての作業はマウスがBSL3実験室の中にクラス2バイオセーフティキャビネット内で行わなければならない感染。マイコバクテリアの処理中に、対策が常にエアロゾルの生成を避けるために注意しなければならない。

6〜8週間の間熟成雌C57BL / 6マウス（Charles River）すべての共感染実験に使用し、BSL 3施設内の特定のバリア条件下で維持した。動物のケアと実験は、PEた農業、環境省の動物実験倫理委員会によって承認されたプロトコルに従ってrformedし、シュレースヴィヒ·ホルシュタイン州の農村

マラリア蚊のステージを得るためには、NMRIマウスはチャールズリバー研究所、ズルツフェルト、ドイツから購入し、大学ハイデルベルクの動物施設（IBF）内の特定の病原体を含まない条件下で飼育。全ての動物実験は、欧州の規制に従って行われ、バーデン=ヴュルテンベルク（Regierungspräsidiumカールスルーエ）の州当局によって承認された。

1。グラス-COLエアゾールチャンバーを用いてマウンテンバイクによるマウスのエアロゾル感染

マウンテンバイクで実験動物のエアロゾル感染を標準化するための最良の方法は、既知のCFU力価を凍結ストックからマイコバクテリアを使用することです。ミドル7H9ブロスに保存培養、文化マウンテンバイクを準備するためにOADC（オレインを補っ酸、アルブミン、デキストロース、カタラーゼ）富化培地および0.05％のTween 80、マイコバクテリアのための炭素源と同時に、細菌の凝集を回避するために測定する。培養は、収穫時のOD≤1を持っている必要があります。より高いODでの、細菌の凝集が増加し、生存率が低下する。 -80℃で保存する1ミリリットルずつ0.5％グリセロール、1 g / Lのアスパラギンを補充した7H11寒天プレート上に3つの独立したバイアルの10倍希釈系列をメッキすることによって凍結ストック中の単位（CFU）を形成する生存コロニーの数、およびOADCを決定し、4後にコロニーを列挙する37℃でのインキュベーションの週以下に説明するように、エアロゾル感染を行う。

