検証済みの内視鏡スコアリングシステムを使用して、大腸炎および結腸直腸腫瘍の重症度を評価するためにマウスでの柔軟な大腸内視鏡検査

サマリー

過去数年間、新世代内視鏡は、ネズミ大腸炎および結腸直腸腫瘍を評価するための重要な診断研究助剤として浮上している。私たちはここに、マウスにおける炎症と大腸腫瘍の内視鏡的な評価だけでなく、大腸炎および大腸腫瘍の内視鏡的重症度を記録するために小数の識別子を使用して新たなスコアリングシステムのための詳細なプロトコルを提示する。

要約

研究目的のための現代的な内視鏡検査の使用が大幅に胃腸病態の我々の理解を促進してきた。特に、実験的内視鏡検査は、慢性炎症性腸疾患の機構および結腸直腸癌の進行を評価するもののような単一の実験動物で繰り返し評価を必要とする研究のための非常に有用であった。ただし、研究間で使用されている方法は、非常に多様である。少なくとも3の内視鏡スコアリングシステムは、マウス大腸炎のために出版され、結腸直腸腫瘍の評価のためのプロトコルが付随大腸の炎症の存在に対処するために失敗した公開されている。この研究は同時に、炎症や腫瘍の両方の評価を統合し、再現性の内視鏡スコアリングシステムを開発し、検証します。肛門周囲の知見に基づいて、大腸の炎症の程度や重症度の1）評価（、WALの透明性：この新規なスコアリングシステムは、3つの主要コンポーネントがありますL、粘膜出血、および局所性病変）、2）腫瘍病変（グリッドマップとバーグラフ）と、観察された病変の割り当てられたカテゴリでは、小数点単位に基づいて病理学的研究の関連性による臨床例の3）数値的なソートを定量的に記録し、内視鏡の合併症（小数点識別子）。ここに提示された映像や原稿は、近位の内視鏡大腸炎（D-PECSから遠位を区別するためのシステムオプションを指定して、研究者は十分に検証され、再現性の高い内視鏡の方法論を用いて、独自の実験用マウスを獲得できるようにするために、動物実験委員会が承認したプロトコルに従って、調製した）。

概要

マウス内視鏡検査は、十年以上^1-3有用な研究ツールとして行われている。いくつかはまた、軟性S状結腸鏡検査を使用していたが、現在までに、マウス内視鏡検査を採用するほとんどの研究は、硬性内視鏡を使用している。マウスの内視鏡検査は、すぐに結果を提供し、腸の正常、炎症の重症度、並びに体重減少、下痢、および組織のような間接的な尺度、（病変が斑状である場合、最適以下である）と比較して、腫瘍進行の程度をより客観的推定、一方大腸の全体的な健康についての洞察を提供しています。安楽死させなければとコロンは、分析¹のために収穫されるために、動物を必要とする伝統的な組織学的検査とは対照的に、最も顕著なのは、内視鏡検査は、時間をかけて実験動物モデルを繰り返し評価を可能にする。これらの利点にもかかわらず、マウスの内視鏡技術の使用は普及しておらず、implementatiための標準化されたプロトコルの欠如によって制限される上および病理学的所見のスコア化。適切に実装され、マウスの内視鏡検査は、さらに我々の理解や炎症性腸疾患、大腸炎、および結腸直腸腫瘍を含む複数の慢性胃腸疾患状態の動物モデルの特徴付けを容易にするための大きな可能性を秘めています。

ネズミの内視鏡技術の有用性は、標準化された審査手続の存在と腸の異常のための一貫性のある、非冗長、かつ信頼性のスコアリングシステムを必要とし、その再現性と客観性、にかかって。大腸^4-6の内視鏡的評価のためだけでなく、マウスでの大腸腫瘍は^4,7,8のための少なくとも3わかりやすいスコアリングシステムが発表されている。しかし、これらの報告されたアプローチやスコアリングシステムは、研究間で容易に比較することはできません。多くの場合、病変の分類のために使用される基準の明確な定義は存在せず、基準が与えられたとき、それらは広く変化。また、大腸腫瘍、単一の測定ツールに同時に発生し、結果にインタラクティブな効果を持つことができる最も一般的な結腸病変の2、両方の評価を統合しないと報告スコアリングシステムは存在しない。最後に、大腸炎のために存在する内視鏡的スコアリングシステムは、多くの場合、限られた差別を伴う炎症のカテゴリーがある（ すなわち 。短整数スケール、多くの場合、1〜4の上の狭いスコアリングオプション）が正しく、疾患の進行のシナリオを表しており、パラメトリック統計解析の使用を可能にする。

