方法論記事

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

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DOI:

10.3791/50837

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2013年12月17日

 ,  ,  , 
1Nanomedicine Lab, UCL School of Pharmacy, University College London, 2Nanomedicine Lab, Faculty of Medical & Human Sciences, University of Manchester

この記事について

サマリー

この研究は、奇形腫を生成せずに、生体内での体細胞の多能性に向けた再プログラミングを示しています。ヤマンカ因子をコードするプラスミドDNAの流体力学的尾静脈注入を使用して、成体肝細胞の多能性が強化された細胞へのin vivoリプログラミングを誘導しました。

要約

定義された要因の強制発現による多能性状態への体細胞の初期化から生じる人工多能性幹（iPS）細胞は、再生医療のための新たな機会を提供しています。 iPS細胞のような臨床用途は、主に既存の再プログラミング方法論の効率が悪く、移植の際に腫瘍を形成する生成されたiPS細胞の危険性のために、これまで限定されていた。

我々は、多能性に向かって体細胞の再プログラミングは、再プログラミング因子の遺伝子導入によりインビボで達成することができるという仮説を立てた。効率的にin vivoで細胞を再プログラミングするためには、山中（OKSM）転写因子の高レベルは、標的組織で発現される必要がある。これは、標的組織に応じて、異なるウ​​イルスまたは非ウイルス性遺伝子ベクターを使用することによって達成することができる。この特定の研究では、プラスミドDNAの流体力学的尾静脈（HTV）の注射を配信するために使用したマウス肝細胞へのOKSM要因。これは実証的証拠大人のin vivoでの再プログラミング、高効率、高速な反応速度を持つ多能性状態への体細胞の提供。さらに、まだ腫瘍または奇形腫形成は、in situで観察されなかった。

これは、 インビボで体細胞を再プログラミングするプロトコルを実行し、将来の異なる組織タイプに適用することができるインビトロと比較して安全に効率よく、迅速に強化された多能性を誘導するために潜在的なアプローチを提供し得ると結論することができる。

概要

胚性幹細胞の使用に関する倫理的な懸念は、幹細胞研究の発展における制限の一つでした。しかし、山中教授らが4つの転写因子(Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc(OKSM))を強制発現させることで、体細胞を多能性細胞(iPS細胞)と名付けたin vitroでのリプログラミングにつながる可能性があることを発見したことで、新たな可能性が開かれました。ウイルス1-5および非ウイルス6-10遺伝子導入、タンパク質細胞質転座11,12、およびmiRNA13-16トランスフェクションは、今日iPS細胞を作製するために使用されているさまざまな方法の一部です。しかし、そのようなリプログラミング方法論は、臨床への応用を制限しているさまざまな問題に悩まされています。b)ウイルスベクターの主な使用;c)培養条件の長期的かつ多段階のプロトコル。d)in vitroで生成されたiPS細胞17-20の移植による腫瘍形成性のリスク。

レトロウイルスによる特定の転写因子3-5の遺伝子導入は、体細胞を再プログラムするために最も一般的に使用される方法です。しかし、挿入突然変異誘発、安定形質導入、および長期のがん原遺伝子発現の可能性によるリスクを含んでいます21,22。プラスミドDNA6,7,23や、リポソームやエレクトロポレーションを用いたRNA10導入などの非ウイルス性遺伝子導入ベクターも研究されています。ウイルスと比較して安全である一方で、これらのベクターは形質導入とリプログラミングの効率が大幅に制限されています24,25。

この新興分野の中心的なドグマの一つは、iPS細胞の生体内移植が制御不能な分化を引き起こし、3つの異なる胚葉からのさまざまな組織からなる腫瘍様腫(奇形腫)の形成につながるというものです。したがって、多能性へのリプログラミングの概念は、主に初代抽出体細胞(最も一般的には線維芽細胞)のin vitro操作に焦点を当ててきました。しかしながら、上述したように、この原理は、細胞の移植時に奇形腫形成または他の形態の腫瘍形成のリスクをそれ自体が高め得る治療(遺伝子導入、成長因子、抗生物質、抗酸化剤)の複数回のラウンドを含む、長く複雑な細胞培養プロトコルに苦しんでいる24〜28。

