NF-κB依存性神経新生の調節および分析のための方法

サマリー

NF-κB依存性の成人の海馬の神経新生の操作および分析するための方法が説明されています。詳細なプロトコルは、マウスでの認知転帰の調査のための歯状回依存行動試験（空間パターン分離バーンズ迷路と呼ばれる）のために提示されている。この技術は、他の実験設定での調査を可能に役立ちます。

要約

海馬はエピソード記憶の形成及び連結の範囲に極めて重要な役割を果たしており、空間的な向きで。歴史的には、成人の海馬は、哺乳類の脳の非常に静的な解剖学的領域として見てきた。しかし、最近の調査結果は、海馬の歯状回は、既存の神経回路の修正だけでなく、大人の神経新生のみならずを含む、成人では驚異的な可塑性の領域であることを実証した。この可塑性は、転写因子NF-κBの顕著な役割を果たしている、複雑な転写ネットワークによって調節される。大人の神経新生を研究し、操作するには、NF-κB活性の前脳特異的なニューロン抑制のためのトランスジェニックマウスモデルを使用することができます。

本研究では、これらの方法は、whic、その構造的側面を含む、NF-κB依存性の神経発生、神経細胞アポトーシスおよび前駆細胞増殖、および認知的意義の解析のために説明されているHは、特に歯状回（DG）依存性行動試験、空間パターン分離バーンズ迷路（SPS-BM）を経由して評価した。 SPS-BMプロトコルは単に成人海馬神経新生上の特定の遺伝子の影響を評価するために設計された他のトランスジェニック動物モデルでの使用に適合させることができる。さらに、SPS-BMは、薬理学的薬剤を用いて、例えば、DG-依存性の学習を調査し、操作することを目的とした他の実験設定において使用することができる。

概要

存在論的に、海馬は既知の最古の解剖学的な脳構造の1つである。このような長期記憶、空間的な向き、及びそれぞれのメモリの形成及び連結の調節において中心的な機能などの多様な複雑なタスクを担当する。解剖学的に、海馬はその下帯内の顆粒細胞といくつかの神経細胞の前駆細胞が含まれているアンモン角（CA1、CA2、CA3、およびCA4）領域と歯状回（ 歯状回 ）、などの錐体細胞層（ 角質錐体 ）で構成されています。顆粒細胞は、いわゆる苔状繊維（顆粒細胞の軸索）を介して、CA3領域に向かって突出する。

前世紀の終わりまで、大人の哺乳類の脳は、細胞の可塑性と神経新生を欠い静的臓器であると考えられていた。しかし、最後の二十年の間に、証拠の成長量が明確に行われている成人の神経発生を実証する、少なくとも2脳領域、脳室下帯（SVZ）および海馬の下帯。

我々の以前の研究で、他のグループのものは、転写因子NF-κBは、成人の神経発生の重要な分子調節因子の一つであり、深刻な構造的な海馬欠陥や認知障害^1-6年の規制緩和の結果ということが示されている。 NF-κBは5 DNA結合サブユニットの異なる二量体の組み合わせで構成される誘導性転写因子の総称です。P50、P52、C-REL、RELB、およびp65（RelAの）、後者の3つはトランス活性化ドメインを持っている。脳内では、細胞質に見られる最も豊富な形態は、カッパB（IκB）タンパク質の阻害剤によって不活性型で保持されているp50およびp65のヘテロ二量です。

NF-κB駆動型の神経発生を研究し、直接操作するために、我々は、NF-κB活性subunのすべての単純な抑制を可能にするトランスジェニックマウスモデルを使用その、前脳特異^7（ 図1参照）。この目的のために、我々は次のトランスジェニックマウス系統交雑、IκB/ - と-/tTA。トランスジェニックIκB/ -ラインは、NF-κB阻害剤IκBa（スーパーリプレッサーIκBa-AA1）のトランスドミナントネガティブ変異体を使用して生成された^8。野生型IκBαとは対照的に、IκBα-AA1は、阻害剤のリン酸化およびそれに続くプロテアソーム分解を妨げるアラニン（V32及びV36）に変異2つのセリン残基を有する。 IκBa-AA1-ジーンの前脳ニューロン特異的発現のためには、IκB/ - マウスは、マウスは、カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼを保有するとのクロス交配したIIαテトラサイクリントランス活性化因子（TTA）で駆動することができる（CAMKIIα） - プロモーター^9。