本論文では、マウスの大腸炎および結腸腫瘍の重症度を評価し、肛門周囲、直腸、および遠位結腸の解剖学的評価にこの技術を採用するための標準化されたプロトコルを記述するための軟性内視鏡の使用を記載している。私たちは、外傷や画像アーティファクトを最小限に抑えるために、内視鏡検査の際に効果的なトラブルシューティングを説明し、我々は再現性のスコアリングシステムを説明検証公表された臨床パラメータに基づいて。スコアリングシステムは、（特定の診断値との調査結果を強調するために12の炎症、腫瘍のマッピングの可能性等級とプロットオプション、および新規の小数単位系（すなわち、小数の識別子）との差別の高いレベルを使用して、腸の炎症や腫瘍の両方の評価を統合すなわち腫瘍発生、内視鏡検査などの際の合併症）。小数識別子の使用は、さらに下流の分析に関連するデータセットの迅速な追跡を可能にする。最後に、我々は大腸炎および大腸炎関連癌（デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎、 クロストリジウム·ディフィシル感染症、及びアゾキシメタン/ DSS誘発結腸癌）の複数のマウスモデルにおいてスコアリングシステムの信頼性と妥当性テストを実行します。

プロトコル

1。内視鏡システムの設定

1. 製造者の指示に従って、マウスを麻酔前に内視鏡システムをセットアップします。このプロトコルの人間のために設計されたビデオ·尿管鏡（ 図1）を使用します。挿入管の外径が9.9 Frの（5.3 mm）で、その遠位端が8.5 Frの（2.8ミリメートル）であり、計装チャネルの内径は6 Frと（1.2 mm）である。
2. 内視鏡の使用は病気の伝染にリンクされていないが[9]、胞子を形成する微生物を扱う場合、70％エタノール¹⁰または適切な技術を持つ内視鏡やレンズを消毒。静菌無菌潤滑剤と非スクラッチは、内視鏡の先端部を飽和させるために組織を拭いて準備します。
3. 計装チャンネルの上部に空気の全3ミリリットルの注射器（または適切なCO ₂の混合ガス）を取り付けます。
4. 電源を入れ、通常の白色光のホワイトバランスを設定して、適用可能なだけでなく、狭帯域光観察（NBI）モード。それは特徴的な異常な血管新生^11を持っている潰瘍性及び腫瘍性病変を含む粘膜の微細な血管構造を、強調しているように2001年以降、NBIは画像診断上の利点を提供してきました。 NBI-フィルタモードでは、ヘモグロビンを有する構造を強調して390から445 nmおよび530から550ナノメートルに捕捉された光の波長を制限します。
5. あなたの調査結果を記録するために、評価スコアリングフォーム（ 図2）を印刷。 （セクション6.1を参照）試験前予想される正常およびNBI画像（ 図3A）と定義し、各基準の等級に慣れる。
6. 必要に応じて、色素内のためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）での着色剤ベースのソリューションを用意してください。色素内視鏡検査では、検査は、粘膜の変化を強調するために造影剤として染料を用いて行われる。メチレンブルー（0.1％）と、インジゴカルミン（0.1％）ソリューション（ 図3B）を使用します。ノートそのメチレンブルー基を酸化するアミノ酸残基の、間接的な架橋、および試料分析を妨げる可能性DNA分解^12を生成することができる酸化還元剤である。

