方法論記事

FtsZは重合アッセイ：シンプルプロトコルと考慮事項

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DOI：

10.3791/50844

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2013年11月16日

 , 
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

この記事について

サマリー

FtsZの重合は細菌の細胞分裂に必須です。このレポートでは、FtsZ重合活性を監視するための簡単なプロトコルを詳しく説明し、バッファー組成の影響について説明します。このプロトコルは、FtsZの重合に影響を与える調節タンパク質または抗菌薬とFtsZとの相互作用を研究するために使用できます。

要約

細菌の細胞分裂の間、必須タンパク質のFtsZは、いわゆるZ-環を形成して、セルの中央に組み立てる。 FtsZは、 インビトロで GTPの存在下で長いフィラメントに重合し、重合は、いくつかのアクセサリータンパク質により調節される。 FtsZの重合は、広範囲に光散乱、沈降、GTP加水分解アッセイおよび電子顕微鏡法などの基本的な方法を用いてインビトロで研究されてきた。バッファー条件の影響は、両方のFtsZの重合特性、および調節タンパク質と相互作用するためのFtsZの能力。ここでは、FtsZの重合研究のためのプロトコルを記述し、モデルタンパク質として大腸菌、枯草菌のFtsZを使用して条件とコントロールを検証します。低速沈降アッセイは、バンドルまたはFtsZの重合体をチューブ状のタンパク質とのFtsZの相互作用の研究を可能に導入される。改良されたGTPアーゼアッセイプロトコルは、テストを可能に記載されているリン酸検出反応での発色の変化を廃止し、標準化インキュベーション時間を有する96ウェルプレートセットアップにおいて、種々の条件を用いて経時的にGTP加水分解。光散乱試験および電子顕微鏡観察用試料の調製が記載されている。複数のバッファは、FtsZの重合の研究に適した緩衝液pHおよび塩濃度を確立するために使用される。塩化カリウム高濃度の実験のほとんどのための最善の方法です。我々の方法は、E.からだけでなく、のFtsZ のインビトロ特徴付けのための出発点を提供大腸菌とB枯草菌が、他の細菌から。このように、本方法は、調節タンパク質またはFtsZの重合に影響を与える可能性抗菌薬のテストとのFtsZの相互作用の研究のために使用することができる。

概要

必須の細菌タンパク質FtsZは、細菌の細胞分裂機構の最もよく特徴付けられたタンパク質である。 FtsZは、チューブリンの原核生物相同体であるとGTP依存的にin vitroで重合する。 FtsZは、細菌の1,2への保存された自然や独自性のために新しい抗生物質のために非常に魅力的な標的である。細胞分裂の開始時に、FtsZは、他の細胞分裂タンパク質の組み立てのための足場として働くmidcellにおける細胞質分裂の環を形成する。 Z-環の形成は、分割面の正しい位置特定のために重要である。のFtsZの組立ダイナミクスは、MINC、SepF、ZapA、UgtP、エズラ2（細菌種に応じて）など、いくつかのアクセサリータンパク質によって調節されています。 FtsZの重合は、インビトロで集中的に研究されており、直プロトフィラメント、湾曲したプロトフィラメント、フィラメントのシート、フィラメントのフィラメント、チューブの束を含む多くの異なる構造がデスされている組立バッファ、ヌクレオチド、およびアッセイ3に含まれている追加のタンパク質に依存しcribed。 カウロバクターのクレセンタスにおける電子cryotomography実験は、Zリングが豊富な4をバンドルすることなく、比較的短い、非連続シングルプロトフィラメントから組み立てられていることを示唆しているが、生体内でのFtsZのプロトフィラメントのアーキテクチャは、まだ完全には理解されていません。

in vitroでは 、FtsZの重合特性及び調節タンパク質とのFtsZの相互作用は、反応バッファーの組成に敏感である。例えば、我々は最近、FtsZのC末端にSepFための相互作用部位を説明し、FtsZは宿泊 Δ16C末端TRUNCATEはもはやSepF 5に結合することが示されなかった。 SepF-FtsZは宿泊の相互作用に関するこれまでの研究では、同様のFtsZ 宿泊 Δ16はまだSepFがFtsZの上のセカンダリサイトに結合することが示唆されSepFとcosedimentedとtruncate 6。これらの研究の違いは、pH7.5でバッファ - のFtsZとSepFのない共沈降は、pH6.5の共沈降があったのに対し、切り捨てるありませんでした。反応の組成物であった。 Gündoğdu ら 。 SepFが機能していないし、pH 6.5で観察共沈降がSepFの析出はなく、FtsZの宿泊 Δ16C末端TRUNCATEとの相互作用によって引き起こされる可能性が高いことを示し、pH6.5の7に析出と指摘した。のFtsZの重合に対するpHおよびKCl濃度の影響は、以前に検討されている。 EのポリマーpH6.5で大腸菌のFtsZ（FtsZはEC）は 、より長く、より豊富な中性pH 8,9で形成されたものよりも。 Tadros ら 。バインディングのK +が FtsZのEcの重合にリンクされ、FtsZは活動10のために重要であることは注目に一価の陽イオンの存在下でのFtsZ のEcの重合を検討した。 pHがよりcriticaですSepFの前の例、およびFtsZは11日 MINCの抑制効果のpH依存性で示すように、他のタンパク質とのFtsZの相互作用は、検討されているL。 pHおよび塩濃度の両方が他のタンパク質とのFtsZの相互作用に影響を及ぼし得るように、FtsZの重合試験のための適切な条件およびコントロールを選択することが重要である。