1. 慎重に解凍マウンテンバイクの既知のCFU力価の株式や27 Gの針を取り付けた1ミリリットルの注射器を用いて細菌の塊を分散させるために、サスペンションを5回混ぜる。エアロゾルの生成を避けること。
2. 希望の感染量に応じて、中にマイコバクテリア株の必要な量を転送滅菌PBSを含む50mlチューブ。最終容量を6 mlである。注：この懸濁液中の微生物の数を変えることにより、エアロゾル液滴を有する細菌の割合が変化する。私たちは通常、肺（低用量感染症）あたり100の生菌の取り込みを目指す。我々の経験では、これは5.5ミリリットルを噴霧しているそのうちの6ミリリットルの全容量で約1〜2×10 ⁶マウンテンバイク/ ML（下記参照）が必要です。それはあなたの感染のための理想的な条件を見つけるために、細菌の異なる濃度の実験的なエアロゾル一連の課​​題を行うことをお勧めします。 5細菌のようないくつかが正常にエアロゾルによってマウスを感染させるために使用することができるように、最大​​5,000マイコバクテリアによる高用量の感染は、感染プロセスをスピードアップするために行うことができる一方。感染率は、一般的に100％である。
3. 接種力価を決定するためにメッキする（必要な最終容量を超えて製造した）十分なボリュームを削除し、我々は通常、技術的な三連のプレートに500μLを削除します。
4. 動物を所定の位置に区画メッシュバスケット（バスケットごとに1つのマウス）の円形エアロゾル室内およびエアロゾル室の蓋を閉じます。注：他のモデルは、20匹のマウスを収容することができ、それぞれが5個々の区画で構成パイ形のバスケットを装備している。
5. 3ステンレス製の接続ソケットにベンチュリーネブライザユニットを取り付けます。
6. 18 G鈍針が装着さ10ミリリットル注射器で50mlチューブからマイコバクテリア懸濁物を削除して、閉じた輸送箱にエアロゾル室に注射器を運ぶ。
7. ネブライザユニットのスクリューキャップを外し、慎重にネブライザーにマイコバクテリア懸濁物を注入する。エアロゾルの生成を避けること。 Buraton 2％鋭利物容器の中に注射器を廃棄する。スクリューキャップを噴霧器を密封する。
8. 主電源スイッチとUVランプのスイッチをオンにします。コントロールキーパッドの表示が「グラス-COL装置株式会社」を示しています。
9. プログラムスイッチをオンにします。ディスプレイ意志ショーは「噴霧器の準備ができている？」「バスケットがセットされていますか？ "準備ができたらenterを押して"。 Enterキーを押して入力します。
10. ディスプレイに "予熱時間900を入力してください"示し、これは（排気を除染）焼却炉のための予熱時間は900秒であることを意味します。 Enterキーを押して入力します。
11. ディスプレイに "時間1800を噴霧入力してください」と表示されますが、これは、噴霧時間はデフォルトとして1800秒に設定されていることを意味します。噴霧時間を延長するためには、「2400」を入力し、Enterキーを押します。 NOTE：噴霧サイクル中、圧力下の空気がマイコバクテリアを含む小さなエアロゾル液滴を生成し、懸濁液を霧化する。主空気流と、これらの液滴（サイズが約2〜5μm）をエアロゾル室に搬入される。
12. ディスプレイには「CDタイム18​​00を入力してください」と表示されますが、これは崩壊サイクルが1800秒を取ることを意味します。 「2400」と入力し、Enterキーを押しますに設定します。注：このサイクルの間、雲がuで構築されている噴霧サイクル中のエアロゾル室におけるPが減衰することができます。小さな液滴は、実験動物に吸入される。
13. ディスプレイに「12月の時間900を入力してください」と表示されますが、これは紫外線除染サイクルは900秒かかることを意味します。 Enterキーを押して入力します。マシンは、予熱、噴霧、雲の崩壊とUV除染を巡回を開始します。
    注意：前記サイクルが開始さを噴霧する際の圧縮エアフローメータ10立方フィート/時（チェックし、それに応じてエアコントロールバルブを調整する真空流計は、（必要に応じて真空制御弁を調整する予熱サイクルが開始したときにチェックする）60立方フィート/時間を示すべきである）。
14. サイクルが完了すると、キーパッドは「プロセスが完了 - 検体を削除」が表示されます。プログラム、UVおよび主電源スイッチをオフにします。
15. マイコバクテリア懸濁液が完全に噴霧していない場合は、慎重に装着し、適切な注射器で懸濁物を除去することによって、残りの容量を記録されていないか確認してください18 Gの鈍針。残りの容量を超える1ミリリットルであってはならない。
16. 関節からネブライザを取り外し、2時間の最低2％Buratonを含む鍋に入れて、通常の消毒は、O / N行われますその後、新鮮なパンにネブライザーを転送し、水で十分に洗い流してください。空気乾燥、噴霧器を残す。
17. エアロゾル室を開いて、ケージに動物を返します。オートクレーブバッグやオートクレーブ内のバッグはバスケット。 安全上の理由から、動力付き空気清浄呼吸器には、この手順の間に着用する必要があります：2％Buraton注エアロゾル室内の表面を拭いてください。
18. 7H11寒天プレート上の技術的な三連のプレート10倍希釈液（3×100μl）を（ステップ1.3参照）マイコバクテリア懸濁液の残りの500μLを使用した。

2。肺内の所望のCFUの取り込みを確認してください

実験動物のエアロゾル感染後のある日は、細菌のLOを決定所望のCFUの取り込みを確認するために指定された対照動物の肺における広告。注：私達は通常、1日目のCFU決定のために3〜5匹のマウスの追加のグループを指定します。