私たちは、OKSM転写因子の一過性の過剰発現による生体内の成体細胞の再プログラミングがその後の奇形腫の形成につながらないことを提案します29。それを達成する方法は、可能な限り安全な方法で標的組織内で高レベルの転写因子発現を達成することにかかっています。本研究では、細胞をin vivoで多能性に再プログラムするために、肝臓を効率的に標的とすることが示されている、確立されたウイルスフリー遺伝子導入技術を選択しました。この技術には、プラスミドDNAの大量で迅速な流体力学尾静脈(HTV)注入が含まれます30,31。この非ウイルス性遺伝子導入法により、成体肝細胞においてトランスフェクション遺伝子の高発現レベルを達成することができます。さらに、この技術は、ウイルスベクターの使用による潜在的なリスクを最小限に抑えます(例:永久ゲノム挿入、挿入突然変異誘発)。

プロトコル

1. pDNAのHTV投与による肝臓組織のin vivoリプログラミング

  1. 6週齢の雌のBalb/Cマウスを、処置が行われる前の1週間、動物施設に順応させます。
  2. 蒸留水に0.9%生理食塩水を調製し、0.22μmマイクロフィルターでろ過します。
  3. マウスあたり1.5 mLの0.9%生理食塩水中に75 μgのpCX-OKS-2Aと75 μgのpCX-cMycプラスミドDNAを含む溶液を調製します。手記：総注入量は、総体重の8〜10%でなければなりません
    注:注入前に、尾静脈が容易に視覚化され、拡張しているように見えるまで、マウスを37°Cの加熱チャンバーに保管してください。
  4. 注射前(加熱チャンバー内)および注射中(麻酔マスクを使用)にイソフルランによる麻酔を誘発する。
  5. HTV注入により、27GシリンジでpDNA溶液または生理食塩水コントロールを投与します。注:トランスフェクションを成功させるには、総量を5〜7秒以内に注入する必要があります。
  6. 動物が注射から適切に回復することを確認します。

2. qRT-PCR研究のための初代肝細胞の灌流と単離

  1. HTV注射の2、4、8、12、24日後などのさまざまな時点で、イソフルランによる深部麻酔を誘発します。
  2. 動物の腹部に70%エタノールをスプレーし、手術用ハサミで腹側正中線の皮膚を切開し、腹部の筋肉層を解剖して内臓を露出させます。
  3. 横隔膜をはさみで胸腔を露出させるように切断し、ロッキング鉗子でカバ静脈をクランプします。
  4. 内臓を右にずらし、肝臓の葉を動かして、下カバと門脈の両方に簡単にアクセスできるようにします。
  5. 22Gのカテーテルで下カバ静脈をカニューレし、過剰な圧力を避けるために門脈を切断します。
  6. 37°Cで予熱した10 mLのHBSS緩衝液(Ca2+およびMg2+を含まない、重炭酸塩を含む)で灌流を開始し、肝臓が白くなるまで10 mLのシリンジで緩衝液をゆっくりと灌流します(3分間)。
  7. 37°Cに予熱したLiver Digest Mediumを0.6 mL/minの流速(15分間)で、肝臓が腫れて緩むまで灌流を続けます。手記：過剰な消化と灌流は、肝細胞や再プログラムされた細胞に損傷を与える可能性があります。
  8. 4°Cで実験を続けます。
  9. 鎌状靭帯と冠状靭帯を切開した後、鉗子で肝臓を摘出し、肝細胞洗浄培地で洗浄し、100μmの細胞ストレーナーに通して細胞懸濁液を得ます。
  10. 細胞懸濁液を50 mLのチューブに集め、Hepatocyte Wash Mediumで容量を15 mLに調整します。
  11. 細胞懸濁液を50gで4分間遠心分離し、温度を4°Cに保ち、上清(Kupffer細胞と上皮細胞を含む)を廃棄し、細胞ペレット(肝細胞を含む)を10 mLの肝細胞洗浄培地に再懸濁します。手記： 細胞ペレットは非常に慎重に再懸濁されるべきであり、肝細胞は非常に壊れやすい細胞である。
  12. 遠心分離手順を合計3回繰り返し、最終的なペレットを10 mLの肝細胞洗浄培地に再懸濁します。
  13. 光学顕微鏡と血球計算盤を使用して細胞数を推定します。
  14. 2 x 106細胞のアリコートを調製し、300 x gで遠心分離してすべての細胞を回収し、上清を廃棄します。
  15. この時点で、細胞ペレットを凍結して-20°Cに保ってさらに処理するか、すぐにRNA抽出に使用できます。