ここでは、光散乱、電子顕微鏡、沈降、およびGTPアーゼアッセイによりFtsZの重合およびGTPase活性を研究するためのプロトコルを記述します。直角光散乱は、即座に12 FtsZの重合を研究するための標準的な方法である。私たちは、沈降およびGTPアーゼアッセイ、数の改善を導入しました。我々は、光散乱および電子顕微鏡用の試料を調製する方法を詳細に述べる。 FtsZの重合を研究する文献で使用されるいくつかのバッファがテストされ、我々は、各実験のための最高の条件を説明した。我々はまたあるべきかを制御示して最適なデータを得るために導入した。

これらのメソッドは、ほとんどの実験室で提供され、簡単な方法および装置を使用して他のタンパク質とのFtsZの重合活性および相互作用の迅速な研究を可能にする。 FtsZの重合を研究するより洗練された方法が存在するが、多くの場合、蛍光標識8,13,14とのより専門的な機器へのアクセス、および/ ​​またはFtsZのの修正が必要。このホワイトペーパーで説明の簡単な方法は、BからのFtsZを使用して説明している枯草菌および大腸菌大腸菌 、最も一般的なグラム陽性およびグラムモデル生物。プロトコルは、他のFtsZタンパク質に適合させることができる。これらの新規FtsZsによる予備アッセイに基づいて、インキュベーション時間、緩衝液または温度に関するわずかな変化は、最適な結果のために必要であり得る。ここに記載された実験は、これらの最適な条件を見つけるのに役立つはずです。

プロトコル

タグなしのFtsZタンパク質は、先に説明したように11,15 20mMトリス/塩酸（pH 7.9）、50mMのKCl、1mMのEGTA、2.5mMのMgAc及び10％グリセロールに対して透析し、精製し、そして-80℃で保存した。これらの条件下でタンパク質活性の有意な損失なしに2年以上保存することができる。タンパク質は解凍し、サンプルの凍結を回避するために、100μlアリコートに格納する必要があります。解凍後、サンプルは最大一週間4℃で保持することができる。 FtsZは、高濃度で可溶性であり、7〜10 mg / mlので保存することができる。これは、後の実験における貯蔵緩衝成分の望ましくない影響を回避するために、高タンパク質濃度を維持することが重要である。そこで、ストレージ濃度は少なくとも10倍、1％以下のグリセロール濃度をもたらすために、反応混合物中の透析緩衝液の他の成分の濃度を最小にするためののFtsZの希釈を可能にするはずである。 FtsZの重合はまた、高ナトリウム9の存在によって影響され得るまたはイミダゾールの濃度は、このように、これらのコンポーネントは、重合バッファから削除する必要があります。 7記載の-80℃での溶出バッファに格納されているようにSepFを精製したEからのFtsZの精製の ​​ための代替公表された手順大腸菌とB枯草菌ならびに異なる供給源からのFtsZの精製の ​​ための手順への参照は、（代表的な結果のセクションを参照） を表1にまとめる。

1。試料調製

  1. 重合バッファを準備します。
    1 50mMのHepes / NaOHでpHを7.5
    2 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8
    3 50 mMのMES / NaOHでpHを6.5
    4 50mMのHepes / NaOHを、pHが7.5、50mMのKCl
    5 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8、50のKCl
    6 50 mMの男ES / NaOHでpHを6.5、50のKCl
    7 50mMのHepes / NaOHを、pHが7.5、300 mMのKClを
    8 25 mMのパイプ/ NaOHでpHを6.8; 300のKCl
    9 50 mMのMES / NaOHでpHを6.5; 300のKCl
  2. フィルター22ミクロンのメンブランフィルターを用いてすべてのバッファを殺菌。
  3. （1）からの各重合液中100mMのGTP、GDPとのMgCl 2ストック溶液を準備します。
  4. 全ての実験のために4℃で20分間、100,000×gでスピンによるタンパク質プリ·クリアー。

2。 FtsZは沈降アッセイ

  1. 高速遠心分離と互換性のあるチューブで（試料調製ポイント1を参照）の重合バッファの1にMgCl 2およびFtsZはを加えることにより反応ミックスを調製する。総体積は50μlの最終容量で、12μMで10 mmとMgCl 2およびFtsZのと、49μLにする必要があります。
  2. P、関数を振盪インキュベーター中でチューブレース300rpmで30℃で2分間インキュベートする（あるいは試料を穏やかに弾き飛ばされてもよいし、短時間、30℃で予熱に続いて微量遠心）。
  3. GTPまたは実験（最終濃度2mM）で用いたのと同じ緩衝液中のGDPのストック溶液1μlを添加することにより重合を開始。 300回転（または関数を振とう培養器内）で30℃、（それぞれ、50のKClおよび300mMのKClをバッファーなど）10、または2分間インキュベートします。
  4. 超遠心ローターにチューブを移し、25℃で35万XG（TLA 120.1ローター用89700 rpm）で10分間スピンダウン
  5. 紡糸後、慎重にロータからチューブを取り外し、すぐにきれいなチューブに上清を移す。 2Xサンプルバッファー20μlに20μlの上清を添加することにより、SDS-PAGE用サンプルを準備します。 98℃で10分間沸騰させる
  6. フォートを含むペレット画分に2×試料緩衝液50μlを追加SZポリマー。 2ミリリットルチューブに超遠心管を配置します。 98℃で10分間煮沸してペレットを再懸濁し、サンプル上清サンプルと同じ2倍希釈するために、脱イオンH 2 Oを50μlを加える。
  7. 2ミリリットルチューブに逆さまに超遠心管を回して、18,000 X gでエッペンドルフ遠心機で5分間スピンダウン。 2ミリリットル管から超遠心管を取り外します。
  8. 負荷10％SDS-PAGEゲル上で並べて各上清およびペレット試料側を10μl。 150 Vでゲルを実行
  9. クマシーブリリアントブルーG-250でゲルを染色し、定量化のために保管してください。