P65ノックアウトマウスは、大量の肝アポトーシス¹⁰に、胚致死表現型を持っているので、ここに示されているアプローチは、エレガントな方法を提供し、出生後および成体の神経発生におけるNF-κBの役割を調査するため。

空間学習と記憶を研究するための古典的な行動試験はリチャード·モリス、モリス水迷路^（MWM）11として知られている試験で、1980に記載された。このオープンフィールド水迷路では、動物は向きや余分な迷路の手がかりをもとに、隠されたプラットフォーム上に不透明な水から脱出することを学ぶ。 MWMの乾燥変種は、いわゆるバーンズ迷路^（BM）12である。このテストでは、1エスケープボックスとして定義されている穴、および方向のための視覚的な余分な迷路の手がかりと、プレートの境界に配置された20円形の穴が円形プレートを利用しています。両方の実験パラダイムは、げっ歯類の `sの水への嫌悪感、またはオープン、明るく照らさスペースによって誘導された飛行挙動に依存しています。両方のテストは、空間的方向の調査、および関連のメモリの性能を可能にします。海馬は、空間的記憶形成における一般的な必要不可欠な役割を果たしているが、海馬rを関与egionsが適用テストによって異なります。 BMでテストメモリはenthorinal皮質（EC）と、DG ^13〜16の寄与なしに、海馬のCA1領域に位置する錐体ニューロン間の神経活動から生じる。具体的には、古典的なBMが主に重要なのは、DGが決定的の処理だけでなく、意味、いわゆる空間的パターン認識^17、に関与しているEC IIIからのCA1に、EC Vの単シナプス側頭アンモニアの経路を介してナビゲーションに依存しています視覚と空間情報だけでなく、非類似、重複しない表現に類似した表現やメモリの転換。このタスクは、BM ¹⁵でテストすることができない機能的なトライシナプスのEC IIからのDGにCA3とCA1に回路とECのVIを、必要とします。

これらの課題に対処するために、我々は、特に共同での歯状回依存認知能力をテストするための行動試験として、SPS-BMを考案したntrol動物、およびNF-κB活性阻害後、IκB/ tTAは、スーパーリプレッサーモデルで。重要なのは、MWMまたはBMとは対照的に、SPS-BMが神経発生の障害に起因する微妙な行動障害を明らかにすることができます。空間パターン分離がEC IIおよびDGおよびCA3とCA1とEC VI間の機能回路に厳密に依存するので、このテストでは、内の潜在的な神経新生の変化、苔状線維経路の変更や組織の恒常性の変化がに非常に敏感であるDG。

技術的には、我々のテストのセットアップはクレランドらの研究に基づいています。、空間的な分離パターンが木造8アーム放射状迷路^{（RAM）19を}使用して試験された。私たちの修正されたセットアップでは、8本のアームは7同一の黄色の食品の家に置き換えられました。要約すると、これらの方法は、ダブルコルチンを発現する海馬内（DCX +）細胞、苔状線維投射、神経細胞ドの分析を含め、ここに示されている第a、特にSPS-BMは、ここに提示、成体神経新生に影響を与える遺伝子を組み込んだ他のマウスモデルの研究に適用することができる。さらにアプリケーションは、薬理学的物質の研究とDGと空間パターン分離への影響を測定するを含むことができる。

プロトコル

倫理声明

この研究は、政府の動物ケア使用委員会、国家ノルトライン=ヴェストファーレン州（デュッセルドルフ、ドイツ）のLANUVの規定に厳密に従って行った。すべての動物実験は、ライセンス番号8.87-51.04.20.09.317（LANUV、NRW）の下でLANUV、デュッセルドルフによって承認された。すべての努力は、苦痛および研究に必要な動物の数を最小限にするために行われた。

