Caenorhabditis elegansをモデル系として使用して、多細胞生物におけるタンパク質恒常性を研究する

サマリー

タンパク質の恒常性、ストレス、老化の関係を研究するために、遺伝的に扱いやすい後生動物Caenorhabditis elegansをモデルシステムとして、タンパク質の機能不全、細胞内のタンパク質局在、生物、細胞、タンパク質レベルでのタンパク質安定性を追跡して、タンパク質のフォールディングの変化を監視しました。

要約

タンパク質の折り畳みと組み立ては、タンパク質の機能、細胞の長期的な健康、そして生物の寿命に不可欠です。歴史的に、タンパク質のフォールディングの機能と制御は、in vitro、単離された組織培養細胞、および単細胞生物で研究されてきました。最近の研究では、タンパク質の恒常性維持(プロテオスタシス)、代謝、発生、老化、および温度感知の間の関連が明らかになりました。これらの知見は、モデル後生動物生物Caenorhabditis elegansにおけるタンパク質のフォールディングをモニタリングするための新しいツールの開発につながった。私たちの研究室では、温度感受性または天然に存在する準安定タンパク質をフォールディング環境のセンサーとして使用して、行動アッセイ、イメージング、および生化学的アプローチを組み合わせて、タンパク質のミスフォールディングを監視しています。特定のタンパク質のミスフォールディングに関連するビヘイビアアッセイは、タンパク質のフォールディングを簡単かつ強力に読み取ることができ、フォールディングを調節する遺伝子や条件を迅速にスクリーニングすることができます。同様に、このようなミスフォールディングは、細胞内のタンパク質のミスローカリゼーションと関連している可能性があります。したがって、タンパク質の局在をモニタリングすることで、さまざまな組織で発生する細胞のフォールディング能力の変化、発生のさまざまな段階、および変化する条件に直面して発生する変化を浮き彫りにすることができます。最後に、ex vivoの生化学的ツールを使用して、タンパク質の安定性とコンフォメーションを直接監視できます。このように、行動アッセイ、イメージング、生化学的手法を組み合わせることで、生物、細胞、タンパク質のそれぞれでタンパク質のミスフォールディングを監視することができます。

概要

mRNAの転写、プロセシング、翻訳、タンパク質の折り畳み、転座、組み立て/分解など、タンパク質生合成のさまざまなステップの相互作用が、^{その機能のために}細胞タンパク質の品質管理機構に依存する準安定タンパク質の負荷を決定します1。したがって、タンパク質品質管理機構の不在または機能不全は、さまざまな種類の細胞機構の機能低下をもたらし、タンパク質のミスフォールディング病^2-7の発症をもたらす可能性がある。タンパク質のフォールディングおよびクリアランス機構の能力が準安定タンパク質の負荷とバランスをとると、タンパク質の恒常性(プロテオスタシス)が達成され、最終的に誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積と細胞内の凝集を防ぐ状態^{になります6}。ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積は、熱ショック因子(HSF-1)などのストレス誘発性転写因子を活性化し、細胞保護ストレス応答の活性化をもたらすシグナルであると考えられています^6,8。

後生動物におけるプロテオスタシスネットワークの機能についての私たちの理解は、主にin vitro再構成研究と組織培養細胞および単細胞生物9を用いた観察から導き出^{されています。}例えば、タンパク質損傷を予防し解決する分子シャペロンの研究は、シャペロンを介したタンパク質のフォールディング、脱凝集、転座のメカニズムに関する生化学的および細胞生物学的研究に焦点を当ててきた^10-13。それに比べて、「正常な」成長条件下で、そしてストレスに応答して、後生動物の異なる細胞および組織における様々なタンパク質静止成分の統合機能について利用できる情報は限られている¹¹。C.エレガンスでは、細胞タンパク質の品質管理も細胞非自律的に制御できるという発見は、温度を知覚する2つのニューロンの突然変異が熱ショック応答の活性化をブロックし、耐熱性を低下させることを示す実験に反映されており、多細胞生物のタンパク質安定制御を研究する必要性を示しました1^4-17.しかし、欠けているのは、さまざまな分子シャペロンファミリーなどのプロテオスタシスネットワークが無傷の後生動物の組織でどのように機能し、これらのネットワークが発生および老化中にどれほど動的であるかについてのまとまりのある図です。この目標を達成するためには、多細胞生物の発生と老化の過程でのさまざまな細胞のタンパク質静力学能力を決定するために、生きた動物のプロテオーム維持を監視するための信頼性の高いセンサーが必要です。