3。スロースピンでのFtsZ沈降アッセイ

  1. ステップ2のように重合溶液を準備し、SepFおよび/またはFtsZは（最終濃度12μM）を追加します。これらの実験は、TLA-55ローターと組み合わせてベックマン使い捨て1.5mlチューブ中で行うことができる。
  2. FUを振とうしながら培養器にチューブをnctionおよび300rpmで30℃で2分間インキュベートする。
  3. ストック溶液（最終濃度2 mM）のからのGTPまたはGDPの追加1μLにより重合を開始し、300 rpmで30℃で20分間インキュベートする。
  4. 25℃で24,600×gで（TLA 55ローター、20,000 rpm）で15分間スピンダウン
  5. 上清を除去し、清潔なチューブに移す、20μLを取り、2×試料緩衝液20μlに移す。 98℃で10分間沸騰させる
  6. 脱イオンH 2 O50μlのを追加し、98℃で10分間煮沸することによりポリマーおよび再懸濁を含む画分をペレット化し、2Xサンプルバッファー50μLを追加
  7. 負荷10％SDS-PAGEゲル上で並べて各上清およびペレット試料側を10μl。 150 Vでゲルを実行
  8. クマシーブリリアントブルーG-250でゲルを染色し、定量化のために保管してください。

4。 FtsZは沈降アッセイの定量化

  1. クマシーSTAの写真を撮るゲルドキュメンテーションシステム（ 例えば 、LAS-4000、富士フイルム）を使用して、INEDゲル。
  2. ゲルのデンシトメトリー分析するのに適したプログラム（ 例えば AIDA画像解析プログラム（Raytest））でゲル画像を開いて、以下のプログラムで分析を説明します。
  3. ツールバーの「評価」ボタンをクリックしてください。
  4. リストから「2Dデンシトメトリー」を選択し、[OK]をクリックします。
  5. メインメニューで、「評価」をクリックして、「領域判定」エントリを選択します。
  6. ゲル上の領域を作成するには、領域判定ツールボックスの自動輪郭ツールのシンボルをクリックしてください。
  7. 、ゲル上のタンパク質バンドの左上隅をクリックし、マウスボタンを押したまま、バンドの所望の右下端にドラッグし、マウスボタンを離します。
  8. マークと同じ方法で、各のFtsZ / SepFバンド。
  9. 割り当てられた領域の評価に関するすべての情報は、領域レポートに記載されています。レジオを入手するにはNレポートは、領域判定ツールボックスの「表示領域レポート」ボタンをクリックしてください。
  10. レポートをエクスポートするには、メインメニューの[ファイル]をクリックし、エントリ「2D領域レポートàエクスポート」を選択します。
  11. 地域レポートでは、すべての作成された領域の強度が見つかるはず。レポートからの強度値を用いて、ペレット中のタンパク質のパーセント（FtsZの、調節タンパク質）を算出する。

5。 90°光散乱

  1. 蛍光分光計（ 例えば AMINCO-ボーマンシリーズ2）の電源を入れ、ランプは30℃でのキュベット室温度を維持するために熱変動を回避し、循環水浴をオンにするのに数分間ウォームアップすることができます
  2. 分光器の動作パラメータを定義します。検出器の高電圧300 V、発光および励起波長：350 nmのスリット幅：4 nmの。多くの分光器が自動的にcertAに実験開始時に信号を調整することに注意してください最大の割合（ 例えば 60％）である。これは、すぐに、GTPがFtsZのを重合するために追加されているように範囲外に移動するための散乱信号を発生します。これは、最初の一連の実験を開始する前に、右信号増幅検出器の高電圧に対する最大の重合を確立することが賢明です。
  3. データ収集プロトコルをプログラムします。 3600秒の持続時間、時間ベースの取得を選択します。
  4. 5分間、室温の水浴に必要 - 超音波処理した場合、水とエタノールとの蛍光キュベットを丁寧に清掃してください。このプロトコルでは、1cmの経路長及び200μlの容積を有するキュベットが使用され、貯蔵溶液（0.5〜1％のHellmanex）に格納される。代替として、単回使用の適合性プラスチックUVキュベット（UVette、エッペンドルフ）を使用することができる。
  5. 最終的な300μLに対して計算濃度、およびVORTとして10 MgCl 2および12μMのFtsZはと（サンプル調製ポイント1を参照）の重合バッファのマスターミックスの294μLを準備EX。
  6. キュベットに重合バッファー196μLを移し、分光器に入れてください。 30℃で2分間インキュベートする。
  7. データ収集を開始し、信号が安定していることを確認するために90秒間待ちます。
  8. 100のGTPまたはGDP（最終濃度：2 mm）で4μl加え200μlの最終反応容量を達成するために、買収をミックスして再開するより大きな容量ピペットで上下にピペット。