1。動物実験住宅

1. フェデレーション欧州実験動物学会（FELASA）によって定義されるように本明細書に記載されたプロトコルで使用されるすべての動物は、特定病原体フリー条件下で維持されるべきである。
2. HEPA空気を濾過したマウスは、昼行性の条件（12時間の明/暗サイクル）の下で、温度と湿度が管理（22℃）の部屋で、標準のケージに維持されるべきである。
3. 標準化された食品や水は自由に与えなければならない。
4. IκB/ tTAをし、IκB/ IF -対照マウスが使用されている^7、18で説明したように、PCRベースの遺伝子型判定は、各動物のために行われるべきである。
5. より小さい四日間の年齢差を有する雄の動物は、個々の変動性を減少させるために使用されるべきである。
6. （オプション）：NF-κBの活性化​​実験のために、ドキシサイクリンは、少なくとも14日間（2.5％スクロースとの2 mg / ml）を飲料水に投与しなければならない。

2。空間パターン分離バーンズ迷路（SPS-BM）

1. すべての行動試験は、国際的、地域ガイドラインに従って行われるべきである。
2. 重要！ 6カ月以上の年齢によってのみ雄マウスを使用してください。 1試験シリーズの動物の間の年齢差が4日以上でなければなりません。テストでは、各シリーズの同じオペレータが行う必要があります。マウスは、さらに部分的になどによって駆動モチベーションを高めるために、試験前に標準的な食事を受けるべきであるウィート食品の報酬。
3. 硬質プラスチックから作られた白い円板を設定し、少なくとも4×80 Wおよび3×215 Wネオン蛍光灯で照明された湿度および温度制御された部屋（22℃）、中（直径120センチメートルは、 図5Aを参照してください） 。重要！マウスのモチベーションを部分的に明るく、当たる場所への嫌悪によって駆動され、食品の家に入るよう、正しい照明が使用されていることを確認してください。
4. ビデオ·トラッキング·システムを設定します。カメラは、115センチメートル板の中心（ 図5A参照 ）の上方に配置されるべきである。
5. 動物のための見やすい位置にある白色の布、プレートの国境から約100センチメートル（ 図5Aを参照）にマルチカラーの余分な迷路の手がかり（EMC）を取り付けます。
6. 慎重に実験の設定から任意の臭いを除去することができ、急速消毒剤でプレートを清掃してください。
7. 7同一の黄色い食糧家を配置（12センチ×7センチメートル×8センチ、 図5（a）参照 ）。位置は（ 図5Aを参照）明確にマークする必要があります。
8. 一つだけ定義されている食品の家は動物に自由にアクセス可能で（ 図5Aを参照）に定義された位置でのすべての食品の家の中に甘い食べ物ペレットの報酬（Kellogs `sのフルート教授のループ/食品住宅の4分の1）を配置（位置F、 図5（a）参照 ）。透明ホイルで非対象食品の家を閉じます。
9. 試験の前に、（作業を開始する前に1日）馴化を行ってください。すべての食品の家が自由にアクセスできるようにし、マウスは自由に迷路を探索する、食品ペレットの報酬（10分/動物）を取得することができます。
10. 上のコンピュータとカメラを切り替えて、ビデオ·トラッキング·システム·ソフトウェアを起動します。
11. 録音を開始します。
12. 円板上の定義された開始点（ 図5（a）、S：スタート位置）で動物を置き、マウスは10分間、対象食品のペンションを検索できます。
13. STOPビデオ追跡。
14. 重要！迅速な消毒剤で、各試行の後に円板や食品の家をきれいにしてください。
15. （各動物用）7日間連続して毎日テストを繰り返します。
16. 適切な統計ソフトウェアを使用して結果（レイテンシ、距離覆われており、エラー）を分析します。間違った食糧の家および/または入ると食品ペレットの報酬を取得せずに、適切なボックスに接触に近づくようにエラーを定義します。グループ化された分析のためのボンフェローニ事後検定を二元配置分散分析を使用しています。
17. （オプション）マウスを屠殺し、後述のように海馬を分析。