時間をかけてのMtb感染の経過を監視するには、マイコバクテリア組織負担は、CFU決定のための全臓器ホモジネートの連続希釈液をメッキすることで調べることができます。肺は、しかし、脾臓、肝臓、リンパ節は通常、それに応じて分析され、結核の病気の症状のプライマリ·サイトである。めっきされる希釈物は、組織中、ならびに臓器へと時点で異なる細菌負荷を生じさせる初期接種（高用量対低用量）に依存器官における予想マイコバクテリア負荷に依存分析される。低用量感染時に、肺でのマウンテンバイク菌H37Rvの細菌負荷は通常、一日25〜30の間でプラトーに達する。

1. CO ₂窒息または：安楽死させた動物（安楽死を配置クラスIIバイオセーフティキャビネット内で解剖ボード上の吸収紙の端子麻酔）および70％エタノールでマウスを消毒。注：70％アルコールが表面だけ除染するためのものであり、マウンテンバイクを殺すことはありません。
2. 腹部の真ん中に小さな切開を作り、頭の上にマウスの皮膚を撤回。
3. 外科はさみで腹部と胸郭を開き、肺がアクセスできるように胸壁を削除します。
4. 肺を除去し、均質化緩衝液（無菌水/ 1％v / vのTween80を/ 1％重量/容量アルブミン）にて15mlチューブに移す。
5. の5mlシリンジのプランジャを使用すると、小さなペトリ皿に100μmの篩を介して肺に負担。
6. 1ミリリットルピペットバリアチップを搭載し、8寒天プレート間の肺ホモジネート配布使用してフラッシュするモレキュラーシーブの数倍（CA 250μL/プレートを、彼らはよく乾燥させて表面を有していることを確認してください）。
7. 慎重に2パーセントに廃棄される使い捨てのスプレッダーを使用してサンプルプレートBuraton。
8. キャビネット内部を乾燥さ寒天プレートにしておきます。 、パラフィルムで一つ一つのプレートをシールアルミホイルで包み、少なくとも4週間、37℃で直立インキュベートする。

3。エスケープ防蚊ケージの構築

齧歯類マラリア原虫株は人体に有害ではありません。 MTB-感染したマウスは、寄生虫の受信者であり、作業はBSL 3条件下で行われるので、予防措置をケージから逃げるの蚊を防ぐために必要です。計画された感染レジメンに応じて、オートクレーブ可能と金属フレームのケージまたは自作使い捨て再使用可能なケージを使用することができる。実験動物の咬傷感染によりマウス当たり蚊の定義された数によって実施される必要がある場合は、後者をお勧めします。自作ケージが必要な場合は、蚊の健康などの仕様は完全ではケージを用意し、実験室での安全性は、そのSOUに依存ND建設（ 図2）。

1. このようなハーフパイントアイスクリームカートンや紙コーヒーカップ（ 図2）のようにカートンを取る。
2. カートンの側面に小さな開口部をカットし、蚊のための安全な入り口を作成するには、それぞれの作品に切ったスリットとラテックスの二重の層でカバーしています。注：開口部には、2センチメートル×2cmの全体的なサイズ、我々が持って使用してチューブ（吸引器デバイス）および/または取り出し蚊が変更された15ミリリットルファルコンチューブで真空ポンプに取り付けられており、それゆえとして機能しています直径1.5cmと吸引器。
3. ドリップを吸収するためにカートンの内底部にフィルター紙をテープで固定します。
4. ネッティング（ナイロンメッシュの二重層、サイズ1ミリメートル×1ミリメートル）でアイスクリームのカップを閉鎖し、テープとゴムバンドでカートンに固定します。
5. マウスあたり蚊の定義された番号が必要とされる感染実験のために、10〜15で感染した蚊のケージを調製し、その各々は、理想的にはAVが含まれている万野生型唾液腺Pのerage ベルゲイスポロゾイト。
6. 理想的には、前に血粉の実行に24時間蚊を飢えさせる。