6。透過型電子顕微鏡

  1. （ボリュームは、材料を節約するために、10μlの最終容量を削減することができる）のFtsZ沈降アッセイ用としてサンプルを準備します。
  2. インキュベーション時間の後、グロー放電さ400メッシュの炭素被覆銅グリッド上に試料を2μLを適用し、15秒間インキュベートする。
  3. 優しくグリッド並列または濾紙に垂直に触れたりドラッグ​​して、グリッド乾燥ブロット。
  4. 2％の酢酸ウラニル溶液を4μLを使用してグリッドを染色。 BLOステップ6.3で説明したように、グリッドのドライT。
  5. 39200倍の倍率で120 kVので動作するフィリップスCM120電子顕微鏡グリッドを表示します。

7。 GTP加水分解アッセイ

実験の設定は、FtsZのGTPの加水分解はマラカイトグリーンとの反応物を混合することにより、種々の反応時間後に停止されるように設計されている。このようにして、マラカイトグリーンの発色の時間は、各試料について同じである。

  1. 重合バッファの1つに1.5ミリリットル2のGTPを準備します（サンプル調製、ポイント1を参照）。
    重合液中の0-40μMリン酸標準希釈液を調製し、POMG-25H（バイオアッセイ）キットで説明したようにマラカイトグリーンの作業試薬を調製。あるいは、作業試薬はLanzetta らによって記載されたプロトコルに従って社内で調製することができる。16
  2. 総量360μlのマスターミックスを準備します。 私 24μMのFtsZ BS、20のMgCl 2、重合液 2 12μMのFtsZ EC、20のMgCl 2、重合液 III（コントロール1） 24μMのFtsZ BS、2mMのEDTA、重合液 IV（コントロール2） 12μMのFtsZ EC、2mMのEDTA、重合液
  3. ピペットマスターミックス、100μlのリン酸基準や定量PCR 96ウェルプレート中2のGTP180μlを20μlのアリコートを次の順序で。
    A B C言語 D E F G H
    1 3 3 私私 4 4 2 2
    2 3 3 私私 4 4 2 2
    3 3 3 私私 4 4 2 2
    4 3 3 私私 4 4 2 2
    5 3 3 私私 4 4 2 2
    6 3 3 私私 4 4 2 2
    7 3 3 私私 4 4 2 2
    8 3 3 私私 4 4 2 2
    9 PS PS PS PS PS PS PS PS
    10 PS PS PS PS PS PS PS PS
    11
    12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP

    PS - リン酸標準
  4. 30℃で40分間周期に設定されたプログラムでPCR機で定量PCRプレートを置き
  5. malac20μlのアリコートを準備96ウェルプレート中のハイト緑色作業試薬。 1'-8 'レーンの実験から、重合液の60μlを加える。サンプルは、リン酸標準と比較4Xに希釈され、最終的な計算中に、この事実を考慮してください。
    A B C言語 D E F G H
    1 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    2 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    3 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    4 ' III 3 私私 4 4 2 2
    5 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    6 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    7 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    8 ' 3 3 私私 4 4 2 2
    9 ' PS PS PS PS PS PS PS PS
    10 ' PS PS PS PS PS PS PS PS
  6. （これは30分の反応の開始時点で）、1レーンへのGTPの20μl加えピペットを上下に混合する、タイマーを開始します。
  7. 10分後、30秒、2レーンへのGTPを追加ピペットを上下（20分反応）を混合する。
  8. 16分後に上下3、ピペット混合する（15分反応）レーンにGTPを追加します。
  9. 21分後、30秒（10分反応）をミックスするには、上下4、ピペットをレーンにGTPを追加します。
  10. 25分後（7分反応）混合する、ピペットを上下5レーンへのGTPを追加します。
  11. 27分後、30秒（5分反応）をミックスするには、上下6、ピペットをレーンにGTPを追加します。
  12. 29分後（4分の反応）を混合する、ピペットを上下7レーンへのGTPを追加..
  13. レーン1にレーン1から30分の転送を20μlの後で、上下のピペット混合する（3マラカイトグリーンの発色の出発点0分反応）。
  14. 30分後、30〜2レーン2から秒の転送20μL '、ピペットを上下（20分の反応のためにマラカイトグリーンの発色の開始点）を混合する。
  15. レーン3-7ごとに30秒間のステップを繰り返します。
  16. 33分後、30秒のために（マラカイトグリーンの発色のための0分の反応と開始時点を混合するピペットを上下、8レーンへのGTP20μlのピペットを上に追加して、ミックスダウンすると「8レーンに20μLを転送反応）。
  17. 34分後、「レーン9〜9を上下にピペット混合する（リン酸標準1用のマラカイトグリーンの発色の開始時点）を80μLを加える。
  18. 34分30秒の転送80μlの後には、上下車線から10から10 '、ピペット混合する（リン酸標準2用のマラカイトグリーンの発色の開始時点）。
  19. サンプルから全ての気泡を除去し、さらに25分間室温でプレートをインキュベート30秒。
  20. 96ウェルプレートリーダーでプレートを置き。
  21. 60分後（マラカイトグリーンの発色は、最初の反応のために今30分である）、波長630 nmでプレート10倍ごとに30秒を測定します。すべての測定は、ステップ7.6から7.12と7.16からのすべての時点に対応し、データ解析の際に別々に計算しなければなりません。
  22. リン酸標準較正曲線を用いて各サンプル中の遊離リン酸を計算する。
  23. 時間をかけてリン酸の放出などのデータをプロットし、曲線の直線範囲からのFtsZのGTP加水分解活性を計算します。