3. 多能性遺伝子のアップレギュレーションのための単離肝細胞の遺伝子発現研究

  1. サプライヤーの指示に従って、スピンカラムキットを使用して2 x 106細胞からRNAを抽出します。
  2. 抽出した RNA 1 μg を使用して、供給業者の指示に従って 2 ステップの qRT-PCR を実施します。
  3. 生理食塩水を注射した動物の肝細胞をコントロールとして使用して、リプログラミング、多能性、および肝細胞マーカーの相対的な遺伝子発現を修正します。

4. タンパク質レベルでの多能性亢進のフローサイトメトリー解析

  1. 注射後1日目と4日目に、肝臓灌流を行い、上記のように初代肝細胞を単離します。
  2. 細胞密度を1 x 107 cells/mlに調整し、100 μlのアリコートを調製します。
  3. BD Cytofix固定バッファーで細胞を固定し、1x BD Perm/Washバッファーで透過処理します。
  4. 抗マウスOCT4-PerCP-Cy5.5または抗マウスNanog-PEのいずれかで細胞を30分間インキュベートします。
  5. ネガティブコントロールとアイソタイプコントロールを含めます。
  6. CyAn ADP High Performance Research Flow Cytometerで染色した細胞を解析します。

5. 多能性マーカーのための肝臓切片の免疫染色

  1. 注射の4日後、上記のように肝臓を灌流しますが、肝臓組織から血液を取り除くためにHBSSバッファーのみを使用します。
  2. 肝臓組織の一部を切断し、2-メチルブタン(液体窒素で予冷)に浸して、凍結切片を続行します。
  3. 凍結組織は、-80°Cに保持するか、クライオスタットを使用して厚さ14 μmの切片に直接切断することができます。
  4. ティッシュ切片を室温で1時間風乾し、メタノールで後固定し、-20°Cで10分間予冷し、15分間風乾した後、切片をPBSで2回(各5分間)洗浄します。
  5. ブロッキングバッファー(5% ヤギ血清-0.1% Triton、PBS pH 7.3)で切片を室温で1時間インキュベートした後、洗浄バッファー(1% BSA-0.1% Triton in PBS, pH 7.3)で2回の洗浄ステップを行います。
  6. 組織切片を抗OCT4、抗SOX2、および抗Nanog一次抗体を用いて4°Cで一晩インキュベートします。
  7. 翌日、切片を洗浄バッファーで3回(各5分)洗浄し、二次抗体と室温で1.5時間インキュベー
    8. トします。
  8. 肝臓切片をPBSで洗浄し(各5分、3回)、DAPIおよび退色防止剤を含む培地にマウントします。
  9. 落射蛍光顕微鏡でスライドを視覚化します。

6. 肝臓組織切片のアルカリホスファターゼ(ALP)染色

  1. 前述のように肝臓組織切片を取得します。
  2. 染色を行う前に、組織切片を室温で15分間温めます。
  3. 4%パラホルムアルデヒドで2分間固定します。注:固定時間が長すぎると、ALP活性が低下する可能性があります。
  4. 切片を30分間風乾した後、BCIP/NBT液体基質と37°Cで30分間インキュベートします。
  5. スライドを蒸留水で洗浄し、水性封入剤を封入します。
  6. 光学顕微鏡でランダムな画像をキャプチャします。

7. 肝臓毒性を評価するための血清中のアルブミンと肝酵素レベルの定量

化
  1. トランスフェクション後4日目、8日目、12日目、120日目に、心室から直接300μlの血液を採取します。
  2. 凝固を防ぐために、さまざまなサンプルを採取している間、血液を氷上に保ちます。
  3. すべてのサンプルの準備ができたら、血栓ができるまで37°Cで30分間インキュベー
    4. トします。
  4. サンプルを2,000 x gで5分間遠心分離します。
  5. 血清(上清中)を新しいエッペンドルフチューブに慎重にピペットで移し、サンプルが処理されるまで-80°Cで凍結します。
  6. アルブミン、ALT、AST、ALP、およびGLDHの血清レベルを分析します。

8. 肝毒性を評価するための肝切片のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色

  1. HTV注射の2日後、4日後、8日後、12日後、24日後、50日後、120日後など、異なる時点で、前述のようにのみHBSSバッファーによる肝灌流を行う。
  2. 肝臓組織の一部を切り取り、4%パラホルムアルデヒドで固定します。
  3. 肝臓組織をパラフィンブロックに埋め込み、H&EまたはPAS染色で切片化し、染色します。
  4. 光学顕微鏡でランダムな画像をキャプチャします。

