セル通信解析のための単一細胞のマイクロインジェクション

Summary

私たちは、生きた細胞内のギャップジャンクションを介しセルラー通信を可視化し、いくつかの有用なヒントを提供するために、ルシファーイエローの単一細胞マイクロインジェクションを実行する方法をここで説明します。我々は、この論文は誰もが機能的ギャップ結合による細胞結合の程度を評価するために役立つことを期待しています。ここで説明するすべてのものは、原理的には、1,000ダルトン未満の分子量を有する他の蛍光色素に適合させることができます。

Abstract

Gap結合は、隣接する細胞の通信を可能にする細胞間チャネルです。この通信は、ギャップ結合を形成するための各隣接セルによる半チャネルの寄与に依存します。哺乳類の細胞では、ヘミチャネルは6つのコネキシン、4つの膜貫通ドメインを持つモノマー、および細胞質内のC末端とN末端によって形成されます。ギャップ結合は、イオン、セカンドメッセンジャー、および低分子代謝産物の交換を可能にします。さらに、シナプス伝達、心臓収縮、細胞増殖、分化などの生理学的プロセスにおける多くの形態の細胞コミュニケーションにおいて重要な役割を果たしています。Lucifer Yellowのシングルセルマイクロインジェクションを実行して、生細胞のギャップ結合を介した細胞コミュニケーションを視覚化する方法について詳しく説明します。機能的ギャップ結合では、色素がロードされたセルから接続されたセルに拡散することが期待されます。これは、蛍光の拡散をリアルタイムで評価できるため、ギャップ結合の研究に非常に有用な手法です。細胞とマイクロピペットの調製方法、マイクロマニピュレーターの使用方法、上皮細胞株への低分子量蛍光色素の注入方法について説明します。

Introduction

ギャップ結合は、隣接セル¹間の相互通信を可能にする細胞間チャネルです。この通信は、それぞれの間のチャネルを形成するコネクソンまたはヘミチャネルと寄与する二つ以上の隣接セルを接続します。哺乳動物細胞において、コネクソンは6コネキシンは、4つの膜貫通ドメイン及び細胞質²内のC及びN末端でのモノマーにより形成されます。ギャップ結合は^、イオンのみ、第二メッセンジャーおよび小代謝産物の流れを許容するが、また、シナプス伝達、心臓の収縮、細胞の増殖および分化^{3、4、5、6}のような多くの生理学的プロセスにおいて、セルラー通信の多くの形態、に寄与しません^7,8。また、ギャップ結合が関連付けされています癌^9、10、筋萎縮症^11、いくつかの遺伝病や脱髄疾患¹²を含む多くの疾患。

細胞間のクロストークのこのタイプは、いくつかの方法^{13、14、15、16}により評価することができます。本稿では、生きた細胞のギャップジャンクションを介しセルラー通信を可視化するためにルシファーイエローの単一細胞マイクロインジェクションを実行する方法を示しています。我々は、細胞およびマイクロピペット、マイクロマニピュレータの使用法および胸腺上皮細胞株でルシファーイエロー染料の注入を準備する方法について説明します。通常、この実験手順は、染料でロードセルに接続されたセルの平均値で分析することができました。また、この方法は、ギャップ未満の分子量を有する他の蛍光色素で使用することができます接合は、カットオフ約1,000ダルトンです。

Protocol

細胞の調製

1. 胸腺上皮細胞株（IT76M1）または細胞の培養物を維持インキュベーターにおいて試験される（37℃/ 5％CO _2）。
2. PBS 1×（このアイテム3回繰り返す）で細胞を洗浄。
3. 5分間細胞にトリプシンを追加します。
4. トリプシンおよび遠心分離（5分間800×gで）を有する細胞に10％FBS（ウシ胎児血清）と（項目1.3で追加されたトリプシンの体積の2回）培地を追加します。
5. 血球計で細胞をカウントします。
6. 細胞は、結合を可能にするために、互いに密着している必要として、細胞型に応じて細胞の濃度を調整します。注意：私たちのケースでは、我々は35ミリメートルペトリ皿当たり3×10 ⁵細胞を使用しました。

2.マイクロピペットの準備

1. 直径の最終的な0.2μmのガラスキャピラリーマイクロピペット（直径1.5mm）から指定されるように約30MΩの最後の抵抗を達成するために、マイクロピペットを引き出しますF "> ^17、18。
   注：別の方法として、注入ピペットを購入することができます。抵抗は、セルサイズに依存し、例えば、高抵抗の微小電極は、例えば^{、（100〜150MΩ）19}のために、膵臓の腺房細胞のために必要であろう。発生する可能性がある一般的な問題は、その後、マイクロピペットを妨害することができますし、前に濾過または遠心分離を必要とするかもしれないルシファーイエローソリューションの沈殿です。注射の前に、マイクロピペットは、障害物や中断¹³のいずれかのタイプがあるかどうかを検出するために、顕微鏡下で分析する必要があります。マイクロピペットは、生理食塩水の内部マイクロピペットの先端でLYを注入することによって試験することができます。