結果

さまざまな細菌由来のFtsZの精製法が文献で報告されており、表1にまとめられています。

ソース手法修飾得られた収量 [培養液 1 Lあたりのmg数]>参考文献
B. subtilis1) 硫酸アンモニウム沈殿/イオン交換クロマトグラフィーいいえ40本研究、11,15
2) アフィニティークロマトグラフィーHisタグ不検出17
*E. coli*1) 硫酸アンモニウム沈殿法／イオン交換クロマトグラフィーいいえ35本研究、11,15
2) カルシウム沈殿法、イオン交換クロマトグラフィーいいえ4018
Methanococcus jannaschii1) 変性条件下でのアフィニティークロマトグラフィー/リフォールディング/硫酸アンモニウム沈殿/ゲルろ過Hisタグ1.319
2) アフィニティークロマトグラフィー／ゲルろ過HisタグND20
Thermotoga maritimaイオン交換クロマトグラフィー／ゲル濾過いいえ6.719
Pseudomonas aeruginosaアフィニティークロマトグラフィー／ゲルろ過Strepタグ, Hisタグ不検出21
結核菌1) アフィニティー/イオン交換クロマトグラフィーいいえ不検出22
2) アフィニティークロマトグラフィー／ゲルろ過いいえ3023
Aquifex aeolicusアフィニティークロマトグラフィー／ゲルろ過Hisタグ、C末端切断（331-367）不検出（ND）24
Caulobacter crescentusイオン交換クロマトグラフィー／硫酸アンモニウム沈殿／ゲルろ過いいえND25

表 1. FtsZ 精製プロトコルの記述。ND：未決定。

FtsZポリマーの沈殿

はじめに、FtsZポリマーを沈殿させるために2種類の異なる遠心速度を用いました。その結果、350,000 x gの速度においてのみFtsZEcの単一ポリマーが沈殿し(Figure 1)、190,000 x gではFtsZBsの束のみがペレット分画に存在することが分かりました（データは示さず）。したがって、以降の実験では350,000 x gを使用しました。50 mM KClにおいて、光散乱実験ではFtsZBsの散乱信号がはるかに高いことが示されましたが、重合したFtsZEcとFtsZBsの割合は同様でした。これは、FtsZBsによって形成された束が、FtsZEcの単一ポリマーよりも光を強く散乱するためです。300 mM KClを用いた実験では、FtsZEcとFtsZBsのいずれにおいても、ペレット分画から多量のFtsZポリマーを得ることはできませんでした(Figure 1)。これは、FtsZ構造の急速な解体とフィラメントの束形成の減少が組み合わさったためであると考えられます。

FtsZ-SepF管状構造の沈殿

FtsZと特定の活性化因子の相互作用を解析するために、より低い遠心速度で沈降分析を行うことができます。この速度では、FtsZの巨大な構造体のみがペレット化されます。例として、SepFリングとFtsZBsフィラメントによって形成される巨大な管状構造5や、FtsZとZapAによって形成される束などが挙げられます。我々は、FtsZとSepFによって形成される管状構造に対し、このアプローチの実現可能性を実証するために、より低い遠心分離（24,600 x g）を用いました。サンプル中にSepFとGTPの両方が存在する場合にのみ、FtsZがバックグラウンドレベルを超えてペレット中に回収されました（Figure 2）。また、SepFの存在はFtsZのGTPase活性に影響を与えないため7、SepFの存在下でFtsZが完全に活性を持っていることが示されます。SepFおよびFtsZの特異的な沈降量は、全SepFの約45％、全FtsZの約15％でした（GDP添加時に沈降した物質と比較）。これにより、SepF-FtsZ管状構造にはFtsZよりもSepFが多く含まれていることが分かります。これは、多くのSepFリングがFtsZ-SepF管状構造を構築しているためと考えられます5,7。これらの管状構造におけるSepF-FtsZの正確な化学量論比は不明ですが、我々の結果は、FtsZよりも多くのSepFが存在していることを示唆しています。

FtsZEcおよびFtsZBsの重合および束形成特性

異なる緩衝液におけるFtsZBsおよびFtsZEcの重合効率を評価するため、両タンパク質を90°角光散乱法により解析しました。50 mM KClにおいて、FtsZBsは緩衝液のpHに応じてFtsZEcよりも20〜40倍高い光散乱信号を示し（Figures 3A and B）、Buske et al.26の結果を裏付けました。緩衝液中のKCl濃度を上げても、FtsZEcの光散乱信号には有意な影響はありませんでしたが（Figure 3D）、FtsZBsの信号は50 mM KClの緩衝液（Figure 3A）と比較して、300 mM KCl（Figure 3C）においてpH 7.5で約80倍、pH 6.8で約30倍、pH 6.5で約45倍減少しました。両タンパク質ともに、KCl濃度が高いほどFtsZポリマーの分解速度は速くなります（Figures 3C and D）。Pacheco-Gómez et al.の研究では、E. coli FtsZの重合およびバンドル形成はpH依存的であることが示されています。同著者らは、50 mM KClを含む緩衝液において、pH 7.0と比較してpH 6.0ではFtsZ重合の光散乱信号が高く、FtsZの分解に時間がかかることを見出しました8。これらの結果は、50 mM KClにおけるFtsZEcの重合に関する我々のデータ（Figure 3B）とは一致しませんが、Pacheco-Gómez et al.がMESのみを使用したのに対し、我々は3種類の異なる緩衝液（HEPES、MES、PIPES）を使用したことに留意する必要があります。したがって、50 mM KClにおいては、pHだけでなく緩衝液組成（イオン強度）もFtsZポリマーのキネティクスに影響を及ぼします。しかし、300 mM KClにおいては、緩衝液組成もpHも、検出可能なレベルでFtsZEcの構築に影響を与えませんでした。

