方法論記事

FtsZは重合アッセイ：シンプルプロトコルと考慮事項

DOI：

10.3791/50844

⸱

2013年11月16日

 , 
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FtsZの重合は細菌の細胞分裂に必須です。このレポートでは、FtsZ重合活性を監視するための簡単なプロトコルを詳しく説明し、バッファー組成の影響について説明します。このプロトコルは、FtsZの重合に影響を与える調節タンパク質または抗菌薬とFtsZとの相互作用を研究するために使用できます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細菌の細胞分裂の間、必須タンパク質のFtsZは、いわゆるZ-環を形成して、セルの中央に組み立てる。 FtsZは、 インビトロで GTPの存在下で長いフィラメントに重合し、重合は、いくつかのアクセサリータンパク質により調節される。 FtsZの重合は、広範囲に光散乱、沈降、GTP加水分解アッセイおよび電子顕微鏡法などの基本的な方法を用いてインビトロで研究されてきた。バッファー条件の影響は、両方のFtsZの重合特性、および調節タンパク質と相互作用するためのFtsZの能力。ここでは、FtsZの重合研究のためのプロトコルを記述し、モデルタンパク質として大腸菌、枯草菌のFtsZを使用して条件とコントロールを検証します。低速沈降アッセイは、バンドルまたはFtsZの重合体をチューブ状のタンパク質とのFtsZの相互作用の研究を可能に導入される。改良されたGTPアーゼアッセイプロトコルは、テストを可能に記載されているリン酸検出反応での発色の変化を廃止し、標準化インキュベーション時間を有する96ウェルプレートセットアップにおいて、種々の条件を用いて経時的にGTP加水分解。光散乱試験および電子顕微鏡観察用試料の調製が記載されている。複数のバッファは、FtsZの重合の研究に適した緩衝液pHおよび塩濃度を確立するために使用される。塩化カリウム高濃度の実験のほとんどのための最善の方法です。我々の方法は、E.からだけでなく、のFtsZ のインビトロ特徴付けのための出発点を提供大腸菌とB枯草菌が、他の細菌から。このように、本方法は、調節タンパク質またはFtsZの重合に影響を与える可能性抗菌薬のテストとのFtsZの相互作用の研究のために使用することができる。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

必須の細菌タンパク質FtsZは、細菌の細胞分裂機構の最もよく特徴付けられたタンパク質である。 FtsZは、チューブリンの原核生物相同体であるとGTP依存的にin vitroで重合する。 FtsZは、細菌の1,2への保存された自然や独自性のために新しい抗生物質のために非常に魅力的な標的である。細胞分裂の開始時に、FtsZは、他の細胞分裂タンパク質の組み立てのための足場として働くmidcellにおける細胞質分裂の環を形成する。 Z-環の形成は、分割面の正しい位置特定のために重要である。のFtsZの組立ダイナミクスは、MINC、SepF、ZapA、UgtP、エズラ2（細菌種に応じて）など、いくつかのアクセサリータンパク質によって調節されています。 FtsZの重合は、インビトロで集中的に研究されており、直プロトフィラメント、湾曲したプロトフィラメント、フィラメントのシート、フィラメントのフィラメント、チューブの束を含む多くの異なる構造がデスされている組立バッファ、ヌクレオチド、およびアッセイ3に含まれている追加のタンパク質に依存しcribed。 カウロバクターのクレセンタスにおける電子cryotomography実験は、Zリングが豊富な4をバンドルすることなく、比較的短い、非連続シングルプロトフィラメントから組み立てられていることを示唆しているが、生体内でのFtsZのプロトフィラメントのアーキテクチャは、まだ完全には理解されていません。

in vitroでは 、FtsZの重合特性及び調節タンパク質とのFtsZの相互作用は、反応バッファーの組成に敏感である。例えば、我々は最近、FtsZのC末端にSepFための相互作用部位を説明し、FtsZは宿泊 Δ16C末端TRUNCATEはもはやSepF 5に結合することが示されなかった。 SepF-FtsZは宿泊の相互作用に関するこれまでの研究では、同様のFtsZ 宿泊 Δ16はまだSepFがFtsZの上のセカンダリサイトに結合することが示唆されSepFとcosedimentedとtruncate 6。これらの研究の違いは、pH7.5でバッファ - のFtsZとSepFのない共沈降は、pH6.5の共沈降があったのに対し、切り捨てるありませんでした。反応の組成物であった。 Gündoğdu ら 。 SepFが機能していないし、pH 6.5で観察共沈降がSepFの析出はなく、FtsZの宿泊 Δ16C末端TRUNCATEとの相互作用によって引き起こされる可能性が高いことを示し、pH6.5の7に析出と指摘した。のFtsZの重合に対するpHおよびKCl濃度の影響は、以前に検討されている。 EのポリマーpH6.5で大腸菌のFtsZ（FtsZはEC）は 、より長く、より豊富な中性pH 8,9で形成されたものよりも。 Tadros ら 。バインディングのK +が FtsZのEcの重合にリンクされ、FtsZは活動10のために重要であることは注目に一価の陽イオンの存在下でのFtsZ のEcの重合を検討した。 pHがよりcriticaですSepFの前の例、およびFtsZは11日 MINCの抑制効果のpH依存性で示すように、他のタンパク質とのFtsZの相互作用は、検討されているL。 pHおよび塩濃度の両方が他のタンパク質とのFtsZの相互作用に影響を及ぼし得るように、FtsZの重合試験のための適切な条件およびコントロールを選択することが重要である。