4。蚊に刺されによるマウスのマラリア感染

本明細書中で使用されるげっ歯類のマラリア原虫はPです。 ベルゲイしかし 、目的の任意の他の齧歯類マラリア原虫株を使用することができる。スポロゾイト送信のために感染性の蚊を得るために、寄生虫のライフサイクル全体を、脊椎動物宿主（マウス）および蚊ベクターの両方で維持される。寄生虫メンテナンスは昆虫館で行われる。自然の伝送実験では、唾液腺あたりのスポロゾイトの最小数は1万以上あってはならない。寄生虫·メンテナンスの詳細なプロトコルのために我々はモルらによってマラリア研究における方法を参照してください。、2013。

1. ケタミンでマウンテンバイクを40日間preinfectedナイーブマウスや動物を麻酔し（100 mg / kg）を腹腔内注射によっておよびキシラジン（7 mg / kg）の溶液（200μL/マウス）。注：マウンテンバイクとマラリア感染との間の時間は、基礎となる研究課題に応じて調整することができる。同様に、病原体の課題の順序は逆にすることができる、すなわち、マウスは従来のMtb感染に対する感染性の蚊に暴露することができる。
2. 蚊のケージ（マウスの比率定義された蚊のための蚊のケージ当たり1マウス）の相殺に麻酔したマウスを置き、蚊が10〜15分間、膜を通して供給することができます。注：蚊の腸内の血液の存在は摂食ので、スポロゾイト送信を意味します。
3. 背中をケージにマウスを移し、麻酔から目覚めまで、絶えず監督。注：場所のペーパータオルの上ではなく、寝具上のマウス（窒息のリスク）と保温（緊密に行われ、紙タオルで体をカバー）。
4. 正味を通じて70％エタノールまたは他の消毒剤を噴霧することにより蚊を殺すケージのING。オートクレーブケージや使い捨てのものが使用された場合廃棄します。

5。監視寄生虫

1. 穿刺尾は針で一番最後に静脈やスライドの両端に血の一滴を収集します。
2. スライドの長さの半分以上の血液1滴を引っ張って別のスライドを使用しています。二スミアのために他のエッジを使用するようにスプレッダー裏返し。空気乾燥スライドしたままにします。
3. ギムザ染色
   1. スライドホルダーにス​​ライドを置き、無水メタノールでの短時間の浸漬することによって血液塗抹標本を固定します。注：ガラス製品の使用は、我々はすべてのソリューションのためのポリプロピレンキュベットを使用BSL 3で最小に保たれるべきであるので。
   2. ギムザ（脱イオン水中1:10）での塗抹標本を浸します。 10分後、余分な汚れを洗い流すために脱イオン水で数回満たされた染色キュベットの内外にスライドを浸し。
   3. 最後に、垂直位置での空気乾燥スライドする。
4. ALTERNATIVE STAIN：ライト＆＃180、S染色
   1. メタノール中1ミリグラム/ mlの濃度でライト染色を溶かす。
   2. 使用前に折られたフィルターでろ過する。
   3. 染色液に血液塗抹標本を浸し、4分間インキュベート（注：染色液をベースメタノールであるように、スミアのメタノール固定は必要ありません）。
   4. 上記のように脱イオン水にスライドをすすぐことによって洗浄し、空気乾燥したスライドを残す。
   5. ギムザ/ライトの汚れが完了したら、そっとBuraton含有廃棄ポットに使用されるすべての試薬を移す。
5. 血液塗抹標本分析
   1. 油浸で100倍の倍率で光学顕微鏡で染色血液塗抹標本を分析します。
   2. 赤血球が単層に配列されている血液塗抹の領域に感染していないし、感染した赤血球を数える。
   3. 明確に定義された寄生虫血を達成するために、赤血球の単層を表示するビューの少なくとも10個の異なるフィールドを数える。
   4. カルキユル赤血球の数によって寄生さ赤血球の数を割り、100を掛けることによって（％）で相対的な寄生虫を食べました。

