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方法論記事

天然のタンパク質からアミロイドの迅速な生成

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DOI:

10.3791/50869

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2013年12月5日

 ,  , 
1Department of Immunology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

この記事について

サマリー

タンパク質は、天然構造を採用するか、不溶性アミロイドに誤って折り畳まれる可能性があります。ミスフォールディング経路に有利な条件は、さまざまな種類のアミロイド線維の形成につながります。ここで説明する方法は、in vitroで天然タンパク質をアミロイドに迅速に変換することを可能にします。

要約

タンパク質は、それらの特異的な三次元フォールドの誘発機能を発揮することによって生物で重要なタスクを実行する。ポリペプチドの天然の構造は、多くの目的を果たすが、それは現在ほとんどのタンパク質は、β-シートリッチアミロイドの代替的なアセンブリを採用することができることが認識される。不溶性のアミロイド線維は、最初は複数のヒトの病気と関連しているが、それらは、ますます様々な重要な細胞プロセスに関与する官能選手として表示されます。加えて、患者の組織において沈着したアミロイドは、そのような核酸およびグリコサミノグリカン（GAG）のような非タンパク質性成分を含む。これらの補因子は、不溶性沈殿物の異なるタイプの生成をもたらす、アミロイドの形成を容易にすることができる。タンパク質は、可溶性アミロイド前駆体の中間段階を介して誤って折り畳ま方法我々の理解を活用することにより、我々は、in vitroでアミロイド原繊維への天然タンパク質に変換する方法を考案した

概要

タンパク質は、あらゆる種類の細胞に存在する最も豊富な生体高分子です。それらは、非常に多様なサイズ、構造、および翻訳後修飾で発生し、天然の形態では膨大な範囲の重要な生物学的機能を果たします。20種類以上の異常なポリペプチドが、アルツハイマー病、パーキンソン病、2型糖尿病1-4など、多数のヒトの病理学的状態に関与しています。末端のミスフォールドタンパク質は、細胞外または細胞内で発生する不溶性の安定凝集体であるアミロイド線維として蓄積します。

特定の疾患における特定のタンパク質の意味にもかかわらず、すべてのポリペプチドがアミロイド形質転換を可能にする固有の特性を持っているという考えを支持する証拠が増えています。ゲノムワイドな配列調査により、アミロイドになりやすいフラグメントが大腸菌からヒトまでのすべてのコードペプチドセグメントの約15%を占める「アミローム」が特定されました5。したがって、近年、さまざまな重要な細胞プロセスに関与する機能性アミロイドの数がますます発見されています。例えば、細菌はアミロイドを組み立ててバイオフィルムや胞子構造を形成し、これらはその生存と病因に重要な6-9。ペプチドホルモンは、放出される前に哺乳類の分泌顆粒内に貯蔵中にアミロイド沈着物を形成し、さらに、タンパク質アミロイド型が有益な生物学的機能を果たすことができることを示唆しています6,10,11。さらに、タンパク質はアミロイド線維に集合して、重要な細胞シグナルを中継することもできる12,13。

長年にわたり、最も研究されているアミロイドは、アミロイドベータやプリオンペプチドなど、ヒトの疾患に関連する個々のペプチドから調製されています。これらのペプチドは通常、明確に定義された構造を欠いており、時間の経過とともに溶液中で自発的にアミロイドを形成しますが、これは不溶性アミロイドの前駆体として機能する部分的に誤って折り畳まれた中間体によって媒介されるプロセスです。アミロイドの前駆体は可溶性タンパク質オリゴマーとも呼ばれ、天然ペプチドから生成されるとまれで不安定です14,15。しかし、先に述べたように、原理的にはほとんどすべてのタンパク質が適切な条件下でアミロイドコンフォメーションを採用することができます。私たちは最近、さまざまな補因子の存在下で容易にアミロイドを形成する天然タンパク質の安定化可溶性オリゴマーを調製する方法を確立しました16。結果として生じるアミロイド線維は、末端タンパク質のミスフォールディング凝集体17,18の複雑な性質を反映している。ここでは、補因子を含まないタンパク質原線維を指すためにタンパク質のみのアミロイドという用語を使用し、非タンパク質成分を含む原線維を指すハイブリッドアミロイドを使用します。

これまで、高温、疎水性環境、pH変化19-23など、タンパク質のミスフォールディングに有利な条件を適用することにより、in vitroでアミロイドを生成するためのさまざまな方法が開発されてきました。ただし、それらは、低効率、可逆的な折り畳み、大きなバッチ変動、低速動力学など、さまざまな問題に関連しています。ここで説明するアプローチは、再現性があり、スケールアップが容易で、アミロイド変換のタイミングと条件を正確に制御することができます。

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プロトコル

1. MESバッファの準備

  1. MESバッファー(0.1 M 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸および0.9 M NaCl)を使用して、タンパク質のみのアミロイドと安定化した可溶性タンパク質オリゴマーの両方を調製します。1.95 gのMESと5.27 gのNaClを量ります。H2Oを添加し、pHを4.7に調整します。最終容量を100mlにします。4°Cで最大6か月間保管してください。