3。 BrdU標識

1. 3日間（分化と統合の分析​​）、または単回注射用200 mg / kgのIP（増殖の分析）のために腹腔内に50 mg / kgの腹腔内にBrdU一日一回注射する。
2. 動物を犠牲に、海馬を解剖し、以下に説明するように40μmの切片を作製。
3. 変性さ10分間、2 M HClでセクションと、10分間、0.1 Mホウ酸緩衝液中でインキュベートする。
4. BrdUのに対して向けられた抗体を用いて以下に説明するように、免疫組織化学的に各動物から40μmの切片（離れて240ミクロ​​ン）の1·イン·12シリーズにラベルを付けます。
5. 顆粒細胞層と下帯の体軸方向の程度を通して、共焦点顕微鏡分析によって標識された細胞を定量化する。 DGあたりの標識細胞の合計数を取得するために2によって海馬および除算ごとのBrdU標識細胞の推定総数を取得するために12で生じた数値を掛けます。

4。かん流されない動物の脳や凍結切片の調製の除去

1. 動物を安楽死させるためのローカルで承認された手順に従ってください。マウスは、直接頸椎脱臼により安楽死させてもよい。
2. （オプション）動物は、腹腔内麟蹄するなど 、地元および国際的なガイドラインに従って安楽死の前に麻酔をすることができます（新たに生理食塩水または生理緩衝の1.85ミリリットルと2.2 mgの2,2,2 - トリブロモイソアミルエタノール1ミリリットル中で作られた150ミリリットルの原液を混合した）33グラムのマウス用の0.8ミリリットルアベルチンのction。
3. ベタジンその後70％エタノールに浸したガーゼで（10％ポビドンヨード）に浸したガーゼや綿棒でヘッドを殺菌。
4. 適切な外科はさみを用いて動物を首、脇の皮膚を引っ張る。
5. （オプション）固定器は、バック遅滞皮膚の折り畳みを避けるために適用することができます。
6. 頭蓋骨に正中切開を行い、慎重に脇頭蓋骨の断片を引っ張る。
7. 慎重に適切な外科手術用器具（ 例えばモリアスプーン）を使用して脳全体を削除します。
8. ドライアイス上で-30〜-40℃〜50ミリリットルのビーカー（ 例えばショットデュラン）中の2 -メチルブタンの予冷25ミリリットル。
   注：理想的に共焦点レーザー走査顕微鏡に適して「厚い」のセクションのフリーフローティング染色のために、脳を取り外し、3を洗う脳が（通常は一晩）下まで沈んするまで、リン酸、4℃でバッファとストア内の時間は、50ミリリットルチューブに30％ショ糖溶液をバッファリング。
9. 慎重にNescofilm（パラ）の一部に脳を置き、TissueTek OCT化合物の十分な量でカバーし、使用するまで-80℃で2 - メチルブタン、店舗でNescofilmに凍結する。
   注：22.9％スクロース、7のMgCl _2、50 mMリン酸緩衝液、44％グリセロール中で-20℃店で長期保存してください。
10. 適切なクライオ上の10から12ミクロン厚の切片に脳をカット。
    注：厚い、フリーフローティングのセクションでは、（ 例えばライヘルトユング、Frigomobil。）と-20℃で40μmの水平部分をカットし、適切なクライオトームのクライオトームステージに脳を凍結- 25℃、細かいブラシでナイフからのセクションを収集し、バッファに収集したり、長期保存のために-20℃でストレージ·ソリューション（ステップ4.9）で保管してください。
11. 慎重に、単一の顕微鏡スライド上で2のスライスをマウントします。私達スーパーフロストUltraPlusスライドのEは、高度のセクションの接着性を最大化することをお勧めします。
12. 室温で5分間、スライドを乾燥させる。スライドは、使用するまで-80℃で保存することができる。

5。灌流動物からの切片の調製

1. （ステップ4.2）、上記のような動物を麻酔。
2. 10〜15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド、続いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）2-4分間ヘパリン（0.025溶け溶液PBS）およびプロカイン（0.5g/100mlにPBS）を含む、で経動物を注意深くを潅流。灌流を最適約1.2〜1.4メートルまたは約15 ml /分に設定した蠕動ポンプを利用する静水圧を用いて左心室と右心房の開口部を介して灌流することにより行われる。赤い血管が見えないように構成されている淡い白、脳内の最適な灌流の結果。
3. 解剖と24時間4℃で4％パラホルムアルデヒド中の脳をポスト修正。
4. クライオ少なくとも24時間、4℃でPBS中30％スクロース中に脳を保護します。
5. クライオトームステージ上で脳を凍結する。
6. 適切なクライオトームを使用して、全前脳から40μmの横切片を作製。
7. スライドは-20℃で使用するまで凍結保護物質溶液（0.1 Mリン酸緩衝液、50％グリセロール、0.14％の_塩化マグネシウム、8.6％スクロース）に格納することができる。

