ハイフィールドのfMRIを使って大人の猫における聴覚皮質の機能イメージング

サマリー

哺乳動物における聴覚系の機能的研究は、伝統的に、このような電気生理学的記録のような空間的に焦点を当てた技術を用いて行われている。以下のプロトコルは、機能的磁気共鳴画像法を用いてネコ聴覚皮質における誘発血行力​​学的活性の大規模パターンを可視化する方法が記載されている。

要約

哺乳類の聴覚系における感覚処理の現在の知識は主にサル、フェレット、コウモリ、げっ歯類、およびネコを含む種々の動物モデルでの電気生理学的研究から派生しています。聴覚機能のヒトおよび動物モデルの間の適切な類似点を描画するためには、人間の機能イメージング研究および動物電気生理学的研究の間のブリッジを確立することが重要である。機能的磁気共鳴画像法（fMRI）は、大脳皮質の異なる領域にわたって血行力学活性の広いパターンを測定する確立された、低侵襲的方法である。この技術は、広く、人間の脳における感覚機能をプローブするために使用され、ヒトおよび動物の両方における聴覚処理の研究を連結するのに有用なツールであり、正常サルおよびげっ歯類における聴覚機能を調査するために使用されている。次のプロトコルは、麻酔、成人で聴覚機能を調査するための実験手順について説明しますfMRIのを使って聴覚野の刺激誘発血行動態の変化を測定することにより、猫。この方法は、このように、哺乳類の聴覚皮質の種に依存しない機能のより良い理解につながる聴覚機能の異なるモデル間で血行動態の応答の比較を容易にします。

概要

哺乳類における聴覚処理の現在の理解は主にサル^1-5、フェレット^{6月10日、11月14日}コウモリ、げっ歯類^15〜19、および^20〜24猫に侵襲的な電気生理学的研究から派生しています。電気生理学的技術は、一般に、電極先端の周囲の神経組織の小領域内の単一および複数のニューロンの活動を記録するために、細胞外微小電極を利用する。このような光イメージングや機能的磁気共鳴画像法（fMRI）などの機能的画像検査法を確立し、脳の複数の空間的に別個の領域を越え、同時主導型取引の巨視的な視点を提供することにより、細胞外記録するための有用な補完を提供しています。内因性シグナル光学イメージングは​​fMRIのは、血液酸素レベル依存（BOLD）を利用しながら、表面組織の反射特性の活動に関連した変化を測定することにより、脳内の誘発活動の可視化を容易に特定のタスクの実行中にアクティブになっている脳領域における刺激誘発血行動態の変化を測定するとは対照的。光学イメージングは、刺激誘発作用²⁵に関連している表面組織の反射率の変化を測定するに皮質表面の直接の露出を必要とします。比較では、fMRIのは、非侵襲的であり、完全な頭蓋骨内皮質表面^26〜28と溝ベース^27,29誘発活性の両方を測定するために、脱酸素化血液の常磁性特性を利用している。ヒト以外の霊長類の視覚野³⁰において、人間の聴覚皮質³¹の太字の信号と神経活動の間に強い相関が感覚機能を研究するための有用なツールとしてのfMRIを検証します。 fMRIのは、そのようなtonotopic組織^32〜36、聴覚機能³⁷の定位、皮質活性化のパターンは、皮質領域³⁸の識別、音の効果のような聴覚路の機能を研究するために広く使用されているので聴覚応答特性^39,40、およびヒト、サルおよびラットモデルにおけるBOLD応答時間コース^29,41の特性上の強度、ネコにおける聴覚機能を研究するための適切な官能撮影プロトコルの開発に有用であるが、補体を提供する機能イメージング文学。 fMRIのも、麻酔ネコ^26-28,42における視覚皮質の様々な機能的側面 ​​を探求するために使用されてきたが、いくつかの研究では、猫の聴覚皮質に感覚処理を調べるためにこのテクニックを使用している。本プロトコルの目的は、麻酔したネコの聴覚皮質における機能を定量化するためのfMRIを用いた効果的な方法を確立することである。本稿で概説した実験手順は正常成体ネコ聴覚野⁴³にBOLD応答の時間経過の特徴を記述するために使用されてきた。

プロトコル

次の手順では、ネコが使用される麻酔した任意のイメージング実験に適用することができる。特に聴覚実験（1.1から1.7、2.8、4.1ステップ）に必要な手順は他の感覚刺激プロトコルに対応するように変更することができます。

すべての実験手順はウェスタンオンタリオ大学の動物管理上の大学審議会の動物への使用小委員会からの承認を受け、動物管理カナダ評議会^（CCAC）44で指定されたガイドラインに従った。概説された実験は、回復への動物の準備から約150分を必要とします。実験の時間経過を図1に示されている。

1。刺激機器の準備

図2は、MRIスキャナ内の聴覚刺激を発生させるために必要な電子部品とそれに対応する接続を示しています。要件は、Fのとおりです。ollows：コンピュータ、外付けのサウンドカード、ステレオパワーアンプやfMRIの互換イヤホンシステム。

