方法論記事

のためのマイクロメトリックプローブの遠隔磁気作動

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DOI：

10.3791/50857

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2014年5月2日

 ,  ,  ,  , 
1Physicochime Curie, CNRS UMR 168, Institut Curie, Sorbonne Universités, UPMC, 2Unité de Génétique des Biofilms, Institut Pasteur, 3Laboratoire Jean Perrin, CNRS UMR 8237, Sorbonne Universités, UPMC

この記事について

サマリー

本論文では、細菌バイオフィルムと、その場で界面で微生物によって構築された複雑な生活材料の局所的な機械的特性を測定するための専用の磁気ピンセットの開発に播種磁性粒子の遠隔操作に基づいて、元の方法論を示しています。

要約

インターフェイス上の細菌の付着と成長が3次元不均質な構造、いわゆるバイオフィルムの形成につながる。これらの構造の住居の細胞は、細胞外高分子物質のネットワークが介在する物理的な相互作用によって一緒に保持されている。細菌バイオフィルムは、多くの人間の活動に影響を与え、その性質を理解することは、彼らの開発のより良い制御のために重要である - 保守または根絶 - 彼らの有害または有益な結果に依存。本稿では、今まで、唯一の肉眼的および均質材料の観点から検討、 その場にあったバイオフィルムの局所的な物性を測定することを目指して新たな方法論を説明します。ここに記載された実験は、リモートでバイオフィルムの構造特性を乱すことなく作動させることができるローカルなプローブをシードする成長バイオフィルムに磁性粒子を導入することを含む。専用の磁気ピンセットDEVEたバイオフィルムに埋め込まれた各粒子に定義されている力を発揮するloped。セットアップは、粒子引上げ期間のタイムラプス画像の記録を可能にするために顕微鏡のステージに取り付けられている。粒子軌道はその後引っ張っ配列から抽出され、ローカル粘弾性パラメータは、これにより、パラメータの3次元空間分布を提供し、各粒子変位曲線から誘導される。バイオメカニカルプロファイルに洞察を得ることは、アーキテクチャの特性と、これらの構造の具体的な生物学の間の関係を明確にするために、バイオフィルム制御のためのビューの技術者の視点からだけでなく、根本的な観点から必要不可欠である。

概要

細菌バイオフィルムは、生物学的または人工表面1-3に関連する細菌の共同体である。彼らは建物4,5を保護し、安定化多糖類を多く含む細胞外マトリックスの生産と相まって接着成長機構によって構成している。これらのバイオフィルムは、表面に付着した細胞の単に受動的な集合体ではなく、組織化され、動的な複雑な生物系。細菌が浮遊性のバイオフィルムのライフスタイルに切り替えると、遺伝子発現および細胞生理の変化が観察されただけでなく、抗菌剤に対する耐性を増加させ、多くの持続的かつ慢性感染症6の原点にあること免疫防御をホストしている。しかし、これらの生活の構造の制御された開発はまた、有害廃棄物処理場のバイオレメディエーション、工業用水やcontaminから土壌·地下水を保護するためのバイオ障壁の形成のバイオろ過などの産業や環境のアプリケーションのための機会を提供ATION。