2. 天然タンパク質から直接タンパク質のみのアミロイドを調製する

  1. 選択したタンパク質(任意の天然タンパク質またはペプチド)を秤量し、MESバッファー中で10 mg/mLに再構成します。
  2. 65°Cの水浴中で4時間インキュベートします。期間の終わりまでに、溶液中に白い沈殿物が見えます。
  3. 10%(v/v)のTris-HCl(1 M、pH 10.5)でサンプルを中和します。
  4. 透析カセットでタンパク質を一晩透析し、目的のバッファーに交換してさらに分析します。
  5. 天然タンパク質のコントロールサンプルは、ステップ2.1、2.3、および2.4に従って、熱沈殿なしで調製できます(ステップ2.2)。

3. 天然タンパク質の安定化可溶性オリゴマーからハイブリッドアミロイドを調製する

  1. 安定化可溶性タンパク質オリゴマーの調製
    1. 選択したタンパク質を秤量し、MESバッファー中で10 mg/mLに再構成します。室温で15分間放置します。
    2. 1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)を秤量し、MESバッファーに20 mg/mlのフレッシュストックを調製します。
    3. タンパク質とEDC溶液を2:5(v/v)の比率で、つまりEDC10 mgごとに2 mgのタンパク質で混合します。
    4. 室温で2時間インキュベートします。
    5. 10%(v/v)のTris-HCl(1 M、pH 10.5)でサンプルを中和します。
    6. 透析カセットでタンパク質を一晩透析し、目的のバッファーに交換してさらに分析します。
    7. 安定化した可溶性タンパク質オリゴマーは、4°Cで最大4週間保存してください。
  2. 安定化された可溶性タンパク質オリゴマーからハイブリッドアミロイドを調製します。
    1. DNA含有アミロイドを調製するには、DNAと安定化可溶性タンパク質オリゴマーを1:1の比率(w / w)で混合します。4°Cで少なくとも2時間放置します。この期間中、初期タンパク質濃度が0.5 mg / ml以上の場合、溶液中に不溶性沈殿物が見られます。
    2. RNA含有アミロイドを調製するには、RNAと安定化可溶性タンパク質オリゴマーを1:1の比率(w / w)で混合します。4°Cで少なくとも2時間放置します。この期間中、初期タンパク質濃度が0.5 mg / ml以上の場合、溶液中に不溶性沈殿物が見られます。
    3. ヘパリン含有アミロイドを調製するには、ヘパリンと安定化可溶性タンパク質オリゴマーを1:1の比率(w/w)で混合します。4°Cで少なくとも2時間放置します。この期間中、初期タンパク質濃度が0.5 mg / ml以上の場合、溶液中に不溶性沈殿物が見られます。

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結果

天然タンパク質を直接アミロイドに変換できる能力は、MESバッファー中の高温状態で引き起こされる構造変化に依存しています。溶液中の沈殿は、タンパク質の凝集およびアミロイド形成が起こったことを示す良好な指標となります。一方、可溶性タンパク質オリゴマーを安定化させるために、EDCを用いてタンパク質を架橋し、MESバッファーで誘導されたオリゴマー構造を固定します。その結果、安定化されたタンパク質オリゴマーはマルチマータンパク質となり（図1）、SDS-PAGEで分離した際に、単量体の天然タンパク質や熱誘導凝集体とは明確に区別されます。

安定化された可溶性タンパク質オリゴマーは溶液中で安定しているため、共因子によるアミロイドへの変換を、バッファー条件、タンパク質と共因子の相対比、その他のパラメータを制御しながら、都合の良い方法で別途行うことができます。オリゴマーからアミロイドへの変換プロセスは急速に進行するため、核酸やGAGと混合してから数分以内に不溶性沈殿が形成されても驚く必要はありません。安定化された可溶性タンパク質オリゴマーの品質を確認するために、いくつ...

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ディスカッション

ここで説明する方法は、選択したほぼすべてのタンパク質またはペプチドから in vitroで アミロイドフィブリルを調製するための迅速かつ柔軟な手段を提供します。タンパク質のみのフィブリル、またはDNA、RNA、またはグリコサミノグリカンを含むハイブリッド凝集体など、いくつかの異なるタイプのアミロイドを確実に調製できます。手順はシンプルで簡単で、高度な技術トレーニングは必要ありません。この方法で調製されたアミロイドは非常に安定しており、4°Cで安全に保存することも、-80°Cで長期間凍結することもできます。

アミロイドおよびアミロイド前駆体の生成を確実に成功させるための最も重要な要素の1つは、MESバッファーの適切な酸性度です。私たちの経験では、pH範囲が3〜5.5のMESバッファーは、アミロイドおよびアミロイド前駆体の成功と再現性のある調製を提供します。pH 6.5では、アミロイド前駆体を生成する効率が大幅に低下します。これは、他の以前の報告の結果と一致しています-トリフルオロエタノールを含むpH 5.5の酢酸緩衝液を使用して、ウシホスファチジル-イノシトール-3...

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開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所助成金AI074809およびテキサス大学MDアンダーソンがんセンターの機関研究助成金プログラムからW.C.への助成金によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸 (MES)Sigma-AldrichM8250
NaClFisherBP358-10
1-エチル-3-[3-ジメチル-アミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩 (EDC)Thermo/Pierce22980
サケ精子由来DNASigmaD1626
トルラ酵母由来RNASigmaR6625
豚腸粘膜からのヘパリンSigmaH3149
トリスベースフィッシャーBP152-1
機器:
ウォーターバスフィッシャーサイエンスIsotemp 210
スライド・A・ライザー透析カセットサーモ/ピアス66380

参考文献

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