特定のタンパク質が細胞のプロテオスタシスのセンサーとして機能するためには、細胞内の無関係なタンパク質のフォールディングに最小限の干渉をしながら、細胞のフォールディング環境の変化に応答する必要があります。生体内の細胞タンパク質抑制の維持と回復を探るために、フォールディングセンサーに依存する2つの補完的なアプローチをとることができます。1つ目は、ホタルルシフェラーゼ^18-20やデグロン^21-24でタグ付けされたGFPなど、タンパク質静止機構に依存することが知られている実験的に同定された準安定タンパク質に基づいて設計されたフォールディングセンサーに依存しています。第2のアプローチでは、細胞環境の漸進的な変化に応答する温度感受性(ts)または加齢依存性凝集タンパク質などの内因性準安定タンパク質が追跡されます^25-27。設計されたフォールディングセンサーは、基本的な生物学的機能を果たしませんが、GFPタグ付きタンパク質などの強力なレポートアッセイで検出できるという利点を提供し、多くの異なる細胞および動物モデル¹⁸で使用できます。しかし、単一の外来タンパク質を導入するとフォールディング環境²⁷に影響を与える可能性があるため、このようなポリペプチドは細胞のプロテオスタシス機構に過負荷をかける可能性がある。あるいは、報告する細胞に天然ではないように設計されたフォールディングセンサーは、細胞のタンパク質滞在能力の変化の影響を受けない可能性があります。例えば、GFPタグ付きプロテアソームレポーター基質は、表現型が検出される前にプロテアソームの~90%を阻害する必要があった²³。対照的に、細胞のプロテオスタシス機構に依存する内因性準安定タンパク質は、細胞の感度範囲内にあるという利点を提供します。しかし、このようなタンパク質のミスフォールディングに伴う機能喪失は、細胞機能や生物の生存能力にも影響を与える可能性があります。ここでは、内因性C.エレガンスフォールディングセンサーの使用に焦点を当てます。

C. elegansは、発生と老化の両方の研究のための確立された後生動物モデルであり、多くの保存された生物学的経路を利用し、細胞生物学、生化学的、遺伝的アプローチの組み合わせを使用して、細胞内のタンパク質の折り畳みを追うために使用できます。私たちは、準安定タンパク質をタンパク質の静電能のプローブとして用い、その表現型、局在、安定性の変化をモニタリングしました。さらに、さまざまなタンパク質の機能を簡単な行動解析で調べることができます。同様に、タンパク質の大幅なミスローカリゼーションは、細胞のタンパク質品質管理ネットワークが細胞の要求に適応できない場合に発生します。タンパク質は、蛍光タグ付きタンパク質を使用するか、免疫染色によって、生きた動物の細胞内で簡単に視覚化できます。最後に、ex vivo法を用いて、タンパク質の発現と安定性をモニターすることが可能です。これにより、行動および生理学的変化の迅速かつ簡単なスクリーニングが可能になり、タンパク質の局在と安定性の詳細な分析が可能になり、プロテオスタシス修飾剤のモニタリングが可能になります。これらの異なる方法を組み合わせることで、細胞のタンパク質フォールディング環境を広く把握することができます。実際、この戦略は、C.エレガンス、酵母、組織培養、および細菌^15,25-35のプロテオスタシス摂動を監視するために成功裏に使用されています。

プロトコル

生体内のタンパク質のフォールディングを監視するための行動アッセイの使用

1. 行動アッセイのための動物の同期

1. C.エレガンス³⁶のメンテナンスには、培地やプレートの準備、食品の調製、動物の成長条件など、標準的な方法に従ってください。温度(15-25°C)、個体数、食料の入手可能性など、栽培条件を慎重に管理します。細菌や真菌の汚染が見られるプレートは廃棄してください。
2. 15〜30個の胚を選び、それらを新しいプレートに移し、実験期間中、目的の温度(15〜25°C)で成長させます。あるいは、10〜20匹の妊娠した成虫を皿に置き、30〜60分間卵を産ませてから、皿から取り出します。胚の直接選択と妊娠した成体の設定の両方で、年齢に多少のばらつきがあります(±6時間)。このばらつきを減らすには、コンマステージなどの特定のステージで胚を選択するか、産卵を始めたばかりの10〜20人の成体を設定します(成体期の2日目)。この治療はストレスが多く、タンパク質うっ滞に影響を与える可能性があるため、可能な限り漂白による同期を避けてください。
3. 同期した動物を選別し、アッセイプレートに移してスコアリングを行い、廃棄します。