生活のバイオフィルム方法と特定の分子の機能がますます記載されているが、地域社会の発展と持続性を駆動するメカニズムは不明である。走査型電気化学または蛍光顕微鏡を用いてマイクロスケール測定に関する最近の進歩を用いて、これらの生体組織はかなりの構造的、化学的および生物学的な異質7を示すことが示されている。しかし、今までは、バイオメカニクスは、主にマクロ的に検討されている。例えば、バイオフィルムストリーマの観測は、流体の流量8,9の変化による変形、バイオフィルム片の一軸圧縮を寒天培地から持ち上げたり、カバーをして10,11、環境から収集されたバイオフィルムのせん断および並列に転送をスライド上で増殖プレートレオメーター12,13、AFMカンチレバー14または専用MICRに付着した細菌バイオフィルムとガラスビーズおよびコーティングを使用した原子間力分光法15,16は、材料17の粘弾性の性質に関する有用な情報を提供し、最後の10年間に実施されてきた離脱バイオフィルム断片の引張強度を測定する方法ocantilever。しかしながら、材料はしばしば、これらのアプローチであった場合、その天然の環境から取り出されたとき、その場バイオフィルムの機械的特性の情報が失われる可能性が高いようである。また、均質な材料としてバイオフィルムの治療は、コミュニティ内での物理的性質の可能性のある不均一性に関する情報をミス。したがって、構造バイオフィルム形成における力学とそのような遺伝子発現のパターニングまたは化学的勾配のような生物学的特性の正確な影響はほとんど認められないことができる。バイオフィルムの物理的性質のマイクロスケールの記述に向けて進行し、新たな専用のツールが必要です。

本論文では、達成するために考案さ独創的なアプローチを詳述バイオフィルムを妨害し、マイクロスケールの材料特性の空間分布の描画した後、機械的な不均一性を可能にすることなく、 その場での局所的な機械的パラメータの測定、。実験の原理は、成熟したバイオフィルムの磁気ピンセットを使用してリモートローディングが続く磁性微粒子と成長しているバイオフィルムのドーピングにかかっている。顕微鏡下で画像化され、制御磁気力作用下の粒子変位は、地元の粘弾性パラメータ導出、独自のローカル環境を報告し、各粒子を可能にします。これらのデータから、バイオフィルムの機械的な3Dプロファイルは、空間的および環境条件依存性を明らかにし、引き出すことができる。実験全体を大腸菌にここに表示されます大腸菌バイオフィルムは抑制解除のF様プラスミドを有する遺伝子改変株によって行われた。最近の論文18に詳細な結果は、無傷のバイオメカニクスの内部のユニークなビジョンを提供します。

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プロトコル

1。細菌培養および懸濁製剤

  1. 溶原性ブロス（LB）寒天プレートから新鮮に成長したコロニーを選び、5ミリリットルで100μグラム/ mlのアンピシリンおよび7.5μグラム/ mlのテトラサイクリンを含む液体LB培地をそれに接種し、37℃のオンで​​5〜6時間のためにそれをインキュベート揺れプラットフォーム。
  2. その後、最小培地（M63B1）は0.4％グルコースと同じ抗生物質濃度を補っ5ミリリットル中の細菌培養の100μLを追加します。揺れプラットフォーム上で37℃で、この新たに希釈した培養を一晩培養する。
  3. インキュベーションの16時間後、5ミリリットルM63B1、0.4％グルコースに一晩培養μlの100を追加します。 0.5 ODに達するまで揺れプラットフォームに37℃でチューブを保管してください。サスペンションは、バイオフィルム形成のための実験チャネルに注入するための準備ができる。

2磁気粒子調製

  1. 10μlの磁性粒子を取る -直径2.8μM -在庫から、それらを磁気サンプルラックを用いて190μlの最小培地中で3倍洗う。
  2. 5×10 6ビーズ/ mlに粒子濃度を調整します。典型的に洗浄し、ビーズ溶液の50μlを、0.4％グルコースを有するM63B1のさらなる950μリットルと混合される。

