非複製イヌアデノウイルス2型由来ベクターの作製と精製

サマリー

この15年間で、イヌアデノウイルス2型(CAV2)由来のベクターは、in vitroおよびin vivoで細胞を形質導入する効率が証明され、ワクチン接種や遺伝子治療に広く使用されています。ここでは、CAV2ベクターを構築、作製、精製し、高力価のウイルス懸濁液を作製する手順について説明します。

要約

アデノウイルス(Ad)由来ベクターは、遺伝子治療とワクチンアプリケーションの両方で、短期または長期の遺伝子導入に広く使用されています。古典的に使用されているヒトアデノウイルス5型に対する既存の免疫が頻繁に存在するため、イヌアデノウイルス2型(CAV2)はヒト遺伝子導入の代替ベクターとして提案されています。CAV2の十分に特徴付けられた生物学は、遺伝子操作の容易さとともに、特に中枢神経系への遺伝子導入や、体液性免疫から細胞性免疫までの広範な防御免疫応答の誘導に大きな利点をもたらします。現在、CAV2は、ワクチンベクターとして使用するのに最も魅力的な非ヒトアデノウイルスの1つです。このプロトコルは、組換えCAV2ベクターを構築、生成、および力価を測定するための簡単な方法を説明しています。目的遺伝子の発現カセットをシャトルプラスミドにクローニングした後、大腸菌BJ5183細菌株の相同組換えにより組換えゲノムプラスミドを得る。得られたゲノムプラスミドは、補完的なCAV2-E1遺伝子(DK-E1)を発現するイヌの腎臓細胞にトランスフェクションされます。ウイルス増幅により、大量のウイルスストックを作製することができ、塩化セシウム勾配による超遠心分離により精製され、透析により脱塩されます。得られたウイルス懸濁液は、通常、1mlあたり10¹⁰感染性粒子を超える力価を持ち、in vivoで直接投与することができます。

概要

過去数十年にわたり、アデノウイルス(Ads)由来のベクターは、遺伝子治療やワクチン接種、さらには腫瘍溶解性ウイルス療法¹においてその有効性を証明してきました。広告は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類から分離されたアデノウイルス科の非エンベロープ二十面体ウイルスです。1953年の発見以来、Adsはウイルスと細胞の相互作用を研究するモデルとして、また最近ではベクターベースの遺伝子送達システムとして、集中的に研究されてきました²。実際、Adsベースのベクターには、その広範な宿主範囲や十分に特徴付けられた生物学、遺伝子操作や増幅の容易さなど、多くの利点があり、大規模生産が可能です。

ヒトのAds ³に由来するベクターに対するヒト集団の既存の免疫に関連する臨床的困難を克服するために、私たちと他の人々はヒト以外のAds ⁴からベクターを導き出し始めました。さらに、非ヒトアデノウイルスベクターは、従来のアデノウイルス5型(Ad5)よりも、国内規制当局によるリスク評価における安全性とセキュリティの要件により準拠する必要があるため、獣医学での集団ワクチン接種に適しているようです。1990年代後半、私たちは最初の組換えCAV2を、Ad5 ⁵に由来するベクターに代わる非ヒト的な選択肢として報告しました。それ以来、数多くの研究により、CAV2ベクターが治療用または抗原性遺伝子導入に利用できる可能性が確認されています(^{レビュー6,7})。他のAdsと同様に、CAV2由来ベクターは安定しており、高力価で産生できるため、in vivoでの使用が容易になります。また、統合的ではないため、安全ですが、in vivo(>1年)で長期間にわたる導入遺伝子発現が可能です⁸。驚くべきことに、そしてヒトのAds血清型よりも優れているCAV2ベクターは、高度に神経向性であり、軸索^9,10において非常に効率的な逆行性輸送を示すことが示されています。この固有の特性は、組換えCAV2ベクターを使用して、これまで中枢神経系への遺伝子導入に一般的に使用されてきたレンチウイルスベクターにはほとんどアクセスできない特定の脳領域のニューロンを形質導入するというアイデアをもたらしました¹¹。