ここでは、光散乱、電子顕微鏡、沈降、およびGTPアーゼアッセイによりFtsZの重合およびGTPase活性を研究するためのプロトコルを記述します。直角光散乱は、即座に12 FtsZの重合を研究するための標準的な方法である。私たちは、沈降およびGTPアーゼアッセイ、数の改善を導入しました。我々は、光散乱および電子顕微鏡用の試料を調製する方法を詳細に述べる。 FtsZの重合を研究する文献で使用されるいくつかのバッファがテストされ、我々は、各実験のための最高の条件を説明した。我々はまたあるべきかを制御示して最適なデータを得るために導入した。

これらのメソッドは、ほとんどの実験室で提供され、簡単な方法および装置を使用して他のタンパク質とのFtsZの重合活性および相互作用の迅速な研究を可能にする。 FtsZの重合を研究するより洗練された方法が存在するが、多くの場合、蛍光標識8,13,14とのより専門的な機器へのアクセス、および/ ​​またはFtsZのの修正が必要。このホワイトペーパーで説明の簡単な方法は、BからのFtsZを使用して説明している枯草菌および大腸菌大腸菌 、最も一般的なグラム陽性およびグラムモデル生物。プロトコルは、他のFtsZタンパク質に適合させることができる。これらの新規FtsZsによる予備アッセイに基づいて、インキュベーション時間、緩衝液または温度に関するわずかな変化は、最適な結果のために必要であり得る。ここに記載された実験は、これらの最適な条件を見つけるのに役立つはずです。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

タグなしのFtsZタンパク質は、先に説明したように11,15 20mMトリス/塩酸（pH 7.9）、50mMのKCl、1mMのEGTA、2.5mMのMgAc及び10％グリセロールに対して透析し、精製し、そして-80℃で保存した。これらの条件下でタンパク質活性の有意な損失なしに2年以上保存することができる。タンパク質は解凍し、サンプルの凍結を回避するために、100μlアリコートに格納する必要があります。解凍後、サンプルは最大一週間4℃で保持することができる。 FtsZは、高濃度で可溶性であり、7〜10 mg / mlので保存することができる。これは、後の実験における貯蔵緩衝成分の望ましくない影響を回避するために、高タンパク質濃度を維持することが重要である。そこで、ストレージ濃度は少なくとも10倍、1％以下のグリセロール濃度をもたらすために、反応混合物中の透析緩衝液の他の成分の濃度を最小にするためののFtsZの希釈を可能にするはずである。 FtsZの重合はまた、高ナトリウム9の存在によって影響され得るまたはイミダゾールの濃度は、このように、これらのコンポーネントは、重合バッファから削除する必要があります。 7記載の-80℃での溶出バッファに格納されているようにSepFを精製したEからのFtsZの精製の ​​ための代替公表された手順大腸菌とB枯草菌ならびに異なる供給源からのFtsZの精製の ​​ための手順への参照は、（代表的な結果のセクションを参照） を表1にまとめる。

1。試料調製

  1. 重合バッファを準備します。
    1 50mMのHepes / NaOHでpHを7.5
    2 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8
    3 50 mMのMES / NaOHでpHを6.5
    4 50mMのHepes / NaOHを、pHが7.5、50mMのKCl
    5 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8、50のKCl
    6 50 mMの男ES / NaOHでpHを6.5、50のKCl
    7 50mMのHepes / NaOHを、pHが7.5、300 mMのKClを
    8 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8; 300のKCl
    9 50 mMのMES / NaOHでpHを6.5; 300のKCl
  2. フィルター22ミクロンのメンブランフィルターを用いてすべてのバッファを殺菌。
  3. （1）からの各重合液中100mMのGTP、GDPとのMgCl 2ストック溶液を準備します。
  4. 全ての実験のために4℃で20分間、100,000×gでスピンによるタンパク質プリ·クリアー。

2。 FtsZは沈降アッセイ

  1. 高速遠心分離と互換性のあるチューブで（試料調製ポイント1を参照）の重合バッファの1にMgCl 2およびFtsZはを加えることにより反応ミックスを調製する。総体積は50μlの最終容量で、12μMで10 mmとMgCl 2およびFtsZのと、49μLにする必要があります。
  2. P、関数を振盪インキュベーター中でチューブレース300rpmで30℃で2分間インキュベートする（あるいは試料を穏やかに弾き飛ばされてもよいし、短時間、30℃で予熱に続いて微量遠心）。
  3. GTPまたは実験（最終濃度2mM）で用いたのと同じ緩衝液中のGDPのストック溶液1μlを添加することにより重合を開始。 300回転（または関数を振とう培養器内）で30℃、（それぞれ、50のKClおよび300mMのKClをバッファーなど）10、または2分間インキュベートします。
  4. 超遠心ローターにチューブを移し、25℃で35万XG（TLA 120.1ローター用89700 rpm）で10分間スピンダウン
  5. 紡糸後、慎重にロータからチューブを取り外し、すぐにきれいなチューブに上清を移す。 2Xサンプルバッファー20μlに20μlの上清を添加することにより、SDS-PAGE用サンプルを準備します。 98℃で10分間沸騰させる
  6. フォートを含むペレット画分に2×試料緩衝液50μlを追加SZポリマー。 2ミリリットルチューブに超遠心管を配置します。 98℃で10分間煮沸してペレットを再懸濁し、サンプル上清サンプルと同じ2倍希釈するために、脱イオンH 2 Oを50μlを加える。
  7. 2ミリリットルチューブに逆さまに超遠心管を回して、18,000 X gでエッペンドルフ遠心機で5分間スピンダウン。 2ミリリットル管から超遠心管を取り外します。
  8. 負荷10％SDS-PAGEゲル上で並べて各上清およびペレット試料側を10μl。 150 Vでゲルを実行
  9. クマシーブリリアントブルーG-250でゲルを染色し、定量化のために保管してください。