結果

図1は、OKSMをコードするプラスミドのマウス肝臓への遺伝子導入と、in vivo細胞リプログラミングを観察するために行われたさまざまな手法の概要を示している。プラスミドのHTV注入後、注入から2日目に、導入したリプログラミング因子（Oct3/4、Sox2、Klf4、およびcMyc）のmRNAレベルにおける遺伝子発現の有意な上昇が観察された。図2aに示すように、これらの因子の発現は注入後の時間経過とともに減少する。内在性多能性マーカー（Nanog、Ecat1、およびRex1）の発現については、注入後2日目および4日目に、生理食塩水を注入した個体の肝細胞と比較してレベルが有意に上昇し、8日目以降はベースラインレベルに戻った(図2b)。同時に、肝細胞特異的遺伝子（Alb、Aat、およびTrf）のダウンレギュレーションにより、肝細胞集団の脱分化が確認された。これは4日目に統計的に有意であり、8日目以降にベースラインレベルに達した(図2d)。

Oct3/4およびNanogのタンパク質レベルでの発現をフローサイトメトリーにより検討した。図に示したように、 図 2cHTV注入後の1日目にはOct3/4のみが発現していましたが、内因性多能性マーカーであるNanogの発現には4日目まで待つ必要がありました。

in vivoでの細胞リプログラミングの発生は、抗OCT4、抗SOX2、および抗Nanog抗体を用いた肝組織の免疫組織化学的分析と、ALP活性の特異的染色によってさらに確認されました。すべてのマーカーおよび酵素活性に対して陽性となる細胞は、OKSMを注入した動物の肝組織において再現性をもって検出されましたが、生理食塩水を注入した対照群では検出されませんでした(Figure 3)。

pDNAのHTV注入によるin vivo細胞リプログラミングに伴う潜在的な毒性副作用およびテラトーマ形成について、血清中の肝酵素レベルの定量化、ならびに120日間にわたる肝組織切片のH&E染色およびPAS染色により検討した。2日目まで一過性で軽度の組織損傷の徴候が観察されたが、それ以降は認められなかった。研究期間中、テラトーマの形成や、異形成または形態学的変化の兆候は認められなかった(Figure 4)。アルブミンおよび肝酵素レベル、および組織切片のグリコーゲン染色で確認したところ、全個体において研究期間を通じて肝臓の構造的または機能的な異常は見られなかった(Figures 4b および cを参考)

生体内リプログラミング因子の注入、マウスの図解、プラスミド、組織分析、PCR、サイトメトリー。
図1. in vivo リプログラミング手順とその分析の概略図。プロトコルは、(i) リプログラミング因子の in vivo 投与と、(ii) 組織採取およびサンプル分析という2つの主要な段階で構成される。 ここをクリックして大きな図を表示。

遺伝子発現解析。日数経過に伴う相対的発現データを示す棒グラフ。図a-d。科学的結果。
図 2. 成就マウス肝臓における山中転写因子のin vivo過剰発現。Balb/Cマウスに0.9%生理食塩水のみ、または0.9%生理食塩水に溶解した75 μgのpCX-OKS-2Aおよび75 μgのpCX-cMycをHTV注射し、2、4、8、12、24日目に肝細胞のRT-qPCR解析を行い、以下の相対的遺伝子発現を決定した：(a) 導入した転写因子 (OKSM) および (b) 内因性多能性マーカー； (c) OCT3/4陽性およびNanog陽性細胞のフローサイトメトリー解析； (d)RT-qPCRにより決定した肝細胞マーカーの相対的遺伝子発現。すべての遺伝子発現レベルは、生理食塩水をHTV注射した群で正規化した。(* p<0.05は、分散分析およびTukeyの多重比較検定により、生理食塩水HTV注射群と比較して統計的に有意な差があることを示す)。図はYilmazer et al.29より引用。 こちらをクリックして拡大図を表示。

生理食塩水投与群とOKSM処理群におけるOCT4、SOX2、NANOGの免疫蛍光顕微鏡による比較
図3. 免疫組織化学による成体マウス肝組織のin vivo細胞リプログラミング。 Balb/Cマウスに、0.9%生理食塩水のみ、あるいは0.9%生理食塩水に溶解した75 μgのpCX-OKS-2Aおよび75 μgのpCX-cMycをHTV注入した。4日目に肝臓を回収し、凍結組織切片を抗OCT4、抗SOX2または抗Nanog抗体で染色して免疫反応性を評価した。また、BCIP/NBTを用いて組織内のALP活性を測定した（40倍）。スケールバーは100 μmを示す。図はYilmazer et al29より改変。 こちらをクリックして拡大図を表示。