ここでは、マンハッタン株に由来する非複製CAV2ベクターを構築、生成、精製するための単純で古典的なプロトコルについて説明します。組換えCAV2ゲノムは、サイトメガロウイルス(CMV)初期プロモーターの下流にある目的の遺伝子(GOI)をクローニングすることによって構築され、ユビキタスな発現を提供します。CAV2ベクターのクローニング容量は~4.2 kbpで、大きなcDNAを発現させることができます。第2のステップでは、この発現カセットは、CAV2ゲノムのE1領域の代わりに相同組換えによって挿入され、Chartierらによって最初に説明されたように、非複製性ウイルス(dlE1)につながります。¹² 最後に、ウイルス粒子は、ゲノムプラスミドをCAV2-E1発現イヌ腎臓細胞株(DK-E1)にトランスフェクションすると産生され、ウイルスストックの濃縮および精製前に連続的に増幅されます。ここで説明する方法は、塩化セシウム(CsCl)グラジエントでの2段階の超遠心分離を使用し、高い最終力価(通常は10^{10 10} 感染性粒子/mL以上)の感染性粒子の濃縮を可能にします。その後、ウイルス懸濁液は、使い捨てのSephadex G-25カラムを介してクロマトグラフィーによって脱塩されるため、最終的にはin vivoで直接使用できるほどの純度になります。

プロトコル

1. 非複製CAV2ゲノムプラスミドの構築

注:このプロトコルに記載されているすべてのプラスミドは以前に説明されており⁷、リクエストに応じて利用可能です。

1. 適切な制限酵素を使用して、GOIをpShuttleプラスミドにクローニングし、pShuttle-GOIを生成します(図1A)。
2. pShuttle-GOIの2 μgをAscI/PacIでダイジェストします。この消化により、プラスミド骨格(2.8 kbp)からShuttle-GOIフラグメント(~2.9 kbp + GOI ORF配列)が放出されます。
3. アガロースゲル電気泳動後のShuttle-GOIフラグメントを、NucleoSpin GelおよびPCR Clean-up kitを用いて精製します。
4. 並行して、1 μgのpCAV2ゲノムプラスミドをSwaIで消化します。pCAV2プラスミドは、E1領域内にユニークなSwaI部位を含んでいます(図1B)。この制限酵素を65°Cで20分間熱不活
化します。
5. コンピテント大腸菌BJ5183細菌を精製したShuttle-GOIフラグメント500 ngと直鎖状pCAV2プラスミド100 ngで形質転換し、相同組換えを行います(Figure 1B)。LB-Ampプレートに広げます。プレートを37°Cで少なくとも20時間インキュベートします。
6. EmeraldAmpマスターミックスとフォワード(5'-CACGAGGCCCTTTTTCGTCTTCAA-3')およびリバース(5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3')プライマーを使用して、次のサイクリング条件下で細菌コロニーに直接PCR解析を実施します:95°Cで10分間(1サイクル)、95°Cで1分間、58°Cで1分間、72°Cで1分間(39サイクル)、 最後に72°Cで5分間。1 kbp + GOI ORF配列の産物はpCAV-GOI陽性クローンから増幅されますが、陰性クローンではPCR産物は検出できません。
7. シェーカー(220rpm)で37°Cの5 mlのLBアンプ培地に、少なくとも2つの陽性コロニーをそれぞれ一晩接種します。
8. Nucleospin plasmid kitを使用してプラスミドDNAを抽出します。有能な大腸菌DH5α細菌を各DNA調製物のアリコートで形質転換します。細菌懸濁液をLB-Ampプレートに広げ、37°Cで一晩インキュベートします。
9. 各陽性クローンの2つのコロニーを、37°CのLBアンプ培地でシェーカー(220rpm)に一晩接種します。Nucleospin plasmid kitを用いてプラスミドDNAを抽出します。
10. 得られたDNAと親のpCAV2プラスミド(コントロールとして)をNdeIで消化します。親pCAV2の制限パターンは、14.8 kbp、9 kbp、7.9 kbp、および1.6 kbpです。GOI発現カセットは、7.9 kbpフラグメント内に挿入され、少なくとも1つのNdeI部位、すなわちカセット内の1つとGOIに存在する可能性のある部位を含んでいます。
11. ポジティブコンストラクトを選択し、少なくとも 2 つの独立したクローンを使用してステップ 2 に進みます。

2. 組換えCAV2ゲノムプラスミドのDK-E1細胞へのトランスフェクション

注:CAV2由来の非複製ベクターは、バイオセーフティレベル2(BSL-2)に分類される遺伝子組み換え生物ですが、動物モデルでの使用はBSL-1に分類されます。個人用保護具を含む適切な封じ込めおよび廃棄物処理手段を使用し、BSL-2層流フードの下で作業してください。