結果

マウンテンバイクとP.によるマウスの感染それぞれ自然な経路を介してベルゲイ 、 すなわちエアロゾルや蚊に刺され、すべての動物の一貫性と再現性の感染の結果（ 表^1）1。我々は最初の発生（prepatency）及び血液中の寄生虫の数（P.ベルゲイ寄生虫 ）と異なる器官でのマウンテンバイクの負担を、決定することによって、成功した感染症やマラリア、結核の両方の経過をモニターすることができます。感染性の蚊に刺されによる成功したマラリア原虫の伝送の例を表1及び図3に示されている。 4-5日後（ 表1及び図3A）血液段階の寄生虫の存在によって確認されるように、各マウスに10スポロゾイト感染蚊の供給は100％の感染率となった。重要なのは、我々は同じ実験GRの個々のマウスの血液中に、同様の寄生虫番号を検索OUP、一貫した再現感染蚊に刺された結果によってそのスポロゾイト送信を示す。 MTB-重複感染した動物のそれとナイーブ対照マウスにおけるprepatencyを比較することで、我々はそのprepatency若干マウンテンバイク （ 表1、図3B）でpreinfectedされていたマウスでは遅延している見ることができます^1。我々は以前に^1を報告しているように、我々は、図3（b）に示すように、毎日ギムザ染色した血液塗抹標本に寄生虫を監視することにより、マラリアのコース上のMtb同時感染の影響を判断することができます。

個々のマウス（ 図4A）との間の比較的低い変動と肺の中の細菌の成功沈着吸入暴露システムの結果を利用してマウンテンバイクによるマウスの感染。我々は、肺およびCFU決定により経時的に関心のある他の臓器中のマイコバクテリアの負荷に追従することができる。の肺におけるマイコバクテリア負荷例マウンテンバイクは、P.の非存在下または存在下でC57BL / 6マウスを感染させベルゲイは、 図4Bに示されている。

表1。蚊に刺されによるスポロゾイト送信後Prepatency。すべてのマウスがPの自然送信後血液段階の感染症を開発蚊に刺さでスポロゾイトをベルゲイ 。 ¹ PLoSのONEの許可を得て7（10）、e48110から適応。

実験マウス群（C57BL / 6）	10感染蚊に刺されによる挑戦	グループあたりの動物の血液段階陽性動物/番号の番号	平均prepatency [D]
ナイーブ	P.ベルゲイ	7月7日	4,4
MTBは、感染した	P.ベルゲイ	7月7日	5,5 D>

図1。実験手順の全体的なスキーム。C57BL / 6マウスを、グラス-コルエアロゾルチャンバ内のMtb含有エアロゾル液滴に晒されている。一日のエアロゾル感染後のMtbの取り込みは、肺のCFU分析によって検証する。 40日（結核感染マウスでは慢性的になっています） マウンテンバイクチャレンジ後、動物をPにさらされているベルゲイは蚊を感 ​​染させた。成功したスポロゾイトの送信を確認し、 マラリア原虫感染の経過をたどるために、寄生虫は蚊に刺された後の3日間を開始ギムザ染色した血液塗抹標本で毎日監視されている。

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図2。蚊のケージのスケッチは、感染性の蚊は、ハーフパイントのアイスクリームのカートンとしてカートンの内部に収容されている。小さな開口部は、カートンの側面に切断し、蚊のための安全な入り口を作成するには、それぞれの作品に切ったスリットとラテックスの二重の層で覆われている。濾紙片を垂れを吸収するためにカートンの内底にテープで固定されている。アイスクリームのカップはテープとゴムバンドでカートンに固定されている（ナイロンメッシュ）ネッティングで閉鎖されています。

