セル通信解析のための単一細胞のマイクロインジェクション

サマリー

私たちは、生きた細胞内のギャップジャンクションを介しセルラー通信を可視化し、いくつかの有用なヒントを提供するために、ルシファーイエローの単一細胞マイクロインジェクションを実行する方法をここで説明します。我々は、この論文は誰もが機能的ギャップ結合による細胞結合の程度を評価するために役立つことを期待しています。ここで説明するすべてのものは、原理的には、1,000ダルトン未満の分子量を有する他の蛍光色素に適合させることができます。

要約

Gap結合は、隣接する細胞の通信を可能にする細胞間チャネルです。この通信は、ギャップ結合を形成するための各隣接セルによる半チャネルの寄与に依存します。哺乳類の細胞では、ヘミチャネルは6つのコネキシン、4つの膜貫通ドメインを持つモノマー、および細胞質内のC末端とN末端によって形成されます。ギャップ結合は、イオン、セカンドメッセンジャー、および低分子代謝産物の交換を可能にします。さらに、シナプス伝達、心臓収縮、細胞増殖、分化などの生理学的プロセスにおける多くの形態の細胞コミュニケーションにおいて重要な役割を果たしています。Lucifer Yellowのシングルセルマイクロインジェクションを実行して、生細胞のギャップ結合を介した細胞コミュニケーションを視覚化する方法について詳しく説明します。機能的ギャップ結合では、色素がロードされたセルから接続されたセルに拡散することが期待されます。これは、蛍光の拡散をリアルタイムで評価できるため、ギャップ結合の研究に非常に有用な手法です。細胞とマイクロピペットの調製方法、マイクロマニピュレーターの使用方法、上皮細胞株への低分子量蛍光色素の注入方法について説明します。

概要

ギャップ結合は、隣接セル¹間の相互通信を可能にする細胞間チャネルです。この通信は、それぞれの間のチャネルを形成するコネクソンまたはヘミチャネルと寄与する二つ以上の隣接セルを接続します。哺乳動物細胞において、コネクソンは6コネキシンは、4つの膜貫通ドメイン及び細胞質²内のC及びN末端でのモノマーにより形成されます。ギャップ結合は^、イオンのみ、第二メッセンジャーおよび小代謝産物の流れを許容するが、また、シナプス伝達、心臓の収縮、細胞の増殖および分化^{3、4、5、6}のような多くの生理学的プロセスにおいて、セルラー通信の多くの形態、に寄与しません^7,8。また、ギャップ結合が関連付けされています癌^9、10、筋萎縮症^11、いくつかの遺伝病や脱髄疾患¹²

プロトコル

細胞の調製

1. 胸腺上皮細胞株（IT76M1）または細胞の培養物を維持インキュベーターにおいて試験される（37℃/ 5％CO _2）。
2. PBS 1×（このアイテム3回繰り返す）で細胞を洗浄。
3. 5分間細胞にトリプシンを追加します。
4. トリプシンおよび遠心分離（5分間800×gで）を有する細胞に10％FBS（ウシ胎児血清）と（項目1.3で追加されたトリプシンの体積の2回）培地を追加します。
5. 血球計で細胞をカウントします。
6. 細胞は、結合を可能にするために、互いに密着している必要として、細胞型に応じて細胞の濃度を調整します。注意：私たちのケースでは、我々は35ミリメートルペトリ皿当たり3×10 ⁵細胞を使用しました。

2.マイクロピペットの準備

1. 直径の最終的な0.2μmのガラスキャピラリーマイクロピペット（直径1.5mm）から指定されるように約30MΩの最後の抵抗を達成するために、マイクロピペットを引き出しますF "> ^17、18。
   注：別の方法として、注入ピペットを購入することができます。抵抗は、セルサイズに依存し、例えば、高抵抗の微小電極は、例えば^{、（100〜150MΩ）19....}

結果

これらの細胞は、43 ^21をコネキシンによって形成された機能的なギャップ結合を発現することが記載されたように、胸腺上皮細胞株IT-76MIは、ギャップ結合により色素の結合を評価しました。ピペットの先端の下に一つのセルに適用すると、図1は、ルシファーイエローの注入を示しています。数分後、接続されたセルは、ギャップ結合を介して蛍光色素の拡散を示す蛍光（アスタリスク）となります。細胞と時間蛍光になったために数を直接これらの細胞間のセルラー通信の度に関連付けられています。 図2は、胸腺上皮細胞におけるLYの注射および挿入（インサートd）はLYとローダミンデキストラン（10kDaの）の同時注射を示して示しています。予想されるようにローダミンデキストランが、その高い分子量のものではないがLYは、隣接セルに渡します。また、GJブロッカーの存在（インサートf）は、オクタノール、BLO周囲の細胞への色素の通過をcked。あるいは、特定の細胞またはGJの機能に対する薬物の効果の結合の程度を評価することができます.......

ディスカッション

細胞間のチャネルによって透過性が^16を必要としているが、機能的な細胞間ギャップ結合の存在、膜不透過性トレーサーの使用を確認するために。フルオレセイン、第一の蛍光色素は、細胞から細胞へのカップリング^22、非接合膜³との間に透過性であり、したがって、ルシファーイエロー染料¹⁵で置換されている観察します。現在、蛍光トレーサーの多くの異なる種類の中で最良の選択肢を見つけるためには、実験の範囲や条件によって異なります。蛍光色素を用いた細胞の負荷の手順は、形態、単一細胞の機能と細胞間の転送の運動率の評価を可能にします。また、染料マイクロインジェクションは、cの程度ので、セル^21、23と^の間^のギャップ結合の生理学的役割のよりよい理解を可能にしますell.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ルシファーイエロー	シグマ	L0259
リチウム	シグマ	L4408PBS
タブレット	シグマ	P4417
RPMI	Sigma	R4130
ウシ胎児血清	Cultilab
トリプシン	Σ	T4799
振動絶縁テーブル	ニューポート	VH3036W-OPT	実験を振動から守り、細胞の損傷を避けるためには、振動絶縁テーブルが必要です
マイクロマニピュレーター	成茂	MMO-203	細胞マイクロインジェクションに必要なマイクロピペットを精密に調整できる装置です。
電流発生器	Digitimer	DS2	マイクロピペットに色素を流すには、マイクロピペット内部に電極を内蔵した電流発生器、または静電容量補償回路(旧電位計)または新パッチクランプ増幅器の電流注入機能を持つ増幅器を用いて1ナノアンペア以下の電流を流し、アース線をプレート皿に浸漬しました。あるいは、工場の推奨に従って、空気圧マイクロインジェクターで染料を注入することもできます。

塩化