3。スロースピンでのFtsZ沈降アッセイ

  1. ステップ2のように重合溶液を準備し、SepFおよび/またはFtsZは（最終濃度12μM）を追加します。これらの実験は、TLA-55ローターと組み合わせてベックマン使い捨て1.5mlチューブ中で行うことができる。
  2. FUを振とうしながら培養器にチューブをnctionおよび300rpmで30℃で2分間インキュベートする。
  3. ストック溶液（最終濃度2 mM）のからのGTPまたはGDPの追加1μLにより重合を開始し、300 rpmで30℃で20分間インキュベートする。
  4. 25℃で24,600×gで（TLA 55ローター、20,000 rpm）で15分間スピンダウン
  5. 上清を除去し、清潔なチューブに移す、20μLを取り、2×試料緩衝液20μlに移す。 98℃で10分間沸騰させる
  6. 脱イオンH 2 O50μlのを追加し、98℃で10分間煮沸することによりポリマーおよび再懸濁を含む画分をペレット化し、2Xサンプルバッファー50μLを追加
  7. 負荷10％SDS-PAGEゲル上で並べて各上清およびペレット試料側を10μl。 150 Vでゲルを実行
  8. クマシーブリリアントブルーG-250でゲルを染色し、定量化のために保管してください。

4。 FtsZは沈降アッセイの定量化

  1. クマシーSTAの写真を撮るゲルドキュメンテーションシステム（ 例えば 、LAS-4000、富士フイルム）を使用して、INEDゲル。
  2. ゲルのデンシトメトリー分析するのに適したプログラム（ 例えば AIDA画像解析プログラム（Raytest））でゲル画像を開いて、以下のプログラムで分析を説明します。
  3. ツールバーの「評価」ボタンをクリックしてください。
  4. リストから「2Dデンシトメトリー」を選択し、[OK]をクリックします。
  5. メインメニューで、「評価」をクリックして、「領域判定」エントリを選択します。
  6. ゲル上の領域を作成するには、領域判定ツールボックスの自動輪郭ツールのシンボルをクリックしてください。
  7. 、ゲル上のタンパク質バンドの左上隅をクリックし、マウスボタンを押したまま、バンドの所望の右下端にドラッグし、マウスボタンを離します。
  8. マークと同じ方法で、各のFtsZ / SepFバンド。
  9. 割り当てられた領域の評価に関するすべての情報は、領域レポートに記載されています。レジオを入手するにはNレポートは、領域判定ツールボックスの「表示領域レポート」ボタンをクリックしてください。
  10. レポートをエクスポートするには、メインメニューの[ファイル]をクリックし、エントリ「2D領域レポートàエクスポート」を選択します。
  11. 地域レポートでは、すべての作成された領域の強度が見つかるはず。レポートからの強度値を用いて、ペレット中のタンパク質のパーセント（FtsZの、調節タンパク質）を算出する。

5。 90°光散乱

  1. 蛍光分光計（ 例えば AMINCO-ボーマンシリーズ2）の電源を入れ、ランプは30℃でのキュベット室温度を維持するために熱変動を回避し、循環水浴をオンにするのに数分間ウォームアップすることができます
  2. 分光器の動作パラメータを定義します。検出器の高電圧300 V、発光および励起波長：350 nmのスリット幅：4 nmの。多くの分光器が自動的にcertAに実験開始時に信号を調整することに注意してください最大の割合（ 例えば 60％）である。これは、すぐに、GTPがFtsZのを重合するために追加されているように範囲外に移動するための散乱信号を発生します。これは、最初の一連の実験を開始する前に、右信号増幅検出器の高電圧に対する最大の重合を確立することが賢明です。
  3. データ収集プロトコルをプログラムします。 3600秒の持続時間、時間ベースの取得を選択します。
  4. 5分間、室温の水浴に必要 - 超音波処理した場合、水とエタノールとの蛍光キュベットを丁寧に清掃してください。このプロトコルでは、1cmの経路長及び200μlの容積を有するキュベットが使用され、貯蔵溶液（0.5〜1％のHellmanex）に格納される。代替として、単回使用の適合性プラスチックUVキュベット（UVette、エッペンドルフ）を使用することができる。
  5. 最終的な300μLに対して計算濃度、およびVORTとして10 MgCl 2および12μMのFtsZはと（サンプル調製ポイント1を参照）の重合バッファのマスターミックスの294μLを準備EX。
  6. キュベットに重合バッファー196μLを移し、分光器に入れてください。 30℃で2分間インキュベートする。
  7. データ収集を開始し、信号が安定していることを確認するために90秒間待ちます。
  8. 100のGTPまたはGDP（最終濃度：2 mm）で4μl加え200μlの最終反応容量を達成するために、買収をミックスして再開するより大きな容量ピペットで上下にピペット。