図3。寄生された赤血球（スケールバー、20＆＃を示すライトの`sのステンド血液塗抹標本の血液寄生虫。a）実施例181;。マウス血液中のm）B）寄生虫を毎日ギムザ染色血液塗抹標本を分析することによってモニターした。重複感染マウスは、 マラリア原虫単独感染マウス（n = 10）に比べて減少寄生虫を持っています。結果は、平均±SDとして示されているが、*** P <0.001。 ¹ PLoSのONEの許可を得て7（10）、e48110より転載。

図4。肺内のマウンテンバイクの検出。C57BL / 6マウスを、エアロゾルマウンテンバイクの100 CFUでチャレンジし、40日後に、Pとの共感染された蚊に刺されによるベルゲイ 。A）ある日のエアロゾル感染後マウンテンバイク 、所望の数の取り込みは、CFU決定のために全肺ホモジネートをメッキすることにより確認した。B）細菌同時感染時のLの負荷は、CFU分析（d40/d0 のMtb）を介して3匹のマウスの肺溶解物において測定した。 12日の同時感染した後、肺溶解物を MTBコントロールのマラリアの重複感染の影響を判断するためにCFU分析に播種した。肺の中のMtb番号は、P.との同時感染の間に増加していることに注意してくださいベルグヘイ NK65。 X軸ラベル：同時感染後のMtb -infection/time後の時間。 ¹ PLoSのONEの許可を得て7（10）、e48110から適応。

ディスカッション

私たちは、マウスが生産的にマウンテンバイクやPで感染させることができる方法を説明しました感染の彼らの自然な経路を介してベルゲイ 。我々は実験的結核¹³やマラリア^12を研究する感染プロトコルを確立し、最近ではマウスモデル¹にマウンテンバイクとマラリア間の同時感染を研究するためにそれらを採用して適用します。

成功の感染症のための最も重要な工程は、所望の数字の両病原体の伝播である。彼らは時間をかけて生存能力を失うことになる、との株式もともと決定力価が最も可能性の高い、もはや正確でなくなるので、マイコバクテリア株は2歳以上であってはならない。その結果、感染用量は予想よりはるかに低いだろう。そのため、保存培養のCFU力価は数カ月ごとに決定されるべきである。同様に重要なのは最初の場所で標準化された栽培やマウンテンバイクの在庫の発生がある。このような培養条件媒体、補助剤、時間、容積がMtbの異なる株を用いた実験からのデータを比較できるようにするために標準化されるべきである。マイコバクテリアの培養中に凝集する傾向があり、従ってそれは同じ成長期に、標準化さ収穫細菌を培養条件を維持し、分注中に頻繁に再懸濁することが重要である。そうでなければ、CFU力価および感染の結果に大きなばらつきがある場合もあります。

均質に感染した蚊のバッチの生成は、別の重要なステップです。別の蚊は、個々のマウスを餌にするので、一つの感染実験に使用される蚊の全てが同じバッチから来て、蚊の90％以上が感染しているだけのバッチが使用されることが重要である。