2。マウスの全身麻酔

1. 麻酔薬および投与経路を選択してください。免疫系と薬や研究目的の潜在的な干渉に関する動物資源施設や施設内動物管理使用委員会（IACUC）から獣医師に相談してください。一部の薬は、げっ歯類¹³を含む、動物においてサイトカインプロファイルの発現に影響を及ぼし得る。適切なコントロールと一緒に、生存内視鏡検査用の端末手順やイソフルランのための注射ブロモエタノールを使用してください。
2. 誘導のために、0.2〜0.5リットル/分の速度で100％酸素でイソフルランの4〜5％の管理、メンテナンスのために百分の0.5から2を使用しています。このプロトコルは、すべての動物には適していません。貴施設の獣医師に相談してください適切な指示と訓練のため。動物福祉のための最高水準を達成するために、関連する動物実験委員会の勧告に従うこと。マウスが完全に麻酔をかけている場合ことを確認してください。
3. 「ストラップ」実験室用接着テープを用いて背側又は腹側位置に支持面テーブルに麻酔したマウス。あなたの内視鏡画面上の解剖学的向きに注意してください。その下肢と尾を固定します。テープのバンドはまた、人工呼吸器から離れて移動するのを防止するが、胸郭呼吸の動きを規制回避するために胸部上に配置することができる。

3。詳細な内視鏡検査

1. 肛門からスコープを進め、その後、直腸に内視鏡を挿入する前に肛門周囲病変を探してください。
2. コー​​ト無菌外科潤滑剤を内視鏡。 CCD（電荷結合素子）センサーの表面被覆しないようにしてください。
3. 内視鏡を挿入し、録画を開始します。撮影した動画は、Mに便利です検査後、必要に応じて内視鏡検査のeticulous評価。粘膜/腸への刺激を最小限にするために、時間の最小限の長さで内視鏡検査を行うようにしてください。
4. ゆっくりと腸の壁を離れて設定するために注射器を用いて空気を適用します。マウスのサイズによっては、空気1〜2mlのを使用しています。過剰な送気を避けるため、それは、麻酔したマウスの呼吸困難や死を引き起こす可能性があります。
5. あなたは空気やスコープの穏やかな回転に道を開く、前方視鏡を進める。あなたが腸管腔が表示されない場合は、内視鏡を進めないでください。ミシン目または結腸/直腸裂傷（<8月10日週齢）特に若いマウスでは、この段階で発生する可能性があります。必要に応じて写真を撮る。
6. スコープが進むと（定義された天然に存在する粘膜出血は外傷性内視鏡検査に関連付けられていない）出血自発があるかどうか、評価します。内視鏡は直腸および結腸に入るときに自然出血を観察することができる。
7. として結腸壁の透明性をSESS。透明度は、結腸および周囲の他の内臓（ 図4）の壁内に血管を視覚化する能力として定義される。範囲の穏やかな運動は、（フォワード、バック、時計回り、反時計回りに）血管が他の内臓の文脈で見ることができるかどうかを決定するのに役立ちます。腸間膜脂肪組織にも見ることができる。骨盤腔の内部直腸は腹腔内の結腸壁よりも小さい透明表示された場合は注意してください。
8. 局所性病変（浮腫エリア、びらん、潰瘍、腫瘍塊）の種類と数を決定するために検査します。これは、結腸の炎症スコアと開発されてきた小数識別子を使用してスコアリング状に記録される。
9. コロンは、近位結腸に尾側に屈曲する領域が到達すると、徐々に内視鏡を撤回した後、破砕性粘膜による起こる出血接点（の存在を探す内視鏡）は、進行性または除去される。これは意図的に、大腸表面をこすりする必要はありません。健康的な大腸粘膜は、適切な内視鏡検査後に出血していません。

4。生検

1. 生検が必要な場合、計測専用の内視鏡管路を介して生検鉗子を挿入する。腸管穿孔を防ぐために、内視鏡画面上の鉗子の進歩を監視します。
2. 約60〜80℃のカップにカップの角度に鉗子の生検カップを開き、関心のある領域にそれらを指示。過度に開かれた鉗子や圧力は健康的な透明腸壁の生検によって誘発される穿孔、その結果腸組織の余分な層を把握することがあります。穿孔が発生した場合は、動物実験委員会の勧告に従って麻酔中の動物を安楽死させる。穿孔は内毒素血症や腹​​膜炎につながる。
3. 生検カップを閉じ、閉じた鉗子を維持しながら、それらを引き出します。
4. レモ組織や鉗子に優しいソリューションで組織を洗い流すことによって鉗子から標本を見る。 RNAは、後にし、PBS、共通のワーキングソリューションです。必要に応じて、サンプルを取り除くために、針を使用しています。鉗子カップを侵食やエッジをカットすることは避けてください。