3.テストマイクロピペット

1. 150ミリモル/ LのLiClでルシファーイエロー溶液（5％）を調製し、注射器を用いて、マイクロピペットをロードしたり、埋め戻しにより（それLYソリューションに入れます）。
2. マイクロパイプを配置マイクロインジェクションのワークステーション上IT76M1細胞と35ミリメートルペトリ皿の上って、細胞培地にガラスマイクロピペットの先端を沈めます。マイクロピペットに焦点を当て、パルスを印加することにより、色素流れるテストを実行します。

4.シングルセルルシファーイエローマイクロインジェクション

1. その後、ゆっくりとマイクロマニピュレーターを用いて細胞にピペットを下げ、右高いマグニFiのカチオン（40X）を使用して、細胞層の上に顕微鏡の焦点を合わせます。
2. 先端が細胞膜に触れるのに十分近い場合、標的細胞を穿刺し、細胞内にLYを導入するための小さな過分極パルスを印加します。印加電圧は、注入される色素の正味の電荷に依存します。表1に示されるように代わりに、いくつかの他の色素は、この技術を用いて使用することができます。
   注：1KDaを使用することができるよりも、原理的にMWを有する任意の親水性染料が少ないです。ただし、転送速度は、重量と親水性に応じて変化させることができます。また、U使用される染料のnspecific転送が評価されなければなりません。
3. 細胞画像を色素注入後3分をキャプチャしたりタイムラプス顕微鏡（30 FPS）で小さな映画を作ります。
   注：同様のアプローチは、ひとみら^（2015）20に見ることができました。 図2に示すように、細胞間のブリッジによる通信（不完全な有糸分裂）、ギャップ結合を通過するが、推奨されている細胞間橋やナノチューブの特定の種類を通過しないローダミンデキストラン（2〜10キロダルトンまで）の同時注射を回避するために、 。

Results

これらの細胞は、43 ^21をコネキシンによって形成された機能的なギャップ結合を発現することが記載されたように、胸腺上皮細胞株IT-76MIは、ギャップ結合により色素の結合を評価しました。ピペットの先端の下に一つのセルに適用すると、図1は、ルシファーイエローの注入を示しています。数分後、接続されたセルは、ギャップ結合を介して蛍光色素の拡散を示す蛍光（アスタリスク）となります。細胞と時間蛍光になったために数を直接これらの細胞間のセルラー通信の度に関連付けられています。 図2は、胸腺上皮細胞におけるLYの注射および挿入（インサートd）はLYとローダミンデキストラン（10kDaの）の同時注射を示して示しています。予想されるようにローダミンデキストランが、その高い分子量のものではないがLYは、隣接セルに渡します。また、GJブロッカーの存在（インサートf）は、オクタノール、BLO周囲の細胞への色素の通過をcked。あるいは、特定の細胞またはGJの機能に対する薬物の効果の結合の程度を評価することができます...

Discussion

細胞間のチャネルによって透過性が^16を必要としているが、機能的な細胞間ギャップ結合の存在、膜不透過性トレーサーの使用を確認するために。フルオレセイン、第一の蛍光色素は、細胞から細胞へのカップリング^22、非接合膜³との間に透過性であり、したがって、ルシファーイエロー染料¹⁵で置換されている観察します。現在、蛍光トレーサーの多くの異なる種類の中で最良の選択肢を見つけるためには、実験の範囲や条件によって異なります。蛍光色素を用いた細胞の負荷の手順は、形態、単一細胞の機能と細胞間の転送の運動率の評価を可能にします。また、染料マイクロインジェクションは、cの程度ので、セル^21、23と^の間^のギャップ結合の生理学的役割のよりよい理解を可能にしますell...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ルシファーイエロー	シグマ	L0259
リチウム	シグマ	L4408PBS
タブレット	シグマ	P4417
RPMI	Sigma	R4130
ウシ胎児血清	Cultilab
トリプシン	Σ	T4799
振動絶縁テーブル	ニューポート	VH3036W-OPT	実験を振動から守り、細胞の損傷を避けるためには、振動絶縁テーブルが必要です
マイクロマニピュレーター	成茂	MMO-203	細胞マイクロインジェクションに必要なマイクロピペットを精密に調整できる装置です。
電流発生器	Digitimer	DS2	マイクロピペットに色素を流すには、マイクロピペット内部に電極を内蔵した電流発生器、または静電容量補償回路(旧電位計)または新パッチクランプ増幅器の電流注入機能を持つ増幅器を用いて1ナノアンペア以下の電流を流し、アース線をプレート皿に浸漬しました。あるいは、工場の推奨に従って、空気圧マイクロインジェクターで染料を注入することもできます。