1. トランスフェクションの前日に、DK-E1細胞を6ウェルプレートに播種します。7%の熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、1 mMピルビン酸ナトリウム、および100 U/mlペニシリン/100 μg/mlストレプトマイシンを含む高グルコースのダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)で、37°Cおよび5%_CO2で細胞を増殖させます。トランスフェクションのためには、細胞は70〜80%コンフルエントである必要があります。
2. pCAV-GOIプラスミド2 μgをAscIで消化し、プラスミドの非ウイルス配列を遊離させます。得られた制限パターンを0.8%アガロースゲル電気泳動で確認します。消化により、組換えゲノムを含む~31 kbpのフラグメントと、プラスミド骨格に対応する2 kbpのフラグメントが得られるはずです。
3. 消化したDNAを200 μlのJet Prime Bufferと10秒間ボルテックスして混合します。4 μlのJet Primeを加え、10秒間ボルテックスして混合します。短時間スピンして液滴を除去し、室温で10分間インキュベー
トします。
4. トランスフェクションミックスを細胞に滴下します。プレートを静かに振とうして混合物を均一に分散させ、37°Cでインキュベートします。

3. 組換えCAV2の伝播

1. トランスフェクションの1週間後、細胞と培地を15 mLのポリプロピレンチューブに集めます。3回の凍結融解サイクル(-80°C/37°C)で細胞を破壊し、1,800 x gで10分間遠心分離してライセートを清澄化します。
2. 上清を採取し、その後のウイルス増殖のために-20°Cで保存します。
3. 6ウェルプレートの1ウェルで増殖したDK-E1細胞の80〜90%コンフルエント単層に、0.5 mLのウイルス含有上清を感染させます。37°Cで1時間、軽度の攪拌下でインキュベートします。接種物を取り出し、5% の熱不活化 FCS を含む 1.5 ml の完全 DMEM と交換します。
4. 細胞を37°Cで3〜4日間インキュベートします。細胞は、細胞変性効果の出現について毎日監視する必要があります(CPE、図2A-B)。明確なCPEが見られない場合は、培養の4日後に細胞を回収し、手順3.1〜3.4を繰り返します。
5. 透明なCPEが大多数の細胞に影響を与える場合、通常は2〜4回のウイルス増幅ラウンドの後、培養培地で細胞を回収し、上記のように3回凍結融解します。直径10 cmの組織培養皿3個で増殖させた80〜90%のコンフルエントDK-E1細胞に、毎回0.5 mLのウイルス含有上清を使用して感染させます。
6. 3〜4日後(CPEが完了したとき)、これらの10cm皿から細胞を回収し、再度3回の凍結融解サイクルでそれらを破壊し、1,800 x gで10分間遠心分離してライセートを清らかし、上清を収集して-20°Cで保存し、大規模なCAV2増幅を行います。

4. CAV2の大規模精製

1. 直径40 cm 10 cmの組織培養皿で増殖したDK-E1細胞の80-90%のコンフルエント単層に感染します。各皿には、FCSを含まない1 mlの完全DMEMで希釈した0.1 mlのウイルス含有上清を使用します。.細胞を37°Cで3〜4時間、穏やかな攪拌下でインキュベートします。5% FCSを添加した5 mLの完全DMEMを加えます。.
2. 3日間インキュベートします。50mlのポリプロピレンチューブに入った40 10 cmの皿から感染細胞を採取します。細胞を1,200 x gで4°Cで10分間ペレット化し、15 mLのDMEM培地に再懸濁します。
3. 3回の凍結融解サイクル(-80°C/37°C)で細胞を破壊します。1,800 x gで10分間遠心分離して細胞デブリを除去し、ウイルス粒子を精製する前に上清を-20°Cで保存します。
4. 不連続なCsClグラジエントを14 mLのUltra-Clearチューブに調製します。まず、チューブの底に2 mlのCsCl溶液(リン酸緩衝生理食塩水に1.40 g / ml)を注ぎます。次に、最初の溶液の上に2 mlのCsCl溶液(リン酸緩衝生理食塩水で1.25 g / ml)をゆっくりと加えます。
5. ウイルス上清をCsClグラジエントの上に慎重にロードします。チューブに上部から最大2〜3mmの鉱油を入れます。SW40ローターを揺らしながら、130,000 x g、18°Cで1.5時間遠心分離します。
6. 遠心分離後、2つのCsCl溶液層間の界面に2つの白いバンドがはっきりと見えます(図2C)。21 Gの針とシリンジを使用して、成熟したCAV2粒子を含む下部バンドを横から穿刺します。空のウイルス粒子に対応する上部バンドの収集をできるだけ避けてください。
7. 14 mLの透明チューブに、収集したウイルス粒子をCsCl溶液(リン酸緩衝生理食塩水1.34 g/mL)と混合して、連続的なCsClグラジエントを調製します。チューブに上部から最大2〜3mmの鉱油を入れます。スイングSW40ローターで130,000 x g、18°Cで18時間遠心分離します。
8. 遠心分離後、上記のようにシリンジで白いCAV2含有バンドバイサイドパンクチャーを回収します。繰り返しになりますが、残りのアッパーバンドを収集しないようにしてください。この連続的なグラデーションでは、2 つのバンドをより適切に分離できるため、これはより簡単になるはずです。収集された懸濁液の総量は2mlを超えてはなりません。
9. Sephadex G-25 PD-10カラムを30 mLのPBSで平衡化します。
10. ウイルス懸濁液をロードし、フロースルーを廃棄します。
11. 500 μlのPBS画分で溶出します。通常、脱塩されたCAV2粒子を含むフラクション5〜7を収集します。ウイルス含有画分は乳白色であるため、容易に同定できます。1.5 mLのCAV2懸濁液に150 μLのグリセロールを加え、-80 °Cでアリコートで保存してください。