生理食塩水投与群とOKSM治療群における肝組織学、酵素レベル、およびアルブミンの実験結果。
図4. 肝機能および肝組織病理に対するin vivo細胞リプログラミングの影響。0.9%生理食塩水に溶解した75 μgのpCX-OKS-2Aおよび75 μgのpCX-cMyc、または0.9%生理食塩水のみをHTV投与したBalb/Cマウス。2、4、8、12、50、および120日目に肝組織および血清を採取し、以下について解析した：(a) H&E染色、(b) 肝酵素レベル、(c) アルブミンレベル、(d) PAS染色。代表的な画像は光学顕微鏡（10X）で撮影した。スケールバーは100 μmを示す。図はYilmazer et al.29より改変。ここをクリックして拡大図を表示。

ディスカッション

この研究は、成体マウス肝臓へのOKSM因子の効率的な移動と過剰発現に続く多能性に向けた in vivo 細胞のリプログラミングの原理実証の証拠を提供します。qRT-PCR、フローサイトメトリー、IHC、血清分析などのさまざまな技術を使用して、標的組織を調査して、 in vivo 細胞の再プログラミングを観察しました。組織におけるOKSM因子の過剰発現の誘導から非常に急速に、多能性マーカーはmRNAおよびタンパク質レベルでアップレギュレートされました(48時間以内)。これらの実験を通じて、組織から抽出された細胞の5〜15%がNanogおよびOct3 / 4陽性であることが示されました。さらに、120日間を通じて肝臓に構造的または機能的異常は観察されませんでした。肝臓以外の組織(肺、脾臓、腎臓、心臓)におけるプラスミドDNAのHTV注入による導入遺伝子の発現は以前に報告されていますが、遺伝子発現レベルは肝細胞よりも少なくとも3桁低かった30。この研究のデータは、 in vivo での 多能性状態への体細胞の再プログラミングが安全、迅速、効率的であることを示しています。一般に、効率の1%未満で3週間以内に多能性(iPS)細胞生成を達成する既存の in vitro 細胞リプログラミング方法論の大部分を考慮して32、多能性への in vivo リプログラミングは非常に興味深い代替手段を提供する可能性があります。多能性への in vivo リプログラミングの概念は、高効率でさまざまなタイプの体細胞に適用できると仮定しています (使用されるベクターによって異なります)、 in vivo で再プログラムされた細胞で達成される機能的多能性のレベルを決定する必要があります。さらに、改良されたプロトコルと技術の開発により、 in vivo で再プログラムされた細胞を抽出し、再生医療の目的に利用できる可能性があります。

成体体細胞をin vivoで高効率で再プログラムするために、従うべきいくつかの重要なステップがあります。標的組織で高レベルの遺伝子発現を達成することが前提条件です。この研究では、HTV注射を使用してプラスミドDNAの肝細胞への効率的な導入と発現を利用することによって、これを説明しました。HTV注射の最も重要な要素は、動物の総体重の8〜10%であるべき量と、5〜7秒以内に実行しなければならない注射の速度です。HTV注射は肝臓の組織損傷を増やし、細胞のリプログラミングの効率に影響を与える可能性があるため、生後6週間未満のマウスは使用しないでください。Balb/CマウスとTNG-Aマウスの両方で同様のレベルのリプログラミングが以前に報告されているため、動物の遺伝的背景は、Nanog遺伝子座に挿入されたeGFPレポーターを運び、Sv129バックグラウンド29で繁殖するトランスジェニック株である。