6。かん流されない動物の脳切片の免疫組織化学

1. 10分間、-20℃の冷メタノールを用いて、上記のように調製した凍結切片を後固定する。
2. 4℃で一晩（二次抗体を上昇させるために使用した種から）、0.3％トリトン-Xを含む5％正常血清でブロックし
3. 1X PBSで3回洗浄し、4℃で一晩一次抗体でインキュベート
4. 1×PBSで3回すすぎ、室温で1時間二次抗体とともにインキュベートする。
5. 1X PBSで3回すすぎ
6. カップSYTOXグリーン、またはDAPI（または代替DNA色素）を用いてDNAの項nterstain。
7. 1X PBSで3回すすぎ
8. 水埋媒体中でのセクションを埋め込む。
9. 包埋剤は、少なくとも48時間重合してみましょう。

7。灌流動物の脳切片の免疫組織化学

1. ステップ6.2に記載し、続いて4℃で一晩、0.3％トリトン-X（浮遊）を含有するPBSで希釈した一次抗体溶液中で固定した脳切片をインキュベートするように、ブロック
2. 1×PBSで3回すすぎ、3時間室温で0.3％トリトン-X（フリーフローティング）を含有するPBS中に希釈した二次抗体溶液中でインキュベートする。
3. 1X PBSで3回すすぎ
4. 緑またはDAPI SYTOX（または代替DNA色素）を用いてDNAのセクションを対比染色。
5. 1×PBSで3回すすぎ
6. 水埋媒体中でのセクションを埋め込む。
7. 包埋剤が探し重合してみましょうT少なくとも48時間。

8。苔状線維投影の調査

1. 、動物を犠牲に上記のように40μmの冠状切片を作製し、神経フィラメントMのための抗体を用いて、海馬部分を染色
2. 苔状線維および核を可視化するために、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて適切な波長でのセクションをスキャンしてください。低倍率でスキャンを開始します。
3. オリエンテーションのための低倍率の画像を使用し、苔状線維突起海馬を対象としています。
4. 高解像度、高倍率でのセクション（Z-切片）をスキャンします。
5. NF-Mの染色を通して可視化苔状線維の形態学的な外観と接続性を分析します。
6. （オプション）海馬のブレードのサイズとボリュームを分析します。測定のためのDNAの信号を使用してください。

9。フルオロジェイドCアッセイ（神経細胞死）

1. 動物を犠牲に、海馬を解剖ampus、そして前述のように12μmの切片を作製。
2. 切片を室温で30分間乾燥させます。
3. 室温で40分間、4％PFA中のセクションを修正します。
4. 簡単に言うのセクションでは、蒸留H ₂ Oで3回洗浄
5. 連続、穏やかに振盪下に10分間0.06％の過マンガン酸カリウム（KMnO _4）を持つセクションをインキュベートします。
6. のセクションでは、蒸留H ₂ Oで3回洗う
7. 室温で20分間、0.002％フルオロ - ジェイドC溶液で切片をインキュベートする。
8. （オプション）の同時核染色のために、0.002％フルオロジェイドC溶液10μg/ mlのDAPIで補うことができる。
9. 簡単に言うのセクションでは、蒸留H ₂ Oで3回洗浄
10. 切片を室温で30分間乾燥させます。
11. キシレンで切片をインキュベートし（1分）
12. キシレン系封入剤（DPX）を使用してセクションをマウントします。

結果

IκB/の異種交配-とのtTAトランスジェニックマウス系統は、海馬におけるNF-κB活性の条件付抑制につながる。

二重トランスジェニックマウス（ 図1A）におけるIκBα-AA1-導入遺伝子の発現を調べるために、脳を単離し、凍結切片およびGFP（緑色蛍光タンパク質）に対する抗体を用いて染色した。共焦点レーザー走査顕微鏡はCA1及びCA3領域において、及びDG（ 図1B）における導入遺伝子の高い発現を明らかにした。

