非複製イヌアデノウイルス2型由来ベクターの作製と精製

過去数十年にわたり、アデノウイルス(Ads)由来のベクターは、遺伝子治療やワクチン接種、さらには腫瘍溶解性ウイルス療法¹においてその有効性を証明してきました。広告は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類から分離されたアデノウイルス科の非エンベロープ二十面体ウイルスです。1953年の発見以来、Adsはウイルスと細胞の相互作用を研究するモデルとして、また最近ではベクターベースの遺伝子送達システムとして、集中的に研究されてきました²。実際、Adsベースのベクターには、その広範な宿主範囲や十分に特徴付けられた生物学、遺伝子操作や増幅の容易さなど、多くの利点があり、大規模生産が可能です。

ヒトのAds ³に由来するベクターに対するヒト集団の既存の免疫に関連する臨床的困難を克服するために、私たちと他の人々はヒト以外のAds ⁴からベクターを導き出し始めました。さらに、非ヒトアデノウイルスベクターは、従来のアデノウイルス5型(Ad5)よりも、国内規制当局によるリスク評価における安全性とセキュリティの要件により準拠する必要があるため、獣医学での集団ワクチン接種に適しているようです。1990年代後半、私たちは最初の組換えCAV2を、Ad5 ⁵に由来するベクターに代わる非ヒト的な選択肢として報告しました。それ以来、数多くの研究により、CAV2ベクターが治療用または抗原性遺伝子導入に利用できる可能性が確認されています(^{レビュー6,7})。他のAdsと同様に、CAV2由来ベクターは安定しており、高力価で産生できるため、in vivoでの使用が容易になります。また、統合的ではないため、安全ですが、in vivo(>1年)で長期間にわたる導入遺伝子発現が可能です⁸。驚くべきことに、そしてヒトのAds血清型よりも優れているCAV2ベクターは、高度に神経向性であり、軸索^9,10において非常に効率的な逆行性輸送を示すことが示されています。この固有の特性は、組換えCAV2ベクターを使用して、これまで中枢神経系への遺伝子導入に一般的に使用されてきたレンチウイルスベクターにはほとんどアクセスできない特定の脳領域のニューロンを形質導入するというアイデアをもたらしました¹¹。

ここでは、マンハッタン株に由来する非複製CAV2ベクターを構築、生成、精製するための単純で古典的なプロトコルについて説明します。組換えCAV2ゲノムは、サイトメガロウイルス(CMV)初期プロモーターの下流にある目的の遺伝子(GOI)をクローニングすることによって構築され、ユビキタスな発現を提供します。CAV2ベクターのクローニング容量は~4.2 kbpで、大きなcDNAを発現させることができます。第2のステップでは、この発現カセットは、CAV2ゲノムのE1領域の代わりに相同組換えによって挿入され、Chartierらによって最初に説明されたように、非複製性ウイルス(dlE1)につながります。¹² 最後に、ウイルス粒子は、ゲノムプラスミドをCAV2-E1発現イヌ腎臓細胞株(DK-E1)にトランスフェクションすると産生され、ウイルスストックの濃縮および精製前に連続的に増幅されます。ここで説明する方法は、塩化セシウム(CsCl)グラジエントでの2段階の超遠心分離を使用し、高い最終力価(通常は10^{10 10} 感染性粒子/mL以上)の感染性粒子の濃縮を可能にします。その後、ウイルス懸濁液は、使い捨てのSephadex G-25カラムを介してクロマトグラフィーによって脱塩されるため、最終的にはin vivoで直接使用できるほどの純度になります。