6。透過型電子顕微鏡

  1. （ボリュームは、材料を節約するために、10μlの最終容量を削減することができる）のFtsZ沈降アッセイ用としてサンプルを準備します。
  2. インキュベーション時間の後、グロー放電さ400メッシュの炭素被覆銅グリッド上に試料を2μLを適用し、15秒間インキュベートする。
  3. 優しくグリッド並列または濾紙に垂直に触れたりドラッグ​​して、グリッド乾燥ブロット。
  4. 2％の酢酸ウラニル溶液を4μLを使用してグリッドを染色。 BLOステップ6.3で説明したように、グリッドのドライT。
  5. 39200倍の倍率で120 kVので動作するフィリップスCM120電子顕微鏡グリッドを表示します。

7。 GTP加水分解アッセイ

実験の設定は、FtsZのGTPの加水分解はマラカイトグリーンとの反応物を混合することにより、種々の反応時間後に停止されるように設計されている。このようにして、マラカイトグリーンの発色の時間は、各試料について同じである。

  1. 重合バッファの1つに1.5ミリリットル2のGTPを準備します（サンプル調製、ポイント1を参照）。
    重合液中の0-40μMリン酸標準希釈液を調製し、POMG-25H（バイオアッセイ）キットで説明したようにマラカイトグリーンの作業試薬を調製。あるいは、作業試薬はLanzetta らによって記載されたプロトコルに従って社内で調製することができる。16
  2. 総量360μlのマスターミックスを準備します。 私 24μMのFtsZ BS、20のMgCl 2、重合液 2 12μMのFtsZ EC、20のMgCl 2、重合液 III（コントロール1） 24μMのFtsZ BS、2mMのEDTA、重合液 IV（コントロール2） 12μMのFtsZ EC、2mMのEDTA、重合液
  3. ピペットマスターミックス、100μlのリン酸基準や定量PCR 96ウェルプレート中2のGTP180μlを20μlのアリコートを次の順序で。
    A B C言語 D E F G H
    1 3 3 私私 4 4 2 2
    2 3 3 私私 4 4 2 2
    3 3 3 私私 4 4 2 2
    4 3 3 私私 4 4 2 2
    5 3 3 私私 4 4 2 2
    6 3 3 私私 4 4 2 2
    7 3 3 私私 4 4 2 2
    8 3 3 私私 4 4 2 2
    9 PS PS PS PS PS PS PS PS
    10 PS PS PS PS PS PS PS PS
    11
    12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP

    PS - リン酸標準
  4. 30℃で40分間周期に設定されたプログラムでPCR機で定量PCRプレートを置き
  5. malac20μlのアリコートを準備96ウェルプレート中のハイト緑色作業試薬。 1'-8 'レーンの実験から、重合液の60μlを加える。サンプルは、リン酸標準と比較4Xに希釈され、最終的な計算中に、この事実を考慮してください。
    A B C言語 D E F G H
    1 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    2 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    3 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    4 ' III 3 私私 4 4 2 2
    5 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    6 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    7 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    8 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    9 ' PS PS PS PS PS PS PS PS
    10 ' PS PS PS PS PS PS PS PS
  6. （これは30分の反応の開始時点で）、1レーンへのGTPの20μl加えピペットを上下に混合する、タイマーを開始します。
  7. 10分後、30秒、2レーンへのGTPを追加ピペットを上下（20分反応）を混合する。
  8. 16分後に上下3、ピペット混合する（15分反応）レーンにGTPを追加します。
  9. 21分後、30秒（10分反応）をミックスするには、上下4、ピペットをレーンにGTPを追加します。
  10. 25分後（7分反応）混合する、ピペットを上下5レーンへのGTPを追加します。
  11. 27分後、30秒（5分反応）をミックスするには、上下6、ピペットをレーンにGTPを追加します。
  12. 29分後（4分の反応）を混合する、ピペットを上下7レーンへのGTPを追加..
  13. レーン1にレーン1から30分の転送を20μlの後で、上下のピペット混合する（3マラカイトグリーンの発色の出発点0分反応）。
  14. 30分後、30〜2レーン2から秒の転送20μL '、ピペットを上下（20分の反応のためにマラカイトグリーンの発色の開始点）を混合する。
  15. レーン3-7ごとに30秒間のステップを繰り返します。
  16. 33分後、30秒のために（マラカイトグリーンの発色のための0分の反応と開始時点を混合するピペットを上下、8レーンへのGTP20μlのピペットを上に追加して、ミックスダウンすると「8レーンに20μLを転送反応）。
  17. 34分後、「レーン9〜9を上下にピペット混合する（リン酸標準1用のマラカイトグリーンの発色の開始時点）を80μLを加える。
  18. 34分30秒の転送80μlの後には、上下車線から10から10 '、ピペット混合する（リン酸標準2用のマラカイトグリーンの発色の開始時点）。
  19. サンプルから全ての気泡を除去し、さらに25分間室温でプレートをインキュベート30秒。
  20. 96ウェルプレートリーダーでプレートを置き。
  21. 60分後（マラカイトグリーンの発色は、最初の反応のために今30分である）、波長630 nmでプレート10倍ごとに30秒を測定します。すべての測定は、ステップ7.6から7.12と7.16からのすべての時点に対応し、データ解析の際に別々に計算しなければなりません。
  22. リン酸標準較正曲線を用いて各サンプル中の遊離リン酸を計算する。
  23. 時間をかけてリン酸の放出などのデータをプロットし、曲線の直線範囲からのFtsZのGTP加水分解活性を計算します。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