IκBα-AA1-導入遺伝子は、タイプ-2B前駆細胞に発現しており、中間の未熟の状態で、成熟顆粒細胞中でアクティブになっているされている。
海馬神経形成領域でCAMKIIα駆動型IκBα-AA1を表現する最も初期の細胞の種類を確認するには、IκB/ tTAを動物からの海馬の凍結切片をダブルコルチンについて染色した（DCX）および導入遺伝子（GFP）。共焦点解析はCAMKI...

ディスカッション

ドキシサイクリンを経由して、成人の神経発生、および神経細胞におけるNF-κBの阻害を介して、その操作の可能性、およびそれ以降の再活性化、成人の脳内だけでなく、神経細胞の脱·再世代に新生ニューロンの調査のための魅力的なシステムを提供しています。このシステムの美しさはある神経細胞死、前駆細胞の増殖や遊走、および重度の構造的および解剖学的変化だけでなく、明らかな学習欠陥の変化のニューロンの結果だけでなく、中のNF-κBシグナル伝達経路阻害。重要なのは、IκB/ tTAを動物の表現型は、実験的にドキシサイクリンを投与した後に反転して救出することができます。この表現型の復帰が構造的側面 ​​を含み、また^DG-2依存性の学習の有意な改善をもたらすことができる。

行動実験のための解釈可能な結果を​​確保するためには、重要であること、年齢のdiffereでのみ雄動物未満4日のNCEを使用すること。さらに、すべての試験シリーズは、同一のオペレータによって行われるべきである。試験室に関しては、我々は強く、ストレスと外部のノイズ源から生じる注意の損失を避けるために音響的に絶縁された...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
モリア MC17 パンチングスプーン	FST	10370-18	脳の除去解
剖顕微鏡	Zeiss	Stemi SV8	脳の除去
手術用ハサミ	FST	14084-08	脳の除去外科
用ハサミ	FST	14381-43	脳の除去
デュモン #5 鉗子	FST	11254-20	脳の除去
SuperFrost スライド	カール・ロス	1879	免疫組織化学用スライド
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6148	固定剤
TissueTek OCT 化合物	Sakura Finetek	脳	の埋め込み1004200018
正常なヤギ	血清 Jackson Immunolabs	005-000-001	IHCのブロッキング
正常なウサギ	Jackson Immunolabs	011-000-001
IHCのブロッキング 正常なロバ	Jackson Immunolabs	017-000-001	IHC
抗ニューロフィラメント-M抗体	のブロッキング Developmental Studies ハイブリドーマバンク	2H3	IHC、希釈 1:200
反ダブルコーチン 抗体	sc-8066	Santa Cruz	IHC, 希釈率 1:800
抗GFP抗体	アブカム	ab290	IHC, 希釈率 1:2,000
抗BrdU抗体	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, 希釈率 1:2,000
フルオロジェイドC	FJ-C	HistoChem	ニューロン細胞死の測定
ベタジン	・ムンディファーマ	D08AG02	消毒剤
クライオミクロトーム	ライカ	CM1900	脳スライスの調製
ヘパリンナトリウム塩	シグマ・アルドリッチ	H3393	灌流
硬質プラスチック(直径120cm)から作られた円形プレート	ラボ製		SPS-BM用プレートなし、直径120cm
ブラトン迅速消毒剤	Schülke Mayr	113 911	剤
ソフトウェアパッケージVideoMot2付きTSE VideoMot 2	TSEシステム	302050-SW-KITSPS-BM
Triton X-100の追跡と分析	シグマアルドリッチ	T8787	透過化/ IHC
クライ	オートームライヒェントユング/ライカ	フリゴモービル12064	の40µの準備;m brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	核染色
食品ペレット (Kellog's Froot Loops)	Kellog's		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		SPS-BM
Zen 2008 または Zen 2011 ソフトウェアの	Carl Zeiss		Software(共焦点顕微鏡)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	Fluoro-Jade C染色用封入剤