現在のモデルは、単一の感染した宿主における免疫応答と比較することによって、重複感染宿主における免疫応答および免疫モジュレーションを分析するために使用することができる。我々はVAを適用することができますいろいろな読み取り方法は、よくこのような目的の組織または体液のサイトカインやケモカインを検出するための組織学、免疫組織化学、免疫細胞集団のフローサイトメトリー解析、またはPCRおよびELISAなどの方法論を確立しました。このようなマウスモデルは、特定の制限があることに留意すべきである。 マウンテンバイクに感染した人の大半は臨床症状の兆候の潜伏感染を開発する一方で、マウスは、進行性の肺の病理に慢性疾患を発症する。それでも、C57BL / 6マウスのMtb感染に対して比較的抵抗性であり、ヒト結核患者で観察されるような古典的な肉芽腫を発症しない。その結果、マウスでの免疫病理学的反応が適切でもない潜在も活性ヒト結核疾患を反映しない。ヒトおよびマウスでの潜伏と慢性疾患との間の不一致にもかかわらず、マウスは広範囲のMtb感染を制御し、調査する価値があり、必要不可欠なツールである宿主因子を同定し、研究するために使用されてきた感染症における免疫応答。重要なことに、Mtbの感染に対する感受性は、一般的に使用される近交系マウス系統間でかなり変動し、DBAまたはC3Hなどのより感受性系統共、単一の感染の研究に含めることができる。また、離れて本明細書に記載の病原体種から、関心のある任意の他のマイコバクテリウム種 （ 例えば、臨床分離株）を使用することができる。単一のマラリアモデルは、ヒトの疾患のあらゆる側面を複製しない間も同様に、様々なマウスモデルは密接に自然に獲得した人間のマラリア感染のさまざまな側面に似ているん。例えば、P.ベルゲイ ANKAとP.ヨエリ YM/17XLは広くPで、ヒト（ 熱帯熱マラリア原虫によって誘発される）重症マラリアのモデルを研究しているベルゲイ ANKAは、人間の脳malari S ^14,15のための優れたモデルとみなされている。 P.ベルゲイ NK65はhyperparasitaemia急性マラリア、貧血のための優れたモデルであり、最近でてきたマラリア関連急性呼吸窮迫症候群（ARDS ^MA-16）のための実験モデルとして記述。記載され共感染モデルを用いて、我々は最近、同時P.ことを示すことができたベルグヘイ NK65感染は、慢性結核^1を悪化させる。

離れて別のげっ歯類のマラリア原虫を使用してから、感染イベントの順序やタイミングは、基礎となる研究課題に応じて適用することができる。フィールドに、併用プラスモディウム感染症は、Mtbの感染または後発の時点で存在してもよい。いずれのシナリオでもマウンテンバイクやマラリアに対する免疫応答が異なる影響を受ける可能性があります。そのため、マウスはマウンテンバイクの感染の前または後のいずれか原虫スポロゾイトを感染させることができる。さらに、マウスは、異なる時間に挑戦することができる急性、慢性対上のマラリア誘発性免疫応答の影響を評価するためのMtb感染後結核。マラリア、結核の重複感染を研究するためのマラリア原虫を選択する際に重要なのは、一つは、いくつかの齧歯類マラリア原虫株は、特定のマウス系統の急性疾患を引き起こすとマウンテンバイクが免疫応答性の慢性および長期的な感染症を引き起こす間だけ数日から数週間以内に、感染に屈することに注意する必要がありますマウス。従って、重複感染のタイミングは、実験動物の早期死亡を回避するために重要である。

複数の病原体種との同時感染による宿主免疫の変調はよくわかっていないままです。重複感染宿主の免疫系との相互作用がマラリアと同時感染が病因、疾患の結果、ワクチン接種、免疫診断、および治療 ​​をどのように影響するかの理解に貢献していきます-我々の実験共感染モデルは、マイコバクテリウムを調査するための強力なツールが用意されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ブラトン	Schülke		有効成分:アルデヒド(ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、シュウアルデヒド、エチルヘキサナール)
ミドルブルック7H9	シグマ	M0178	Mtbブロス培養用ミ
ドルブルック7H11	BD Biosciences	283810	Mtb培養用寒天培地
ミドルブルックOADC濃縮培地	BD Biosciences	212240	Mtb培養染色
皿	科学サービス	E62542-12
24スライドホルダーW /ハンドル	サービス	E62543-06
Giemsas Azur-Eosin-Methyleneブルー溶液	メルクミリポア
ライト´s ステイン	シグマ	W0625
吸入暴露システム	グラスコール
ネブライザー-ベンチュリ	グラスコール
アイスクリームカップ	Häagen-Dazs		蚊のケージとして使用される
メタルフレームの蚊のケージ	BioQuip Products	1450A