さまざまな細菌源からのFtsZの精製は文献に記載されており、表1にまとめられています。

名 の 名 名 名 名 名 の 名 名 の 名 の 名 名 名 の 名 の 名
源方式修正得られた収率[mg / Lの培養]>参照
B.枯草菌1)硫酸アンモニウム沈殿/イオン交換クロマトグラフィーいいえ40この作品、11,15
2)アフィニティークロマトグラフィーヒスタグND17
大腸菌1)硫酸アンモニウム沈殿/イオン交換クロマトグラフィーいいえ35この作品、11,15
2)カルシウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィーいいえ4018
メタノコッカス・ジャンナスキイ1)変性条件下でのアフィニティークロマトグラフィー/リフォールディング/硫酸アンモニウム沈殿/ゲルろ過ヒスタグ1.319
2) アフィニティークロマトグラフィー/ゲルろ過ヒスタグND20
サーモトガ・マリティマイオン交換クロマトグラフィー/ゲルろ過いいえ6.719
緑膿菌アフィニティークロマトグラフィー/ゲルろ過連鎖球菌タグ、HisタグND21
結核菌1)アフィニティー/イオン交換クロマトグラフィーいいえND22
2) アフィニティークロマトグラフィー/ゲルろ過いいえ3023
アクイフェックス・アエオリクスアフィニティークロマトグラフィー/ゲルろ過Hisタグ、C端子トランケーション (331-367)ND24
カウロバクタークレセントスイオン交換クロマトグラフィー/硫酸アンモニウム沈殿/ゲルろ過いいえND25

表 1.FtsZ精製プロトコルが記載されている。ND:未定。

FtsZポリマーの沈降

当初、FtsZポリマーをスピンダウンするために2つの異なる速度を使用しました。その結果、350,000 x gの速度でのみ、FtsZEcの単一ポリマーがスピンダウンされるのに対し(図1)、190,000 x gでは、ペレット画分中にはFtsZBの束のみが存在することがわかりました(データは示さず)。したがって、350,000 x gをさらなる実験で使用しました。重合FtsZEcとFtsZBsの割合は50 mM KClでほぼ同じですが、光散乱実験ではFtsZBsの散乱信号がはるかに高いことが明らかになりました。これは、FtsZEcの単一ポリマーよりも多くの光を散乱するFtsZBsによって形成される束によるものです。FtsZEcとFtsZBsの両方について、300 mM KClの実験では、ペレット画分中に大量のFtsZポリマーを得ることができませんでした(図1)。これは、FtsZ構造の迅速な分解とフィラメントの束ねの減少の組み合わせによるものと考えています。

FtsZ-SepF細管の沈降

FtsZと特定の活性化剤との相互作用を解析するために、沈降アッセイを低速の遠心分離速度で行うことができます。この速度では、FtsZの大きな構造、例えば、SepFリングおよびFtsZBsフィラメント5によって形成される大きな細管、またはFtsZおよびZapAによって形成される束のみがペレット化され得る。低遠心分離(24,600 x g)を使用して、FtsZおよびSepFによって形成される尿細管に対するこのアプローチの実現可能性を実証しました。FtsZは、SepFとGTPの両方がサンプル中に存在した場合にのみ、バックグラウンドレベルより上のペレットで回収され(図2)、SepFの存在はFtsZ GTPase活性に影響を与えず7、SepFの存在下でFtsZが完全に活性であることを示しています。SepFとFtsZの比沈降量は、総SepFの約45%、総FtsZの約15%です(GDPを添加した場合の物質沈降と比較して)。これは、SepF-FtsZ尿細管がFtsZよりも多くのSepFを含んでいることを示しています。これは、多くのSepF環がFtsZ-SepF細管を組織化しているためと考えられます5,7。これらの尿細管におけるSepF-FtsZの正確な化学量論は不明ですが、我々の結果は、FtsZよりも多くのSepFが存在することを示唆しています。

FtsZEcおよびFtsZBsの重合および結合特性

異なるバッファーにおけるFtsZBsとFtsZEcの重合効率を特徴付けるために、90°の角度光散乱によって両方のタンパク質を分析しました。50 mM KClでは、FtsZBsは、バッファーのpHに応じてFtsZEcよりも20〜40倍高い光散乱信号を示します(図3AおよびB)これは、Buskeらの結果を確認します。26 バッファー中の KCl 濃度を増加させても、FtsZEc の光散乱シグナルには大きな影響を与えませんでした(図 3D)が、FtsZBs のシグナルは、50 mM KCl のバッファー(図 3A)と比較して、pH 7.5 で ~80 倍、pH 6.8 で ~30 倍、pH 6.5 で ~45 倍減少しました(図 3C)。FtsZポリマーの分解は、両方のタンパク質でKCl濃度が高いほど速くなります(図3CおよびD)。Pacheco-Gómezらの研究。大腸菌FtsZの重合と結合がpHに依存することを示しています。これらの著者は、50 mM KClの緩衝液では、FtsZ重合の光散乱シグナルが高く、pH 6.0ではFtsZの分解がpH 7.0と比較して長いことを発見しました8。これらの結果は、50 mM KClでのFtsZEcの重合データ(図3B)と一致しませんが、Pacheco-Gómezらが3つの異なるバッファー(HPES、MES、PIPES)を使用したことに注意する必要があります。MESのみを使用しました。したがって、pHだけでなく、緩衝液の組成(イオン強度)も50 mM KClでのFtsZポリマーの動態に影響を与えます。しかし、300 mM KClでは、バッファーの組成もpHも検出可能な方法でFtsZEcアセンブリに影響を与えませんでした。