5. エンドポイント希釈によるCAV2の滴定

1. 精製したウイルスのアリコートを氷上で解凍し、無血清DMEMで10倍段階希釈(10-2-10-12の範囲)を行います。
2. 各ウイルス希釈液を5ウェル96ウェルプレートに50μl加えます。各ウェルに1.5 x 10⁴ DK-E1細胞を添加します。プレートを37°Cおよび5%CO₂で5日間インキュベー
トします。
3. 感染後5日目に、顕微鏡観察によりCPEの外観を監視します(図2A-B)。感染力価は、Reed and Muenchの統計的方法¹³を用いて、組織培養感染線量の中央値(TCID₅₀)として決定される。

結果

組換えCAV2ベクターの作製は、基本的ではあるが重要な分子生物学的手法に基づいている。ウイルスベクターを作製する前に、まず、目的遺伝子の発現カセットを組み込んだ組換えCAV2ゲノムを構築する必要がある。この構築は2つのステップで構成される。まず、目的遺伝子（GOI）を発現カセットとしてシャトルプラスミドにクローニングし（すなわち （プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む）。この機能エレメントは、上流および下流の組換え領域を表す2つのCAV2由来ゲノム配列によって挟まれている（図1A）。次に、相同組換えを用いて、シャトルプラスミドからCAV2ゲノムに発現カセットを挿入します（図1B）。2つのDNA成分を線状化させることで、このステップの成功率を高めることができます（〜の部位を参照）。 AscI および PacI pShuttleの消化および SwaI pCAV2における 図1）。GOI発現カセットの挿入により、組換えゲノム中のE1が欠損することになります。

ディスカッション

本明細書に記載されている簡単な方法は、十分に文書化されたAd5技術から適応されており、~4.2 kbpの典型的なクローニング能力を持つ非複製CAV2ベクターの効率的な生産を可能にします。時間の考慮事項に関しては、組換えCAV2ゲノムは通常2週間で生成されますが、ウイルス懸濁液の増幅、精製、力価測定にはさらに5週間かかります。

CAV2由来ベクターの最初のバッチの生産には時間がかかるように見えるかもしれませんが、CAV2の生産には6ウェルプレートの1ウェルの最初のトランスフェクションのみが必要であり、プラスミド生産、トランスフェクション試薬 などのコストが最小限に抑えられることを思い出してください。さらに、ウイルス粒子の最初のバッチが得られると、DK-E1相補細胞株の単純な感染によって増幅できます。ここでは、多くの研究室で一般的に利用できる技術である超遠心分離に基づいてCAV2粒子を精製する方法を提案しました。ただし、クロマトグラフィーを使用したCAV2ビリオンの精製も記載されています¹⁴。ほとんどの精製されたCAV2ウイルス懸濁液は、感染力価...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
制限酵素	ニューイングランドバイオラボ	各種
ジェットプライムトランスフェクションキット	ポリプラス	114-01
DMEM	ギブコ(ライフテクノロジーズ)	10567014
大腸菌 BJ5183 細菌	アジレント	200154
PD-10脱塩カラム	GEヘルスケア	17-0851-01
EmeraldAmp ポリメラーゼ	タカラ	RR320A
ヌクレオスピンプラスミドキット	Macherey-Nagel	740558.250
NucleoSpin ゲルと PCR クリーンアップ	Macherey-Nagel	740609.50
14 ml チューブ、ウルトラクリア	ベックマン	344060