KClを含まない緩衝液中では、これらの条件下でタンパク質が沈殿するため、FtsZBsの光散乱実験は不可能でした。FtsZBsの濃度を3 µMまで下げると沈殿は起こりませんでしたが、3 µMは細胞内におけるFtsZの生理的濃度ではありません。プラスチック製キュベットにおいては、pH 7.5で12 µMのFtsZBsは沈殿しませんでしたが、pH 6.8および6.5では、KClがない状態でFtsZは依然として沈殿しました。

E. coliおよびB. subtilisにおけるFtsZ構造の形態

FtsZによって形成された構造をTEMで観察した。低塩濃度のすべての緩衝液において、FtsZBsはグリッド全体を覆う密に凝集したポリマーを形成した（図 4A-C）。低塩濃度のすべての緩衝液において、FtsZEcは長いフィラメント、ケーブル、および束を形成した（図 4D-F）。しかし、FtsZEcによって形成されたポリマーの観察量は、FtsZBsによって形成された量よりも少なかった。高塩濃度の緩衝液では、FtsZBsは束にならずに単一鎖のより長いプロトフィラメントを形成した（図 4G-I）。FtsZBsのプロトフィラメントは塩濃度が高くなると構造を変化させたが、FtsZEcは低塩濃度の緩衝液でのものと区別がつかない構造を形成した（図 4J-L）。FtsZEcの重合に対するpHの影響は観察されなかったが、FtsZBsはpH 6.5においてより多くの束を形成し、それらは密に凝集したポリマーおよびシートとして観察された（図 4B）。これらの結果は、我々の光散乱実験および既報のTEM研究8,11,26と一致している。

高および低KCl濃度におけるFtsZのGTPase活性

遊離リン酸の比色分析を用いて、異なる条件下でのFtsZのGTP加水分解活性を測定した。既報15の通り、FtsZのGTPase活性はKCl濃度の増加に伴って上昇した。使用したバッファーによって異なるが、50 mM KClと比較して300 mM KClにおいて、FtsZBsは3〜7倍、FtsZEcは1.5〜2.5倍のGTPase活性の増加を示した。50 mM KClにおけるGTPase活性の低下は、FtsZBsフィラメントの束化によるものである。50 mM KClでは、FtsZEcポリマーの解離がより速いため、FtsZEcはFtsZBsよりも3〜6倍高いGTPase活性を示した。FtsZBsとFtsZEcのGTP加水分解活性の差は、300 mM KClでは縮小したが、これはFtsZBsフィラメントの束化が抑制されたためと考えられる（Figure 5）。

FtsZ 重合、%ペレット分析、棒グラフ、ゲル電気泳動、GTP/GDP 効果の比較。
図 1. 沈降法による FtsZ 重合の定量化。(A) 12 µM FtsZ を、2 mM GTP または GDP 存在下、pH 7.5（黒色棒）、6.8（灰色棒）、または 6.5（白色棒）で重合させた。ペレット化したタンパク質量は、クマシー染色ゲルのデンシトメトリー分析によって決定した。GDP を特異的沈降のコントロールとして用い、GDP で沈降した FtsZ の割合を GTP で沈降した FtsZ の割合から差し引いて、グラフにプロットした値を得た。左：50 mM KCl で沈降させた FtsZ、右：300 mM KCl で沈降させた FtsZ。 (B) クマシー染色ゲルの代表的な結果。50 mM KCl における FtsZBs（上段ゲル）および FtsZEc（下段ゲル）の重合。(S) 上清、(P) 実験によるペレット分画。ここをクリックして拡大画像を表示。

FtsZとSepFの相互作用グラフ、およびタンパク質の沈殿率に対するGTP/GDPの影響を示すゲル画像。
図 2. 低速でのSepF/FtsZチューブルの沈殿。 (A) 12 µM FtsZBsを2 mM GDP（白色バー）またはGTP（黒色バー）を用いて重合させた。沈殿したタンパク質量は、Coomassie染色ゲルの密度分析により決定した。x軸下の＋およびーの記号は、反応液におけるFtsZおよびSepFの存在または不在を示す。(B) Coomassie染色ゲルの代表的な結果。SepF存在下および不在下でのFtsZBsの重合。コントロールとして、FtsZを含まないSepFを用いた。重合はGTPおよびGDPを用いて行った。(S)は上清、(P)は本実験の沈殿画分を示す。ここをクリックして拡大画像を表示。

KCl濃度におけるFtsZの光散乱グラフ。pH 6.5、6.8、7.5の影響を示す。
図3. 12 μM FtsZEcおよび12 μM FtsZBsの光散乱。 FtsZは2 mM GTPの存在下で重合させ、重合状態を90°角度光散乱によりモニタリングした。50 mM KClにおけるpH 7.5、pH 6.8、pH 6.5でのFtsZBs (A)およびFtsZEc (B)の重合。300 mM KClにおけるpH 7.5、pH 6.8、pH 6.5でのFtsZBs (C)およびFtsZEc (D)の重合。ここをクリックして拡大画像を表示。