KClを含まないバッファーでのFtsZBsの光散乱実験は、これらの条件下でタンパク質が沈殿するため不可能でした。FtsZBsの濃度を3 μMに下げると、沈殿は起こりませんでした。ただし、3μMは細胞内のFtsZの生理学的濃度ではありません。プラスチックキュベットでは、FtsZBsはpH 7.5で12 μMで沈殿しませんでしたが、pH 6.8および6.5では、KClの非存在下でもFtsZが沈殿しました。

大腸菌と枯草菌のFtsZ構造の形態

FtsZによって形成された構造はTEMによって検査されました。FtsZBは、低塩ですべてのバッファーのグリッド全体を覆う密集したポリマーに集合しました(図4A-C)。FtsZEcは、低塩分ですべてのバッファーに長いフィラメント、ケーブル、および束を形成しました(図4D-F)。しかし、FtsZEcによって形成されるポリマーの観測可能な量は、FtsZBsによって形成される量よりも少なかった。高塩緩衝液では、FtsZBはより長い一本鎖プロトフィラメントを形成し、これは束に結合しませんでした(図4G-I)。FtsZBsのプロトフィラメントは高塩濃度で構造が変化するのに対し、FtsZEcは低塩緩衝液と区別がつかない構造を形成しました(図4J-L)。FtsZEcの重合に対するpHの影響は観察されませんでしたが、FtsZBsはpH 6.5でより多くの束を形成し、密集したポリマーやシートとして見ることができます(図4B)。これらの結果は、私たちの光散乱実験と以前に発表されたTEM研究8,11,26と一致しています。

KCl高濃度および低KCl濃度でのFtsZのGTPase活性

FtsZのGTP加水分解活性は、遊離リン酸の比色分析法を用いて、さまざまな条件下で測定されました。以前に報告したように15、FtsZのGTPase活性はKCl濃度の増加とともに増加しました:使用したバッファーによって異なりますFtsZBs。300 mM KClでは、50 mM KClと比較して、FtsZEcではGTPase活性が1.5-2.5倍増加したことが示されました。50 mM KClでのGTPase活性の低下は、FtsZBsフィラメントのバンドリングによるものです。50 mM KCl では、FtsZEc ポリマーの分解が速いため、FtsZBs よりも GTPase 活性が 3 倍から 6 倍高かった。FtsZBsとFtsZEcのGTP加水分解活性の差は、おそらくFtsZBsフィラメントの結合が減少したため、300 mM KClで減少しました(図5)。

figure-results-1
図 1.沈降によるFtsZ重合の定量化 (A)12 μM FtsZを、pH 7.5(黒棒)、6.8(灰色の棒)、または6.5(白棒)で2 mM GTPまたはGDPの存在下で重合しました。ペレット化したタンパク質の量は、Coomassie染色ゲルのデンシトメトリー分析によって決定しました。GDPは特定の堆積物の制御として機能し、GDPとともに沈殿したFtsZの割合をGTPとともに沈殿させたFtsZの割合を差し引いて、グラフにプロットされた値を求めました。左:50 mM KClで沈殿したFtsZ、右:300 mM KClで沈殿したFtsZ。実験からの50 mM KCl.でのFtsZBs(上層ゲル)とFtsZEc(下層ゲル)の重合。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

figure-results-2
図 2.SepF/FtsZ細管の低速沈降。(A)12μMのFtsZBsを2 mM GDP(白棒)またはGTP(黒棒)と重合した。ペレット化したタンパク質の量は、Coomassie染色ゲルのデンシトメトリー分析によって決定しました。x軸の下の+および-記号は、反応中のFtsZおよびSepFの有無を示します。(B)クマシー染色ゲルの代表的な結果。SepFの存在下と非存在下でのFtsZBsの重合。コントロールとして、FtsZを含まないSepFを用いた。重合はGTPとGDPで行いました。(S)上清、(P)実験からのペレット画分。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

figure-results-3
図 3.12 μM FtsZEc と 12 μM FtsZBs の光散乱FtsZは2 mM GTPの存在下でアセンブルし、90°角光散乱によって重合をモニターしました。pH 7.5、pH 6.8、pH 6.5の50 mM KClでのFtsZBs(A)およびFtsZEc(B)の重合。pH 7.5、pH 6.8、pH 6.5の300 mM KClでのFtsZBs(C)およびFtsZEc(D)の重合。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

figure-results-4
図 4.電子顕微鏡で可視化したFtsZBsおよびFtsZEcポリマーの構造。(A-L)12 μM FtsZBs (A-C および G-I) と FtsZEc (D-F) および (J-L) を 2 mM GTP で重合した画像。(A-C)50 mM KClおよびpH 7.5、6.8、および6.5のバッファー中のFtsZB。(D-F)FtsZEcは、それぞれ50 mM KClおよびpH 7.5、6.8、および6.5のバッファー中。(G-I)FtsZBsを300 mM KClおよびpH 7.5、6.8、および6.5のバッファーにそれぞれ溶解。(J-L)FtsZEcは、それぞれ300 mM KClおよびpH 7.5、6.8、および6.5のバッファー中。スケールバー:100nm。拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