3。チャンネルの調製とバイオフィルムの成長

  1. チャンネル取り付け
    1. 2長さ8cmの部分を得るために長さ10cm 2の正方形（800μmの辺の長さ）ホウケイ酸ガラスキャピラリーを切った。
    2. 最初の半分にカット- - （SOスーパーグルーと呼ばれる）即効性シアノアクリレート接着剤を使用して、図1のように、どちらかの端に1cmのオーバーハングとは別に2センチメートル2枚のスライドガラス上に2つのキャピラリー部分を接着します。
    3. 全体のセットアップと、さらにチャネル接続に必要な必要なチューブをオートクレーブ。
    4. 下のすべての無菌材料を集める層流フード：I）を搭載し、チャネルとトラップ1、II）、チューブやコネクタ、III）2バブルトラップ - バブルフィルタは一般的に子供の点滴送り（トラップ1）と自家製気泡トラップを保護するために使用大きな直径の長さ4cmの管（トラップ2）のような、iv）のクランプ、v）をM63B1、0.4％グルコース、およびvi）廃液ボトルが充填された30ミリリットルの注射器。
    5. 廃液ボトルにシリンジポンプ、小児バブルフィルタ、自家製の気泡トラップ、キャピラリー（ 図1、パネルB）、チューブによって制御さ50ミリリットルM63B1注射器：次の順序でルアーロックconnectersまたは接合を有する全体のセットアップを接続します。その後、約10ミリリットルの実験の料金よりも高く/時の速度でシリンジポンプの電源を入れる、無菌M63B1、0.4％グルコースをセットアップを埋める。慎重に追跡し、回路内のすべての気泡を除去する。
    6. 10〜15分間システムを介してメディアを流す。同時にセクションからOD 0.5で細菌懸濁液1mlをミックス2.2節で作成洗浄ビーズ溶液1mLで1.3。
    7. 前後の毛細血管：添付します（ただし、閉じないでください）​​2の位置でチューブにクランプします。流れを切ります。
    8. ホーム管は空気流入を防止するために、終了まで保持するように注意しながら、1ミリリットルの注射器を使用して気泡トラップを作った後にキャピラリーに細菌 - ビーズ混合物をご紹介します。チューブを再び取り付けてからクランプを閉じます。
    9. 第2の毛管のために同じ手順を繰り返し、気泡のためのすべてのチューブをご確認ください。
    10. 顕微鏡に装置を転送し、それを解決し、キャピラリーの表面に付着する細菌を可能にするために15〜20分間放置する。わずかに高いレベルでの廃棄物容器に顕微鏡ステージ上に毛細血管をインストールします。顕微鏡の横のカウンターの上にシリンジポンプを配置します。気泡を捕捉する毛管面よりもわずかに高い毛管前に気泡トラップを上昇させる。
  2. バイオフィルムグロWTH
    1. シリンジポンプでの流量を調整し、フローを開始し、バイオフィルムは現在、必要な期間の間にキャピラリー表面に発展する - これらの実験では、通常は24または48時間。
    2. キャピラリー底面に焦点を当て、サンプル画像のタイムラプス撮影を開始 - 2画像の通常取得頻度/分を十分にバイオフィルムの成長を報告します。このビデオモニター、バイオフィルムの成長後のコントロール（ ビデオ1、2および3の抽出を参照してください）。

4。磁気ピンセットのインストール

  1. 手動で制御のXYZマイクロマニピュレータ上の磁気ピンセットをねじ込み、比較的毛細血管にピンセットの位置を調整する顕微鏡ステージ上でマニピュレーターをねじ込みます。適切な磁場勾配が観察ゾーンにおいて生成されていることを確認するために、図2のようにピンセットを置く。
  2. ピンセットをTに接続するO電力増幅器を介してファンクション·ジェネレータは、24秒でゼロ信号及び4の配列を提供する信号同期のための20秒後に明視野光シャッターに送られ、トリガとの直接的な電流の16秒からなる時間の40秒の周期を生成する図3のようなイベント。
    注：これらの2つの操作は、キャピラリーのインストールと測定開始までの任意の時点で達成することができる。 図4の概要スケッチを試して参照してください。