2. ムーブメントアッセイ

同期した動物を選び、動きのスコアリングのための希望の温度(15-25°C)できれいなプレートに移します。生物学的複製ごとに、>20匹の動物を採点し、実験条件ごとに少なくとも3回アッセイを繰り返します。Wilcoxon Mann-Whitney 順位和検定を使用して、2 つの独立した実験条件を比較します。

1. 軽度の動き障害を測定するには、清潔な細菌の芝生の中央に5〜7匹の動物を一緒に置き、動物がプレート上を2分間動くのを待ちます。この時間間隔は、野生動物の90%が1cmの円をクリアするのにかかった時間に基づいて決定されました。
2. 1 cmの円をクリアしなかった動物の数(たとえば、設定された点から半径1 cm以内に残った動物)の数を非調整としてカウントします。
3. 重度の運動障害をアッセイするには、動物を清潔な細菌の芝生に置きます。
4. 時間ゼロ(t = 0)でいくつかの動物を撮影し、5分後(t = 5)に再び撮影します。5分後に体長1体動かなかった動物を麻痺状態として採点します。

3. 耐熱性

1. >20匹の同期動物を選別し、450 μlのヒートショック(HS)バッファーを含む24ウェルプレートに移します(表1)。生物学的複製ごとに、>20匹の動物を採点し、実験条件ごとに少なくとも4回アッセイを繰り返します。
2. 24ウェルプレートを温浴に移します。HSの温度と期間は、成長条件、特に栽培温度に強く依存します。
3. HSバッファーに9μlのSYTOXオレンジを添加します。
4. TXRフィルター付きの蛍光ステレオスコープを使用して、色素の取り込みをモニタリングすることにより、動物の生存率をスコアリングします。染料を摂取した動物は死んでいます。Wilcoxon Mann-Whitney 順位和検定を使用して、2 つの独立した実験条件を比較します。

免疫染色とタグ付きタンパク質を使用して、特定の細胞内のタンパク質のフォールディングをモニタリング

4. 免疫染色によるタンパク質の局在のモニタリング

1. 必要な段階で、少なくとも30匹の動物をM9^{バッファー36}を含むエッペンドルフチューブに移します。
2. 動物をM9バッファーで数回洗浄し、短い低速遠心分離ステップ(3,000 rpm/900 x g、2分)を行い、再懸濁します。
3. チューブを氷の上に数分間置き、冷まします。
4. 余分な液体を取り除き、氷冷した500 μLの4%パラホルムアルデヒド溶液でインキュベートします(表2)。インキュベーション時間は、検査したタンパク質ごとに較正する必要があり、室温で約5〜30分である必要があります。4°Cでの長時間のインキュベーションも可能ですが、サンプルの透過性が損なわれる可能性があります。
5. 固定した動物をPBS-Tween(pH 7.2)緩衝液で遠心分離(3,000 rpm、1〜2分)により3回洗浄します。動物は、この段階で4°Cで数週間保存できます。
6. 遠心分離(3,000rpm、1〜2分)で動物を回収します。
7. フード内で、上清の大部分を取り除き、ペレットを1 mLのβ-メルカプトエタノール(β-ME)溶液に再懸濁します(表2)。
8. 37°Cで一晩インキュベートし、ニューテーターで穏やかに揺さぶってください。
9. フード内で、PBS-Tween(pH 7.2)緩衝液で動物を3回洗浄します。
10. 動物を50-100 μlのPBS-Tween (pH 7.2) に再懸濁します。動物は、この段階で4°Cで数週間保存できます。
11. 遠心分離(3,000rpm、1〜2分)で動物を採取し、PBS-Tweenバッファーの大部分を除去します。
12. 各チューブに100-150 μlのコラゲナーゼ溶液を加え、37°Cで強く攪拌しながらインキュベートします(サーモミキサーまたは振とうインキュベーターを使用)。
13. 実体顕微鏡で動物を頻繁に観察し、5分間のインキュベーション後から開始します。動物の20%が壊れたら、チューブを氷の上に置いて反応を止めます。このステップは非常に敏感です!治療期間は固定条件によって異なり、菌株によって大きく異なります。孵化が長引くと、動物が完全に劣化する可能性があります。使用する酵素バッチごとに条件を校正し、分解を注意深く監視する必要があります。
14. PBS-Tween(pH 7.2)で動物を2回洗浄し、次に遠心分離(3,000 rpm、1〜2分)で動物を回収し、PBS-Tweenバッファーの大部分を除去します。
15. 1 mLのAbA溶液(表2)を加え、室温で1時間穏やかに揺さぶってインキュベートします。動物は、この段階で4°Cで数週間保存できます。
16. 遠心分離(3,000 rpm、1〜2分)で動物を回収し、200 μl AbAに再懸濁します。
17. 1:100-1:1,000に希釈した一次抗体をAbA溶液に添加し、穏やかに揺さぶってインキュベートします。インキュベーションの温度と期間は抗体によって異なるため、検査するタンパク質ごとにキャリブレーションする必要があります。まず、室温で一晩インキュベーションします。
18. 動物を遠心分離(3,000rpm、1〜2分)で洗浄します。
19. AbA緩衝液(1 mL)を添加し、室温で15〜60分間穏やかに混合してインキュベートします。動物は、この段階で4°Cで数週間保存できます。
20. オプション:サンプルは蛍光色素で染色することもできます。これを行うには、色素(DAPI(2 mg/mL)またはPhalloidin(1:100)など)を200 μlのAbAに加え、穏やかに振とうしながら最大1時間インキュベートします。このステップは、二次抗体を洗浄するステップの1つで実行できます。
21. 手順4.18-4.19を繰り返して、動物を3回洗います。
22. 100 μl のAbAを適切な蛍光標識付き二次抗体と共に1:100に希釈して加えてください。
23. サンプルを蓋をして(または暗いチューブに入れて)保持し、室温で数時間揺さぶってインキュベートします。
24. AbA緩衝液(1 ml)で室温で15〜60分間穏やかに混合し、その後遠心分離(3,000 rpm、1〜2分)して動物を3回洗浄します。動物は、この段階で4°Cで数週間保存できます。
25. スライドに動物をマウントするには、すべての液体を取り除き、同じバッファーの10μlに再懸濁します。
26. ピペットチップの端を切って動物が透けないようにし、サンプルの1〜2μlをスライドに移します。
27. 封入剤を1:1の比率で添加します。
28. スライドをカバースリップでやさしく覆い、マニキュアで密封します。スライドをすぐに監視しない場合は、スライドを-20°Cで長期間保存できます。