figure-results-5
図 5.6種類のバッファーでのFtsZ重合中のGTP加水分解。すべての実験で、2 mM GTPを使用しました。MgCl2を含まない対照試料として使用した。MgCl2を伴わないFtsZの活性は、MgCl2の存在下でのFtsZの活性から差し引かれた。左:50 mM KClでのFtsZのGTPase活性、右:300 mM KClでのFtsZのGTPase活性拡大画像を見るにはここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FtsZ活性と他のタンパク質との相互作用を迅速に分析できる一連の方法について説明します。光散乱、沈降、GTPaseアッセイ、および電子顕微鏡は、FtsZ重合を研究するために広く使用されています。既存のプロトコルにいくつかの改善を加え、FtsZアセンブリに対するさまざまな条件の影響を示し、FtsZ研究に含めるべきコントロールを提案します。

FtsZとその相互作用するタンパク質との結合によって形成される大きな構造をFtsZポリマーと区別するために、低速遠心分離を導入します。この方法は、標準的な沈降アッセイに比べて2つの利点を示します。まず、ペレット画分中のFtsZポリマーは24,600 x gでスピンダウンされないため、ペレット画分中のFtsZポリマーによってバックグラウンドが形成されません。第二に、相互作用するタンパク質で形成された構造中に存在するFtsZの量をゲルから計算することができます。この方法の2つの重要なステップは、インキュベーション時間とGTP濃度です。大きなタンパク質構造が完成したら遠心分離することが重要ですが、すべてのGTPが加水分解されるときに分解される前に。この研究の最良の制御は、FtsZとGDPの重合です。アッセイには潜在的な制限が 1 つあります。FtsZはSepFと安定した錯体を形成し、24,600 x gで簡単にスピンダウンできます。別の活性化剤またはFtsZポリマーを束ねる薬物による沈降が行われる場合は、アッセイを適応させる必要がある場合があります。インキュベーション時間を変更したり、遠心分離の速度を上げたりすることで行うことができます。

試料の適切な調製は、光散乱実験において最も重要です。タンパク質はスピニングによって事前にクリアする必要があり、使用前にすべてのバッファーをろ過する必要があります。サンプル中に凝集体が存在する場合、FtsZポリマーから得られる安定したシグナルが妨げられます。電子顕微鏡によるFtsZ構造の分析では、グリッドの準備が主なステップです。グリッド上でのサンプルインキュベーションの時間は、多かれ少なかれ圧縮されたポリマーを生成する効果があります。FtsZBsの束の場合、インキュベーション時間は、高KCl濃度のFtsZEc およびFtsZBs よりも短くする必要があります。結果を比較できるように、すべてのサンプルに12μMの濃度を使用しました。ただし、50 mM KClのFtsZBs の場合は、12 μMでグリッドが完全に飽和するため、より低いFtsZ濃度を使用する必要があります。これにより、ポリマーは非常に圧縮され、検出が困難になります。圧縮度の低いポリマーは、EMで検出する方が良いです。

GTPaseアッセイは、FtsZの構造ではなく活性を研究するために使用される唯一の実験です。Mg2+は、FtsZポリマーのGTPターンオーバーに必要です。したがって、Mg2+がない場合、FtsZはGTPを加水分解しません。したがって、Mg2+を含まないサンプルは、このアッセイでは適切なコントロールですが、Mgの陽イオンはFtsZ保存バッファーに存在します。それらは、対照サンプルに1 mM EDTAを添加することによって除去できます。このアッセイの重要なステップはインキュベーション時間です。一定時間が経過すると、FtsZ アクティビティを停止することが重要です。これは、FtsZサンプルを96ウェルプレート内のマラカイトグリーン溶液に移すことによって達成されます。ただし、マラカイトグリーンの色の開発は継続的なプロセスです。したがって、測定はすべてのサンプルに対して同時に行う必要があります。確立された順序で30秒間隔で測定を行う綿密に計画されたGTP添加プロトコルを使用すると、すべての時点で同じインキュベーションおよびサンプル処理時間を得ることができます。もう一つの重要なステップは、実験用のタンパク質の濃度を選択することです。実験では、FtsZEcとFtsZBsに2つの異なる濃度を使用しました。GTP加水分解は、FtsZBsと比較してFtsZEcの方がはるかに速いです。選択した条件下および12μMでのFtsZEcのGTPアーゼ活性は、最大5分間のみ線形であり、その後、加水分解速度は頭打ちになります。したがって、これらの条件下で実行した場合、実験からのデータを解釈することは困難です。この場合、両方のタンパク質の活性を比較できるように、FtsZEcをFtsZBsよりも低い濃度で使用する必要があります。異なる供給源からのFtsZのGTPアーゼ活性は異なる場合があります。したがって、適切な濃度を選択する必要があります。FtsZ重合の濃度は、臨界濃度をはるかに上回っている必要があります(一般に2.5〜10 μM)。FtsZの組み立てと分解のダイナミクスも重要です。一部のタンパク質は、50 mM KClのFtsZBに示されているように、GTPの添加後に重合に有意な遅れを示します。GTPaseアッセイの前に光散乱アッセイを実行して、FtsZポリマーの組み立てと分解の時間を近似することは有用です。その後、インキュベーションの時間とタンパク質の濃度を選択できます。FtsZ重合に選択する条件は重要であるため、各方法で適切なpHとKCl濃度を使用することが重要です。この研究では、pHが6.5〜7.5の範囲で、KCl濃度が0 Mから300 mMの9つの異なるバッファーを研究しました。枯草菌と大腸菌のFtsZsとその生物学的活性を分析するのに最適な条件は、生理学的レベル(7.5)に近いpHと高いKCl濃度であることに気付きました。高い KCl 濃度では、FtsZ はより高い GTP アーゼ活性を持ち、電子顕微鏡でよりよく検出できるポリマーを生成します。また、生理学的pHと高いKCl濃度は、FtsZアセンブリの研究に主に使用される他のどのバッファーよりも、FtsZと調節タンパク質の間の相互作用の研究に適していることも確認しました。FtsZBsは、高KCl濃度で研究した場合、FtsZEcと同様の活性を示します。さらに、塩濃度が低い場合、塩濃度が高いバッファーよりもpHの影響がより顕著になります。KClを含まないバッファーを使用すると、FtsZが沈殿することがあるため、塩を含まないバッファーは避けるべきです。FtsZポリマーの沈降は、KCl濃度の高いバッファーを使用する場合、低くなります。これは、FtsZと、SepFやZapAなどのFtsZフィラメントを組み立てるタンパク質との相互作用を研究する場合、これらの高次構造は遠心分離で簡単に検出できるため、利点となる可能性があります。すべての実験では、10 mM濃度のMgCl2を使用しました。比較的高い濃度のMg2+は、FtsZポリマーを安定化させ、FtsZのGTPアーゼ活性を低下させることが示されました。表2では、さまざまな研究の結果を要約し、それ以外は同一の緩衝条件を使用して、異なるMg2+濃度でのFtsZ重合およびGTPアーゼ活性を記述しています27。遊離細胞質Mg2+の測定濃度は0.9mM3です。GTPは同量のMg2+をキレート化することに注意してください。したがって、GTPase実験に最適なMg2+濃度は約2〜2.5 mMであり、生理学的レベル3に近いです。しかし、私たちの実験では、10 mM濃度のMgCl2を使用して、容易に検出可能な光散乱シグナルを取得し、沈降アッセイ中にFtsZポリマーを安定化しました。