OKSM因子が標的細胞に効率的に送達され、高レベルの遺伝子発現が可能であれば、多能性状態へのインビボ細胞リプログラミング(決定が必要)は、他の組織タイプにも適用できると推測しています。さまざまな細胞および組織型を標的とするために、さまざまな非ウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターが前臨床試験および臨床試験で研究されています33。例えば、神経組織または眼組織では、アデノ随伴ウイルスが効率的なin vivo遺伝子導入のための好ましいベクターの選択であったのに対し、筋肉組織では裸のプラスミドDNA注射が比較的高レベルの遺伝子発現をもたらすことが示されている38,39。したがって、遺伝子導入ベクターの方法は、多能性状態への効率的かつ迅速なin vivo細胞リプログラミングを達成するために、組織の種類に応じて慎重に選択する必要があります。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この研究は、Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC, Swindon, United Kingdom) と欧州委員会の FP-7 Programs NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) と ANTICARB (HEALTH-2008-20157) によって部分的に支援されました。 AYは、教育省(トルコ)からのフルタイムの博士課程奨学金によって支援され、ILはブリティッシュ・カウンシルとCAIXA財団(スペイン)からの部分的な支援を認めています。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
pCX-OKS-2A pDNAAddgene19771Addgeneから細菌刺し傷として入手、プラスミド工場(ドイツ)でプラスミド生産を行う
pCX-cMycAddgene19772Addgeneから細菌刺し傷として入手し、プラスミド工場(ドイツ)でプラスミド生産を行う
0.22 μmフィルターミリオポアSLGP033RS
イソフルランアボットB505
HBSS バッファーSigma-AldrichH6648Ca2+ および Mg2+ フリー、重炭酸
塩 肝臓消化媒体Gibco17703-034
肝細胞洗浄媒体Gibco17704-024
100 &ミュー;m cell strainerBD Biosciences352360
Nucleospin RNA II kitMacherey-Nagel740955.25Kit for RNA isolation from cells and tissues
iScript cDNA synthesis kitBio-Rad170-8890
iO SYBR Green SupermixBio-Rad170-8880
Oct3/4 フォワードプライマーSigmasequence given in commentsTGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA
Oct3/4 リバースプライマーシグマ配列 コメントで与えられたCTCAATGCTAGTTCTCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTC
Sox2 フォワードプライマーシグマ配列 コメントで与えられたGGTTACCTCTCTTCCCCCCACTCCCCAG
Sox2 リバースプライマーシグマ配列 コメントで与えられたTCACATGTGCGACAGGGGCAG
C-myc フォワードプライマーシグマ配列 コメントで与えられたCAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
C-myc リバースプライマーコメントで与えられたシグマTTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG
ナノグフォワードプライマーコメントで与えられたシグマCAGAAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG
ナノグリバースプライマーコメントで与えられたシグマGCAATGGATGCTGGGATACTC
Ecat1 フォワードプライマーシグマ配列コメントで与えられたTGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT
Ecat1 リバースプライマーコメントで与えられたシグマATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT
Rex1 フォワードプライマーシグマコメントで与えられたACGAGTGGCAGTTTTTTCTTGGGA
Rex1 リバースプライマーで与えられたシグマTATGACTCACTTCAGGGGGCACT
Alb フォワードプライマーシグマコメントで与えられたシーケンスGTTCGCTACACCCAGAAAGC
Alb リバースプライマーコメントで与えられた Sigma コメントで与えられたシーケンスCCACACAAGGCAGTCTCTGA
Aat フォワードプライマーコメントで与えられた Sigma シーケンスCAGAGGAGGCCAAGAAAGTG
Aat リバースプライマーコメントで与えられた Sigma コメントで与えられたATGGACAGTCTGGGGAAGTG
Trf フォワードプライマーSigmaコメントで示された配列ACCATGTTGTGGTCTCACGA
Trf リバースプライマー配列 シグマで示された配列ACAGAAGGTCCTTGGTGGTG
B アクチン フォワードプライマー配列 シグマで示された配列GACCTCTATGCCAACACGT
B アクチン リバースプライマーシグマコメントで示された配列AGTACTTGCTCAGGAGGA
BD Cytofix 固定バッファーBD バイオサイエンス
1x BD Perm/Wash bufferBD Biosciences560585
抗マウス OCT4-PerCP-Cy5.5BD Biosciences560585
抗マウス Nanog-PEBD Biosciences 560585
2-メチルブタンSigma-AldrichM32631
X100-TritonSigma-AldrichX100-500ML
ヤギ血清Sigma-AldrichG9023
BSASigmaA2153
rabbit pAb anti-OCT4Abcamab198573 μg/ml
rabbit pAb anti-SOX2Abcamab979591 μg / ml
ウサギpAbアンチNanogAbcamab808921 μg/ml
マウス mAb 抗 SSEA1Abcamab1628520 μCy3
で標識されたg/ml ヤギpAb抗ウサギIgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.111-165-003-JIR
Cy3で標識されたヤギpAb抗マウスIgGJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-165-003-JIR/250
VECTASHIELD封入剤をDAPIベクターラボラトリーズH-1200
BCIP/NBT液剤システムSigmaB1911
水封入剤Σ16
%パラホルムアルデヒドッシャーAA433689M液は16%
ヘマトキシリンで使用eosinSigmaGH53/HT110216
PAS 染色Sigma395B
配列 配列 配列 配列 コメント配列 コメントで示された コメント コメントで示された コメント560585、の1/250濃度で使用 1で使用 フィ、4%

参考文献

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