5。麻酔からの回復

1. それが回復するまで検査が終了すると、マウスに暖かい環境を提供する。電灯、または37℃の温パッドセットのいずれかを使用過熱を防ぐため、周辺血管拡張は、動物の回復を損なう。完全に回復するまで、密接にマウスを監視します。

6。進識別子を持つ大腸の健康の総合内視鏡スコアリングシステム

1. のために：（パラメータの定義、およびプロトコル進加重スコアリングシステムを使用したマウス大腸の炎症および腫瘍の内視鏡アセスメント ）スコアリングフォーム（ 図2）、以下のパラメータ定義を使用偏りのない評価と詳細な記録保存のためのガイドラインとしての例や、オプションの「遠位近位内視鏡大腸炎スコアリングシステム」（D-PECS）。
2. スコアリングシステムフォーム（ 図2）に記載されている大腸の炎症の4つのパラメータがスコア。細心の注意を払って肛門周囲、腸の透明性、出血、腸（存在する場合）のタイプ、および局所性病変（びらん、潰瘍性、および/または腫瘍）の存在と量を評価する。
3. 研究目的のために腫瘍を評価する場合、数量、位置、および大きさを調べ、結腸マップおよびスコアリング状の棒グラフを使用して記載している。得られたスコアや病変の数（該当する）の数値の和が背景大腸の炎症、病変の最も優勢種類、病変の数を決定します。

結果

この研究で提示されたプロトコル、画像はオリンパスURF-V軟性内視鏡¹⁴及びNBI ^11,15を用いて調製した。ビデオ画像は、MPEG-2形式とJPG、TIF、PNG、または標準のUSBフラッシュポータブルメモリへの転送可能、最大1280×1024ピクセルと、DICOM形式の画像で保存された。 NBIは、ヘモグロビン含有組織の視覚的なコントラストを向上させます。通常の光と、NBIイメージングは、大腸粘膜の正常な解剖学および潰瘍や腫瘍発生（ 図3Aおよび6A）の間に正常と異常な血管新生の違いを説明するための主要な機能である。色素内視鏡検査時に造影剤としてメチレンブルーの画像は結腸陰窩（ 図3Bにクローズアップ参照）の空中通常のハニカム外観を明らかにし、クローズアップ画像のその利点を示しています。

これまでに、500人以上のマウス内視鏡検査のfolloを行ってきた翼を繰り返し検査を表す約10％で、このプロトコル、。一般的には、手続きが完了する...

ディスカッション

マウスでの内視鏡技術の改良やトラブルシューティングに関するいくつかの考慮事項があります。柔軟な内視鏡検査の使用中に習得する必要がある手順の重要な側面は、アンギュレーションとトルクコントロールの調整で腹部膨満とマウスの呼吸障害を防止するために必要空気量の調整、およびビューコントロールのマイナー技術的な側面を含んで。トルク制御は、腸穿孔の危険性を最小限に抑えることが重要である。適切に処理すると、マウスの柔軟な内視鏡検査は、直接可視化と研究の関心の腸領域の生検標本を可能にする非常に安全、迅速な手順になります。

（ 図5）糞便によるビューの障害物を解決するためには、糞が通常であっても、空腹時や下剤の使用後に観察されていることを理解することが重要です。存在する場合には、糞を簡単に穏やかな空気インして近位側に移動することができますufflation。症例の約11％において、それはまた、PBS浣腸1mlのを使用する必要がある。腹部膨満または妊娠しているを持っているようだ動物を調べるときに浣腸を実施する前に、十分に注意してください。蠕動運動のためには、送気が蠕動...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
イソフルラン、USP	ウェブスター獣医
外科用潤滑剤	サベージ研究所	surgilube、0281-0205-45
リン酸緩衝生理食塩水	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
メチレンブルー 1% 水溶液	フィッシャー科学教育	S96393
フレキシブルデジタル尿管鏡	オリンパスアメリカ	URF-V
ビデオシステムセンター	オリンパスアメリカ	VISERA Pro OTV-S7 Pro
キセノン光源	オリンパスアメリカ	VISERA Pro CLV-S40 Pro
ビデオレコーダー	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
適用範囲が広い生検のコップ鉗子	オリンパスアメリカ	FBC-3115
麻酔器	安楽死の株式会社	EZ-7000の古典的なシステム