1. 非複製CAV2ゲノムプラスミドの構築

注:このプロトコルに記載されているすべてのプラスミドは以前に説明されており⁷、リクエストに応じて利用可能です。

1. 適切な制限酵素を使用して、GOIをpShuttleプラスミドにクローニングし、pShuttle-GOIを生成します(図1A)。
2. pShuttle-GOIの2 μgをAscI/PacIでダイジェストします。この消化により、プラスミド骨格(2.8 kbp)からShuttle-GOIフラグメント(~2.9 kbp + GOI ORF配列)が放出されます。
3. アガロースゲル電気泳動後のShuttle-GOIフラグメントを、NucleoSpin GelおよびPCR Clean-up kitを用いて精製します。
4. 並行して、1 μgのpCAV2ゲノムプラスミドをSwaIで消化します。pCAV2プラスミドは、E1領域内にユニークなSwaI部位を含んでいます(図1B)。この制限酵素を65°Cで20分間熱不活
化します。
5. コンピテント大腸菌BJ5183細菌を精製したShuttle-GOIフラグメント500 ngと直鎖状pCAV2プラスミド100 ngで形質転換し、相同組換えを行います(Figure 1B)。LB-Ampプレートに広げます。プレートを37°Cで少なくとも20時間インキュベートします。
6. EmeraldAmpマスターミックスとフォワード(5'-CACGAGGCCCTTTTTCGTCTTCAA-3')およびリバース(5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3')プライマーを使用して、次のサイクリング条件下で細菌コロニーに直接PCR解析を実施します:95°Cで10分間(1サイクル)、95°Cで1分間、58°Cで1分間、72°Cで1分間(39サイクル)、 最後に72°Cで5分間。1 kbp + GOI ORF配列の産物はpCAV-GOI陽性クローンから増幅されますが、陰性クローンではPCR産物は検出できません。
7. シェーカー(220rpm)で37°Cの5 mlのLBアンプ培地に、少なくとも2つの陽性コロニーをそれぞれ一晩接種します。
8. Nucleospin plasmid kitを使用してプラスミドDNAを抽出します。有能な大腸菌DH5α細菌を各DNA調製物のアリコートで形質転換します。細菌懸濁液をLB-Ampプレートに広げ、37°Cで一晩インキュベートします。
9. 各陽性クローンの2つのコロニーを、37°CのLBアンプ培地でシェーカー(220rpm)に一晩接種します。Nucleospin plasmid kitを用いてプラスミドDNAを抽出します。
10. 得られたDNAと親のpCAV2プラスミド(コントロールとして)をNdeIで消化します。親pCAV2の制限パターンは、14.8 kbp、9 kbp、7.9 kbp、および1.6 kbpです。GOI発現カセットは、7.9 kbpフラグメント内に挿入され、少なくとも1つのNdeI部位、すなわちカセット内の1つとGOIに存在する可能性のある部位を含んでいます。
11. ポジティブコンストラクトを選択し、少なくとも 2 つの独立したクローンを使用してステップ 2 に進みます。

2. 組換えCAV2ゲノムプラスミドのDK-E1細胞へのトランスフェクション

注:CAV2由来の非複製ベクターは、バイオセーフティレベル2(BSL-2)に分類される遺伝子組み換え生物ですが、動物モデルでの使用はBSL-1に分類されます。個人用保護具を含む適切な封じ込めおよび廃棄物処理手段を使用し、BSL-2層流フードの下で作業してください。

1. トランスフェクションの前日に、DK-E1細胞を6ウェルプレートに播種します。7%の熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、1 mMピルビン酸ナトリウム、および100 U/mlペニシリン/100 μg/mlストレプトマイシンを含む高グルコースのダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)で、37°Cおよび5%_CO2で細胞を増殖させます。トランスフェクションのためには、細胞は70〜80%コンフルエントである必要があります。
2. pCAV-GOIプラスミド2 μgをAscIで消化し、プラスミドの非ウイルス配列を遊離させます。得られた制限パターンを0.8%アガロースゲル電気泳動で確認します。消化により、組換えゲノムを含む~31 kbpのフラグメントと、プラスミド骨格に対応する2 kbpのフラグメントが得られるはずです。
3. 消化したDNAを200 μlのJet Prime Bufferと10秒間ボルテックスして混合します。4 μlのJet Primeを加え、10秒間ボルテックスして混合します。短時間スピンして液滴を除去し、室温で10分間インキュベー
トします。
4. トランスフェクションミックスを細胞に滴下します。プレートを静かに振とうして混合物を均一に分散させ、37°Cでインキュベートします。

3. 組換えCAV2の伝播

1. トランスフェクションの1週間後、細胞と培地を15 mLのポリプロピレンチューブに集めます。3回の凍結融解サイクル(-80°C/37°C)で細胞を破壊し、1,800 x gで10分間遠心分離してライセートを清澄化します。
2. 上清を採取し、その後のウイルス増殖のために-20°Cで保存します。
3. 6ウェルプレートの1ウェルで増殖したDK-E1細胞の80〜90%コンフルエント単層に、0.5 mLのウイルス含有上清を感染させます。37°Cで1時間、軽度の攪拌下でインキュベートします。接種物を取り出し、5% の熱不活化 FCS を含む 1.5 ml の完全 DMEM と交換します。
4. 細胞を37°Cで3〜4日間インキュベートします。細胞は、細胞変性効果の出現について毎日監視する必要があります(CPE、図2A-B)。明確なCPEが見られない場合は、培養の4日後に細胞を回収し、手順3.1〜3.4を繰り返します。
5. 透明なCPEが大多数の細胞に影響を与える場合、通常は2〜4回のウイルス増幅ラウンドの後、培養培地で細胞を回収し、上記のように3回凍結融解します。直径10 cmの組織培養皿3個で増殖させた80〜90%のコンフルエントDK-E1細胞に、毎回0.5 mLのウイルス含有上清を使用して感染させます。
6. 3〜4日後(CPEが完了したとき)、これらの10cm皿から細胞を回収し、再度3回の凍結融解サイクルでそれらを破壊し、1,800 x gで10分間遠心分離してライセートを清らかし、上清を収集して-20°Cで保存し、大規模なCAV2増幅を行います。