モデル生物のFtsZにプロトコルを適用しましたが、大 腸菌 と 枯草菌、他の生物のFtsZに適応させることができます。生理学的pH、および一価および二価のカチオンの濃度は生物によって異なることに注意する必要があります。したがって、FtsZ重合の最適な条件は異なる場合があります。細菌の倍加時間と増殖条件の違いにより、FtsZの集合速度論と実験の最適な条件が異なる可能性があります。ただし、私たちのプロトコルは、他の生物からのFtsZを使用した実験の良い出発点を提供します。プロトコルは、調節タンパク質を使用したFtsZの研究、またはFtsZに対する小さな化合物および薬物の影響の研究に役立つはずです。

源重合 [FtsZ 沈降量の割合]GTPase [円周率/FtsZ/分]Mg2+ 濃度 [mM]FtsZ濃度[μM]参照
FtsZEC~28%~2.11012本作
~50%~2.41012.527
~43%~ 3.5512.527
~27%~ 4.62.512.527
NDの~5.42.5526
FtsZBs~30%~0.812本作
~52%(DEAEデキストラン使用時)~0.5101011
NDの~2.252.5526

表 2.FtsZ重合とGTPアーゼに及ぼすMg2+ の影響 この研究の結果を公開データと比較しました。すべての実験は、50 mM MES/NaOH、pH=6.5、50 mM KCl で実施されました。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利益相反は宣言されていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちの研究室での研究は、オランダ科学研究機構(DJS)からのVIDI助成金によって資金提供されています。 透過型電子顕微鏡へのアクセスを提供してくださったMarc Stuart氏と本学の電子顕微鏡学科に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
GTPロシュ10106399001パート1、2、3、4、5、6、7
厚肉ポリカーボネートチューブベックマンコールター343776パート2
オプティマMAX-XP超遠心分離機ベックマンコールター393315パート2、3
オンキャップ付きポリアロマーチューブベックマンコールター357448パート3
AIDAバイオパッケージ、1D、2D、FLRaytestイソトペンメッジャーäte GmbH15000001Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000FujifilmPart 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence SpectrometerSpectronic InstrumentsPart 5
Fluorescence CellHellma Analytics105-250-15-40Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vialElectron Microscopy SciencesG400-Cuパート6
CM120 PhilipsPart 6
96 ml x 0.2 ml PlateBIOplasticsB70501Part 7
Malachite Green Phosphate Assay KitBioAssay SystemPOMG-25HPart 7
PowerWave HT Microplate SpectrophotometerBioTekPart 7
スナップ で動作する電子顕微鏡

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  2. Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
  3. Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
  4. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
  5. Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293(2012).
  6. Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
  7. Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
  8. Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369(2011).
  9. Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
  10. Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
  11. Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
  12. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
  13. Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
  14. Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
  15. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
  16. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
  17. Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
  18. Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
  19. Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
  20. Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
  21. Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
  22. Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
  23. White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
  24. Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
  25. Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  26. Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
  27. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

FtsZ PolymerizationLight Scattering AssaySedimentation AssayGTP Hydrolysis AssayElectron MicroscopyBuffer ConditionsPotassium ChlorideEscherichia coliBacillus subtilisProtein Interaction

関連記事