5。クリープ曲線取得

  1. 左側の磁極と同じ観察視野内の毛細血管の左端の端を持って来るために顕微鏡ステージのXY移動コントロールを使用します。 （ 図2参照）は、それぞれ、毛細管の端部によって規定されるx軸およびy軸の交点と磁極片の端部で解析参照の起源を取る。
  2. ファインフォーカスcを用いてキャピラリーの垂直位置を調整する顕微鏡位置のontrolつまみ。通常、最初に検査面はμ4から7の間メートルキャピラリー底部の上方に位置しています。 ビデオ1は、空間参照の原点にその左上隅を持つXYフィールドに対応しています。
  3. ビデオ1の画像取得シーケンスをトリガ手動で、電流発生器に同時に切り替えることにより、セクション4.2および図3に記載されたイベントの40秒シーケンスをトリガする。
  4. 左に顕微鏡ステージの250μmの翻訳で隣人右のフィールドに、キャピラリを移動し、スライス2のビデオ2を生成するというように、必要なビデオを得るために、セクション5.3のように動作します。 250×250μm 2の典型的に3〜4のフィールドは平面を変更し、新たな面に対して同じ動作を繰り返す前に、x軸に沿って収集される。

6。フォースキャリブレーション

  1. 双方向の蒸留水190μLと2×10 9個/ mlの磁性粒子の10μlのグリセロールの39.8グラムを混合することによってグリセロール溶液を調製し、この混合物を用いて実験的なチャネルを記入し、顕微鏡のステージ上に置きますバイオフィルム試料から調製した。
  2. セクション4に示すように、磁気ピンセットをインストールした後、5.4節に示されているように、磁力を適用し、キャリブレーションファイルを導き出すために、毛細管内の各単一粒子速度（V）とその位置を抽出するために、タイムラプス画像を作る。このファイルには、キャピラリの分析ストークスの法則によると、F =6πRηv（：粒子の半径R）のゾーン内の位置の関数として加えられた力が含まれている必要があります。

7。分析

  1. セクション5に示すように取得された画像のすべてのスタックの各フレーム内のパーティクルの位置でテキストフ​​ァイルを取得するために「粒子トラッカー」ソフトウェアを使用してください。使うgの画像スタック取得周波数は、時間の関数としての粒子変位（ 例えば、 図5およびビデオ4）を計算する。
  2. フォースキャリブレーションファイルを使用して、コンプライアンス曲線に変位曲線を変換する（材料の全コンプライアンス- J（t）は、 -時間の関数として）コンプライアンス式に従って。
    figure-protocol-1
    これは、材料の歪みとの関係を与え、予めSchnurr及び共同研究者19によって確立された非圧縮性の、均質な粘弾性媒体に埋め込 ​​まれた半径Rのプローブ粒子のために応力を印加する。
  3. 粘弾性材料のための一般的なバーガーモデルにクリープコンプライアンス曲線を調整し、粘弾性パラメータを導出、J 0、J 1、0η、各粒子のためのη1（ バーガー'式に基づいて図6）。
    figure-protocol-2
    注：この現象論的分析は、以前はそのような巨視的なレオロジーデータ20-22を解釈するバイオフィルムのような生物学的材料を含む広範囲の材料のために採用されている。

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結果

典型的な分析は、元の配置を乱すことなく、生きている生物膜上にミクロンスケールでの粘弾性パラメータの空間分布を提供する。弾性コンプライアンス- -深さに沿っおよびバイオフィルムの横方向寸法に沿ってy軸、z軸の関数として与えられる典型的な結果は、J 0の値は、図7に示されている。各ポイントは、クリープ曲線分析は、J 0の値を提供したビーズに対応している。データは、ほぼ3桁以上のバイオフィルムの深さに沿って地元のコンプライアンスが変化していることを明らかにしただけでなく、その強い横異質性は、すべての生物膜の高さで行われた。

データはまた、バイオフィルムの機械的特性によって支持されたという強い指示を与える、ここに広範で非対称な形状（ 図8）を示したコンプライアンス値の分布へのアクセスを与え非常に高分子ゲルを架橋。実際、類似の挙動は、以前に濃縮され、高度に架橋されたアクチンゲル23で実証されている。

また...