5. タグ付きタンパク質の局在を監視する

1. 必要な段階で、スライド上の10mlのM9バッファーに少なくとも15匹の動物を集めます。
2. 「ワームピック」を使用して、動物を10mlのパラホルムアルデヒド溶液(4%)(表2)に移し、すべての動物の動きが止まるまで待ちます(約5分)。
3. 「ワームピック」を使用して、動物を2 mLのM9バッファーと封入培地(1:1)に移します(表2)。
4. 動物をカバースリップでやさしく覆い、マニキュアで密封します。

ex vivoアッセイを使用してタンパク質のフォールディングと安定性をモニタリング

6. パーシャル消化

1. 15プレート(60 mm)から、マイクロチューブ内の1〜2 mLのM9バッファーを使用して動物を洗浄します。実験期間中、動物が密集しないようにし、十分な餌を用意しておく必要があります。
2. 遠心分離機(3,000rpm、2分)で動物をM9バッファーで数回洗浄し、動物を再懸濁します。
3. 最終スピン後、動物を100 μl M9バッファーに再懸濁します。
4. 液体N₂中で瞬間凍結します。サンプルは-80°Cで保存できます。
5. 冷やした乳棒と電動ドリル(ハンドヘルド組織培養ドリルも使用できます)を使用して、サンプルを粉砕します。サンプルを氷の上に保管し、過熱を避けてください。
6. 実体顕微鏡で動物を頻繁に検査して、研削が完了したかどうかを判断します。無傷の動物が残っている場合は、手順を繰り返します。
7. ワーム抽出物をピペッティングして容量を推定します。
8. 1:1の比率で(2x)ワーム溶解液を添加します(表3)。 いかなる種類のプロテアーゼ阻害剤も使用しないでください。
9. 氷上で15分間インキュベートします。
10. 予冷した遠心分離機(4°C)で遠心分離(1,000 x g、2分間)して破片を除去します。
11. 上清を清潔なマイクロフュージチューブに移します。サンプルは直接使用することも、-80°Cで保存することもできます。
12. キモトリプシン溶液(表3)を調製し、使用するまで氷上で維持します。
13. Bradfordアッセイを使用して総タンパク質濃度を測定します。
14. 必要に応じて、総タンパク質濃度が3〜3.5 mg / mlになるようにサンプルを希釈します。
15. キモトリプシン溶液を総タンパク質溶解物(1:1,200)に加えます。
16. インキュベーション時間を決定するには、サンプルをキモトリプシンと60分間インキュベートします。異なる時点(例:0、5、20、40、60分)でサンプルから20μlのアリコートを取り除き、すぐにSDSサンプルバッファーと混合し、96°Cで5分間煮沸します。*あるいは、サンプルを異なる濃度のキモトリプシンでインキュベートし、SDSサンプルバッファーを添加して5分間煮沸することにより、特定の時間後に反応を停止します96°Cで。
17. SDS-PAGEゲルでサンプルを泳動します。
18. 適切な抗体を用いてウェスタンブロット解析を行い、タンパク質の相対的安定性を判断します。
19. サンプル間で大きな変化を示す最適な条件(キモトリプシン濃度と消化時間)を決定し、これらの条件を将来の実験に使用します。
20. NIHイメージゲルモジュールなどのデンシトメトリーソフトウェアを使用して、さまざまな消化産物(低分子量フラグメント)の強度を測定します。