4. CAV2の大規模精製

1. 直径40 cm 10 cmの組織培養皿で増殖したDK-E1細胞の80-90%のコンフルエント単層に感染します。各皿には、FCSを含まない1 mlの完全DMEMで希釈した0.1 mlのウイルス含有上清を使用します。.細胞を37°Cで3〜4時間、穏やかな攪拌下でインキュベートします。5% FCSを添加した5 mLの完全DMEMを加えます。.
2. 3日間インキュベートします。50mlのポリプロピレンチューブに入った40 10 cmの皿から感染細胞を採取します。細胞を1,200 x gで4°Cで10分間ペレット化し、15 mLのDMEM培地に再懸濁します。
3. 3回の凍結融解サイクル(-80°C/37°C)で細胞を破壊します。1,800 x gで10分間遠心分離して細胞デブリを除去し、ウイルス粒子を精製する前に上清を-20°Cで保存します。
4. 不連続なCsClグラジエントを14 mLのUltra-Clearチューブに調製します。まず、チューブの底に2 mlのCsCl溶液(リン酸緩衝生理食塩水に1.40 g / ml)を注ぎます。次に、最初の溶液の上に2 mlのCsCl溶液(リン酸緩衝生理食塩水で1.25 g / ml)をゆっくりと加えます。
5. ウイルス上清をCsClグラジエントの上に慎重にロードします。チューブに上部から最大2〜3mmの鉱油を入れます。SW40ローターを揺らしながら、130,000 x g、18°Cで1.5時間遠心分離します。
6. 遠心分離後、2つのCsCl溶液層間の界面に2つの白いバンドがはっきりと見えます(図2C)。21 Gの針とシリンジを使用して、成熟したCAV2粒子を含む下部バンドを横から穿刺します。空のウイルス粒子に対応する上部バンドの収集をできるだけ避けてください。
7. 14 mLの透明チューブに、収集したウイルス粒子をCsCl溶液(リン酸緩衝生理食塩水1.34 g/mL)と混合して、連続的なCsClグラジエントを調製します。チューブに上部から最大2〜3mmの鉱油を入れます。スイングSW40ローターで130,000 x g、18°Cで18時間遠心分離します。
8. 遠心分離後、上記のようにシリンジで白いCAV2含有バンドバイサイドパンクチャーを回収します。繰り返しになりますが、残りのアッパーバンドを収集しないようにしてください。この連続的なグラデーションでは、2 つのバンドをより適切に分離できるため、これはより簡単になるはずです。収集された懸濁液の総量は2mlを超えてはなりません。
9. Sephadex G-25 PD-10カラムを30 mLのPBSで平衡化します。
10. ウイルス懸濁液をロードし、フロースルーを廃棄します。
11. 500 μlのPBS画分で溶出します。通常、脱塩されたCAV2粒子を含むフラクション5〜7を収集します。ウイルス含有画分は乳白色であるため、容易に同定できます。1.5 mLのCAV2懸濁液に150 μLのグリセロールを加え、-80 °Cでアリコートで保存してください。

5. エンドポイント希釈によるCAV2の滴定

1. 精製したウイルスのアリコートを氷上で解凍し、無血清DMEMで10倍段階希釈(10-2-10-12の範囲)を行います。
2. 各ウイルス希釈液を5ウェル96ウェルプレートに50μl加えます。各ウェルに1.5 x 10⁴ DK-E1細胞を添加します。プレートを37°Cおよび5%CO₂で5日間インキュベー
トします。
3. 感染後5日目に、顕微鏡観察によりCPEの外観を監視します(図2A-B)。感染力価は、Reed and Muenchの統計的方法¹³を用いて、組織培養感染線量の中央値(TCID₅₀)として決定される。