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ディスカッション

この磁性粒子は、播種し、元の状態で成長しているバイオフィルムの粘弾性パラメータをその場で 3Dマッピングで有効になって実験を引っ張って。このアプローチは、Eの機械的な不均一性を明らかにした大腸菌バイオフィルムは、ここで増殖させ、細胞外マトリックスに強く、より正確には架橋の程度の基本的な意味を示唆し、バイオフィルムの物理的特性を支持するバイオフィルムの成分を指摘する手がかりを与えた。

細菌バイオフィルムでの機械的性質のパターンの認識は、これらの複雑な材料の総合的な表現を構築するために重要です。これらの知見は、機械的なパターンや、バイオフィルムの開発を支える原動力の明確化に役立つはずの遺伝子発現microniches、のような生物学的不均一を結ぶ因果関係を明確にする道を開く。

これまで、バイオメカの質問nicalプロパティは、ビューのマクロな観点から、主に対処し、多くの場合、情報損失の重要なリスクを表し、その最初のサイト8,9,12...

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開示事項

我々は、開示することは何もありません。

謝辞

この作業は、部分的には通信社国立からの補助金によって支えられてLAルシェルシュ、PIRIbioプログラムDynabiofilmを注ぎ、CNRS学際リスクプログラムから。我々は、 大腸菌を提供するための原稿の彼の重要な読書のためのフィリップThomenとクリストフBeloinに感謝本研究で使用した大腸菌株 。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Table 1: 試薬と細胞
磁性粒子生命技術14307Dマイクロメトリック磁気粒子, 2.8 & マイクロ;m直径
アンピシリン(抗生物質)シグマ・アルドリッチA9518
テトラサイクリン(抗生物質)シグマ・アルドリッチ87128
細菌株MG1655gfpFUGB、パスツール研究所、フランスピシリンとテトラサイクリンに耐性のある表面でFピリを生成します。
表2:
小児灌流用フィルターProdimed-Plastimed6932002
中空正方形の毛細血管複合金属科学8280-100ホウケイ酸ガラスで製造されています。正方形 0.8 mm x 0.8 mm
チューブ シリコーン過酸化水素VWR 国際228-0512直径 1 mm
チューブ シリコーン過酸化水素VWR 国際228-0700直径 3 mm
表 3: バイオフィルム成長
リソジェニーブロス (LB) 溶液Amresco-VWRJ106-10PK細菌の増殖に使用される標準培地。
M63B1溶液自家製バクテリアを育てるために使用される標準的な最小培地。
グルコースSigma-AldrichG82700.4%グルコースを含むM63B1培地を作るために使用されます。
Table 4: 電子機器
カメラEMCCD  浜松C9100-02
ヒーターコントローラー世界の精密機器300354
機能発電機アジレントテクノロジー33210A
パワーアンプ自作最大4Aの振幅の電流信号を提供します。
シリンジポンプKd ScientificKDS-220
シャッターVincent AssociatesUniblitz T132
磁気ピンセット自家製2つの電磁極、それぞれ直径0.56mmの銅線と軟磁性合金コア(Supra50-Arcelor Mittal、フランス)の2,120回転の銅コイルでできており、図10に示されている青写真に従って正方形に成形されています。2つのコアは、キャピラリーの長さに沿って一方向に磁力を発生させるために、南極に面してN極に取り付けられています。コイルの配線の詳細については、図 11を参照してください。
Table 5: 光学
系倒立顕微鏡 ニコンTE-300
S Fluor x40 対物レンズ (NA 0.9, WD0.3)ニコン深部のバイオフィルムを観察できる長距離対物レンズです。
落射蛍光フィルター:1)緑色蛍光の場合:Exc 480/20 nm;DM495;EM 510/20 2)赤色蛍光の場合:Exc 540/25 nm;DM565;Em 605/55Chroma1)#49020 2)#31002力を加えることによる粒子の変位は、赤いfluoresecnceフィルターブロックを使用して記録されます。
Table 6: 画像解析
ImageJNIH - 粒子追跡プラグイン
アンズ

参考文献

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