結果

フォールディング環境が損なわれると、タンパク質のミスフォールディングや凝集につながる可能性があります。タンパク質のミスフォールディングは、コンフォメーションの変化と関連しており、タンパク質の機能の喪失につながります。私たちは、補完的なアプローチを用いて、無傷の動物、特定の細胞、タンパク質抽出物におけるタンパク質のフォールディングと機能を監視します。既知の不安定性変異に関連する強力な行動型および細胞表現型に基づくフォールディングセンサーのインテリジェントな選択は、タンパク質フォールディング環境の変化を監視するために使用できます。内因性の温度感受性変異タンパク質の一例は、太い筋フィラメントタンパク質であるパラミオシン(C. elegans UNC-15)のL799F変異である³⁷。ミスセンス変異はコイルコイル相互作用に影響を及ぼし、パラミオシン(ts)が制限温度で筋筋のサルコメアではなくパラクリスタル集合体に誤って折り畳まれて再局在化します。このような誤った局在化は、太いフィラメントの形成を混乱させ、温度依存性の胚および初期の幼虫の致死性、および成虫の運動障害につながります²⁷。...

ディスカッション

細胞のプロテオスタシス能力のプローブは、タンパク質の折り畳みの品質管理能力をリアルタイムで評価するために、折り畳み環境の変化に非常に敏感で、簡単に監視できる必要があります。プロテオスタシス能力のプローブとして準安定タンパク質を使用して、表現型、細胞内タンパク質の局在化、およびタンパク質のコンフォメーションの変化を監視しました。ここで提示するプロトコルは、運動性、筋フィラメント組織、ミオシン安定性などの筋タンパク質関連表現型に焦点を当てています。ただし、これらのプロトコルは、他の折り畳みセンサーを監視するために変更できます。行動表現型については、生物レベルでタンパク質機能を決定するためのシンプルで堅牢なアッセイを設計することが重要です。たとえば、 dyn-1 のts変異は、制限状態でのエンドサイトーシスとシナプス小胞のリサイクルの急速な喪失につながります。その結果、体腔細胞およびニューロンにおけるダイナミン機能は、体腔液に分泌されるGFPの取り込み、またはGFP(SNB-1::GFP)でタグ付けされたシナプスタンパク質シナプトブレビン-1の局在化によってそれぞれ監視することができる²⁸。同様に、ミト...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗体スタンおよびフィアキション	パラホルムアルデヒド	Merc
8187151000 Tween-20	バイオ・ラッド	1706531
コラゲナーゼ	Σ	C5138-100MG
DABCO	Merc	8034560100
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
β -ME	Sigma	8057400250
BSA	Di Cam	000-40-100
部分ダイジェスト	キモトリプシン	Σ	C4129-250MG
耐熱性	SYTOX Orange	Invitrogen	S11368
コレステロール	Amaresco	0433-250G
機器
M165 FC 蛍光ステレオスコープ	ライカ		TXR フィルター
EXi 青色蛍光顕微鏡カメラ	QImaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META 共焦点顕微鏡	ツァイス
ペレット乳棒	シグマ	Z359947-100EA
ペレット乳棒 コードレスモーター	Kontes	K749540-0000
MicroCL 17 微量遠心分離機	シリーズ サーモ	75002455	冷蔵、、230 V 50/60 Hz、ClickSeal Biocontainment Lid 付き 1.5/2.0 ml ローター 24 個を含む