異なるpHおよびKCl濃度におけるFtsZポリマーの電子顕微鏡観察。構造解析。
図4. 電子顕微鏡により可視化したFtsZBsおよびFtsZEcポリマーの構造。 (A-L) 2 mM GTPで重合させた12 µM FtsZBs (A-CおよびG-I)およびFtsZEc (D-F)および(J-L)の画像。(A-C) 50 mM KClを含むバッファー中で、pH 7.5、6.8、6.5の順に示したFtsZBs。(D-F) 50 mM KClを含むバッファー中で、pH 7.5、6.8、6.5の順に示したFtsZEc。(G-I) 300 mM KClを含むバッファー中で、pH 7.5、6.8、6.5の順に示したFtsZBs。(J-L) 300 mM KClを含むバッファー中で、pH 7.5、6.8、6.5の順に示したFtsZEc。スケールバー：100 nm。ここをクリックして拡大画像を表示。

GTPase活性グラフ。50mM対300mM KClにおけるFtsZの棒グラフ、pH変動は7.5、6.8、6.5。
図5. 6種類の異なる緩衝液におけるFtsZ重合中のGTP加水分解。すべての実験において2 mM GTPを使用した。コントロールとしてMgCl2を含まないサンプルを使用した。MgCl2存在下でのFtsZの活性から、MgCl2なしの状態でのFtsZの活性を差し引いた。左：50 mM KClにおけるFtsZのGTPase活性。右：300 mM KClにおけるFtsZのGTPase活性。ここをクリックして拡大画像を表示。

ディスカッション

FtsZ活性と他のタンパク質との相互作用を迅速に分析できる一連の方法について説明します。光散乱、沈降、GTPaseアッセイ、および電子顕微鏡は、FtsZ重合を研究するために広く使用されています。既存のプロトコルにいくつかの改善を加え、FtsZアセンブリに対するさまざまな条件の影響を示し、FtsZ研究に含めるべきコントロールを提案します。

FtsZとその相互作用するタンパク質との結合によって形成される大きな構造をFtsZポリマーと区別するために、低速遠心分離を導入します。この方法は、標準的な沈降アッセイに比べて2つの利点を示します。まず、ペレット画分中のFtsZポリマーは24,600 x gでスピンダウンされないため、ペレット画分中のFtsZポリマーによってバックグラウンドが形成されません。第二に、相互作用するタンパク質で形成された構造中に存在するFtsZの量をゲルから計算することができます。この方法の2つの重要なステップは、インキュベーション時間とGTP濃度です。大きなタンパク質構造が完成したら遠心分離することが重要ですが、すべてのGTPが加水分解されるときに分解される前に。この研究の最良の制御は、FtsZとGDPの重合です。アッセイには潜在的な制限が 1 つあります。FtsZはSepFと安定した錯体を形成し、24,600 x gで簡単にスピンダウンできます。別の活性化剤またはFtsZポリマーを束ねる薬物による沈降が行われる場合は、アッセイを適応させる必要がある場合があります。インキュベーション時間を変更したり、遠心分離の速度を上げたりすることで行うことができます。

試料の適切な調製は、光散乱実験において最も重要です。タンパク質はスピニングによって事前にクリアする必要があり、使用前にすべてのバッファーをろ過する必要があります。サンプル中に凝集体が存在する場合、FtsZポリマーから得られる安定したシグナルが妨げられます。電子顕微鏡によるFtsZ構造の分析では、グリッドの準備が主なステップです。グリッド上でのサンプルインキュベーションの時間は、多かれ少なかれ圧縮されたポリマーを生成する効果があります。FtsZBsの束の場合、インキュベーション時間は、高KCl濃度のFtsZEc およびFtsZBs よりも短くする必要があります。結果を比較できるように、すべてのサンプルに12μMの濃度を使用しました。ただし、50 mM KClのFtsZBs の場合は、12 μMでグリッドが完全に飽和するため、より低いFtsZ濃度を使用する必要があります。これにより、ポリマーは非常に圧縮され、検出が困難になります。圧縮度の低いポリマーは、EMで検出する方が良いです。