組換えCAV2ベクターの作製は、基本的でありながら重要な分子生物学的手法に依存しています。ウイルスベクターを作製する前に、導入遺伝子の発現カセットを持つ組換えCAV2ゲノムを構築することが実際に必要です。この構造には2つのステップが含まれます:まず、目的遺伝子(GOI)を発現カセットとしてシャトルプラスミドにクローニングします(つまり、プロモーターとポリアデニル化シグナルを使用)。この機能要素は、上流および下流の組換え領域を表す2つのCAV2由来ゲノム配列に隣接しています(図1A)。第2のステップでは、相同組換えを使用して、発現カセットをシャトルプラスミドからCAV2ゲノムに挿入します(図1B)。2つのDNA成分の直鎖化により、このステップの成功率が向上します(図1のpShuttleでのAscIおよびPacI消化、およびpCAV2でのSwaIの部位を参照)。GOI発現カセットの挿入は、組換えゲノムのE1の欠失につながります。

組換えゲノムプラスミドが得られたら、DK-E1細胞を補完するCAV2-E1を使用してウイルス粒子を産生します。感染細胞内で産生される大量のウイルス粒子による明らかな細胞変性効果は、明視野顕微鏡(図2A)または導入遺伝子発現(GFP発現CAV2ベクターの例、図2B)によって容易に可視化できます。新鮮なDK-E1細胞を用いて数回のウイルス増幅ラウンドを行った後、ウイルス粒子を塩化セシウムグラジエント上で超遠心分離することにより精製します。濃縮されたウイルス粒子は、セシウム勾配内に2つの乳白色バンドとして現れます(図2C)。上部の(軽い方の)バンドには、空の非感染性粒子が含まれているため、避ける必要があります。

得られた組換えCAV2ベクターは、in vitroまたはin vivoで、さまざまな種でほぼすべての細胞型を形質導入するために使用できます。ここでは、定位注射を用いたマウス中枢神経系の形質導入という応用例を紹介します。このプロトコールでは高力価で純粋なウイルスストックが得られるため、Dentate Gyrus(DG、図3、上)にPBSで希釈したGFP発現CAV2ベクター(5 x 105 TCID50)を1 μl注入すると、40〜50%のニューロン形質導入が起こります。さらに、CAV2は軸索で逆行性輸送する能力があるため、PBSで希釈したGFP発現CAV2ベクター2 μl(2 x 106 TCID 50)をマウス線条体に注入すると、黒質黒質部の黒質線条体ニューロンの約80%の形質導入が可能になります(SNpc、図3、下)。

図 1.相同組換えを用いた非複製CAV2ゲノムの作製を模式図示した。(A)CAV2ゲノムベクター(灰色)によっても共有される上流および下流の組換え標的配列(RS)を持つpShuttleプラスミドの概略図。このスキームは、AscIおよびPacI制限部位、CMVプロモーター、polyAシグナル、および目的遺伝子(GOI)を挿入するマルチクローニングサイト(MCS)の位置も示しています。(B)CAV2ゲノム配列とpShuttle-GOIプラスミドのAscI/PacI組換え配列との間の相同組換えの模式図。SwaIの制限部位(ゲノム線形化)とCAV2ゲノムの5'末端の特徴、すなわち内部末端反復(ITR)、カプセル化シグナル(φ)、初期のE1A、E1B、およびIXタンパク質をコードする遺伝子も表されます。相同組換えにより、E1AおよびE1B遺伝子の一部がGOI発現カセットで置換されます。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 2.CAV2の生産ステップの代表的な結果。(A-B)DK-E1細胞は、GFP発現CAV2ベクターの場合、明視野(A)または蛍光(B)を用いて観察され、顕微鏡法(100X)で観察されました。最初の増幅ステップまたはウイルス滴定では、細胞変性効果の個々の病巣が観察されます。(C)CAV2含有バンドは、不連続なCsClグラジエント遠心分離の終了時にはっきりと見え、上部のバンドは空の粒子に対応し、下部のバンドは成熟組換えCAV2に対応します。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図 3.CAV2を用いたCNS遺伝子導入の代表的な結果。CAV2を発現するGFPを、中枢神経系のさまざまな領域に定位固定法により注入しました。上の写真は、Dentate Gyrus(GD)に1 x 106 TCID50を、Cornus Ammonis 1(CA1)領域に5 x 105 TCID50を定位注射した後の、マウス海馬ニューロンの形質導入の代表的な結果を示しています。下の写真では、2 x 106 TCID50をマウスの線条体に定位固定的に注入し、線条体(STR、左下)または黒質pars compacta(SNpc、右下)でGFP染色をアッセイして、CAV2ベクターが1つのCNS領域から別のCNS領域に逆行的に輸送される能力を実証しました。GFP発現は、ベクター接種後2週間でアッセイしました。重要なことに、この時点では、活性化ミクログリア(図示せず)のIBA-1染色によってアッセイされたように、免疫反応はほとんど検出されませんでした。白いバーは100μmに対応しています拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

著者は開示するものは何もありません。