GTPaseアッセイは、FtsZの構造ではなく活性を研究するために使用される唯一の実験です。Mg2+は、FtsZポリマーのGTPターンオーバーに必要です。したがって、Mg2+がない場合、FtsZはGTPを加水分解しません。したがって、Mg2+を含まないサンプルは、このアッセイでは適切なコントロールですが、Mgの陽イオンはFtsZ保存バッファーに存在します。それらは、対照サンプルに1 mM EDTAを添加することによって除去できます。このアッセイの重要なステップはインキュベーション時間です。一定時間が経過すると、FtsZ アクティビティを停止することが重要です。これは、FtsZサンプルを96ウェルプレート内のマラカイトグリーン溶液に移すことによって達成されます。ただし、マラカイトグリーンの色の開発は継続的なプロセスです。したがって、測定はすべてのサンプルに対して同時に行う必要があります。確立された順序で30秒間隔で測定を行う綿密に計画されたGTP添加プロトコルを使用すると、すべての時点で同じインキュベーションおよびサンプル処理時間を得ることができます。もう一つの重要なステップは、実験用のタンパク質の濃度を選択することです。実験では、FtsZEcとFtsZBsに2つの異なる濃度を使用しました。GTP加水分解は、FtsZBsと比較してFtsZEcの方がはるかに速いです。選択した条件下および12μMでのFtsZEcのGTPアーゼ活性は、最大5分間のみ線形であり、その後、加水分解速度は頭打ちになります。したがって、これらの条件下で実行した場合、実験からのデータを解釈することは困難です。この場合、両方のタンパク質の活性を比較できるように、FtsZEcをFtsZBsよりも低い濃度で使用する必要があります。異なる供給源からのFtsZのGTPアーゼ活性は異なる場合があります。したがって、適切な濃度を選択する必要があります。FtsZ重合の濃度は、臨界濃度をはるかに上回っている必要があります(一般に2.5〜10 μM)。FtsZの組み立てと分解のダイナミクスも重要です。一部のタンパク質は、50 mM KClのFtsZBに示されているように、GTPの添加後に重合に有意な遅れを示します。GTPaseアッセイの前に光散乱アッセイを実行して、FtsZポリマーの組み立てと分解の時間を近似することは有用です。その後、インキュベーションの時間とタンパク質の濃度を選択できます。FtsZ重合に選択する条件は重要であるため、各方法で適切なpHとKCl濃度を使用することが重要です。この研究では、pHが6.5〜7.5の範囲で、KCl濃度が0 Mから300 mMの9つの異なるバッファーを研究しました。枯草菌と大腸菌のFtsZsとその生物学的活性を分析するのに最適な条件は、生理学的レベル(7.5)に近いpHと高いKCl濃度であることに気付きました。高い KCl 濃度では、FtsZ はより高い GTP アーゼ活性を持ち、電子顕微鏡でよりよく検出できるポリマーを生成します。また、生理学的pHと高いKCl濃度は、FtsZアセンブリの研究に主に使用される他のどのバッファーよりも、FtsZと調節タンパク質の間の相互作用の研究に適していることも確認しました。FtsZBsは、高KCl濃度で研究した場合、FtsZEcと同様の活性を示します。さらに、塩濃度が低い場合、塩濃度が高いバッファーよりもpHの影響がより顕著になります。KClを含まないバッファーを使用すると、FtsZが沈殿することがあるため、塩を含まないバッファーは避けるべきです。FtsZポリマーの沈降は、KCl濃度の高いバッファーを使用する場合、低くなります。これは、FtsZと、SepFやZapAなどのFtsZフィラメントを組み立てるタンパク質との相互作用を研究する場合、これらの高次構造は遠心分離で簡単に検出できるため、利点となる可能性があります。すべての実験では、10 mM濃度のMgCl2を使用しました。比較的高い濃度のMg2+は、FtsZポリマーを安定化させ、FtsZのGTPアーゼ活性を低下させることが示されました。表2では、さまざまな研究の結果を要約し、それ以外は同一の緩衝条件を使用して、異なるMg2+濃度でのFtsZ重合およびGTPアーゼ活性を記述しています27。遊離細胞質Mg2+の測定濃度は0.9mM3です。GTPは同量のMg2+をキレート化することに注意してください。したがって、GTPase実験に最適なMg2+濃度は約2〜2.5 mMであり、生理学的レベル3に近いです。しかし、私たちの実験では、10 mM濃度のMgCl2を使用して、容易に検出可能な光散乱シグナルを取得し、沈降アッセイ中にFtsZポリマーを安定化しました。

モデル生物のFtsZにプロトコルを適用しましたが、大 腸菌 と 枯草菌、他の生物のFtsZに適応させることができます。生理学的pH、および一価および二価のカチオンの濃度は生物によって異なることに注意する必要があります。したがって、FtsZ重合の最適な条件は異なる場合があります。細菌の倍加時間と増殖条件の違いにより、FtsZの集合速度論と実験の最適な条件が異なる可能性があります。ただし、私たちのプロトコルは、他の生物からのFtsZを使用した実験の良い出発点を提供します。プロトコルは、調節タンパク質を使用したFtsZの研究、またはFtsZに対する小さな化合物および薬物の影響の研究に役立つはずです。

源重合 [FtsZ 沈降量の割合]GTPase [円周率/FtsZ/分]Mg2+ 濃度 [mM]FtsZ濃度[μM]参照
FtsZEC~28%~2.11012本作
~50%~2.41012.527
~43%~ 3.5512.527
~27%~ 4.62.512.527
NDの~5.42.5526
FtsZBs~30%~0.812本作
~52%(DEAEデキストラン使用時)~0.5101011
NDの~2.252.5526

表 2.FtsZ重合とGTPアーゼに及ぼすMg2+ の影響 この研究の結果を公開データと比較しました。すべての実験は、50 mM MES/NaOH、pH=6.5、50 mM KCl で実施されました。

開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

私たちの研究室での研究は、オランダ科学研究機構(DJS)からのVIDI助成金によって資金提供されています。 透過型電子顕微鏡へのアクセスを提供してくださったMarc Stuart氏と本学の電子顕微鏡学科に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
GTPロシュ10106399001パート1、2、3、4、5、6、7
厚肉ポリカーボネートチューブベックマンコールター343776パート2
オプティマMAX-XP超遠心分離機ベックマンコールター393315パート2、3
オンキャップ付きポリアロマーチューブベックマンコールター357448パート3
AIDAバイオパッケージ、1D、2D、FLRaytestイソトペンメッジャーäte GmbH15000001Part 4
Luminescence Image Analyzer LAS-4000FujifilmPart 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence SpectrometerSpectronic InstrumentsPart 5
Fluorescence CellHellma Analytics105-250-15-40Part 5
Square 400 Mesh, Copper, 100/vialElectron Microscopy SciencesG400-Cuパート6
CM120 PhilipsPart 6
96 ml x 0.2 ml PlateBIOplasticsB70501Part 7
Malachite Green Phosphate Assay KitBioAssay SystemPOMG-25HPart 7
PowerWave HT Microplate SpectrophotometerBioTekPart 7
スナップ で動作する電子顕微鏡

参考文献

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