1. ユニバーサルシリアルバス（USB）ケーブルを介して外部のサウンドカードに聴覚刺激を提示するために使用されるコンピュータを接続します。
2. ステレオ·パワーアンプの入力ポートに外部サウンドカードの出力ポートとを接続するケーブルを接続します。
3. fMRIの互換イヤホンシステムのトランスボックスの入力ポートにステレオパワーアンプの出力ポートとを接続するケーブルを接続します。
4. 変圧器ボックスの出力ポートにバイノーラルイヤホンを接続してください。
5. スキャナ室の外の侵入パネルにトランスボックスを接続するには、BNC接続でシールド同軸ケーブルを使用してください。
6. スキャナ室の内部浸透パネル上の対応するBNCポートにイヤホンケーブルアセンブリを接続します。
7. フォームイヤーチップはその後イヤホントンを接続イヤホンに接続するケーブルアセンブリO。その音はイヤホンにコンピュータから送信されているかどうかを確認するテストの聴覚刺激を実行します。イヤホンを外し、動物の準備段階（ステップ2.7）の間に猫の耳にしっかりとフォームイヤーチップを挿入します。

2。動物の準備

1. 猫をpremedicateするには、皮下（SC）注射により鎮静硫酸アトロピンの混合物（0.02 mg / kg）を、およびアセプロマジン（0.02 mg / kgの）を管理。
2. 20分後、麻酔を誘導するために筋肉内（IM）注射を介してケタミン（4 mg / kg）をし、デクスメデトミジン塩酸塩（0.02〜0.03 mg / kgの）を管理。ケタミンは、通常、ケタミンを単独で用いた場合に⁴⁵一般的に観察さ振戦および筋肉の硬直を減少させるために、この場合、デクスメデトミジン塩酸塩、鎮静及び筋弛緩剤と組み合わされる。この麻酔薬の組み合わせは、一般的に鎮静の約150分を誘導し、頻繁に誘導するために獣医学的に使用されている小動物における麻酔。
3. 猫はその立ち直り反射を失った後は、手術中の乾燥を防ぐために、目に眼軟膏を適用します。ケタミンの静脈内送達のための内側伏在静脈に留置カテーテルを配置します。
4. 猫が足を撤回するかどうかを観察し、前足につま先をつまんで成功した麻酔導入のためのテスト。ペダル反射が消えたら、4.0〜4.5気管内チューブを挿管し、猫を咽頭壁にリドカイン噴霧することにより、咽頭反射を抑制する。
5. ケタミンの定速注入（0.6から0.75 mg / kgの/時）および1〜1.5リットル/分で100％酸素で配信吸入イソフルラン（0.4から0.5パーセント）と撮像セッションを通して麻酔を維持。シリンジポンプにシリンジを配置し、60ミリリットルの注射器に生理食塩水を60ミリリットルとケタミンの0.07ミリリットルを兼ね備えています。このステップは、猫premedicating前に行うことができる。
6. MRI適合Sの床に温かいワックスで満たされた加熱パッドを配置主導（ 図3aおよび図3c）はそりの内壁の周りに絶縁性のプラスチックプチプチを重ね。
7. MRI互換のそり（ 図3c）における絶縁プチ ​​プチ内胸骨の位置に猫を配置します。
8. 猫が配置されると、耳へのアクセスを得るために、ヘッドを調整する。深い外耳道にそれぞれの耳の先端を挿入し、可能な限り最小の直径にフォームイヤチップをロールバックします。挿入されると、フォームイヤーチップは、外耳道の中にスペースを埋めるために展開する必要があります。
9. そのヘッドが適切に3チャンネルの無線周波数（RF）コイル（ 図3b）内に配置されるまで、猫を調整します。音響減衰低反発（ 図3d）で頭を安定させる。スキャナノイズの追加の減衰を提供するために、耳の周りに泡を配置します。
10. スキャナベッドにそりを確保し、輸送し、プラスチック製のプチプチの絶縁毛布に猫をラップします。
11. 猫への輸液ライン、麻酔デリバリーチューブや監視装置を接続します。浸透パネルに取り付けイヤホンケーブルアセンブリにイヤホンを接続してください。
12. 麻酔の深さに基づいて、必要に応じて、0.6 mg / kgの/時間ベースの流速でケタミン注入を開始し、次に、流量を増加させる。解剖学的スキャンが収集された後、最初のイソフルラン投与量を0.5％に設定し、その後0.4％に減少する。
13. 監視およびスキャナボアから適切な距離に配置MRI適合性監視装置を用いた実験を通してネコの血中酸素飽和度、呼吸終期CO ₂レベル、心拍数、呼吸数および直腸温度を（可能な場合）を記録する。 表1この手順の実行が成功するための生理学的測定の値と範囲を意味する。心拍数や呼吸数の着実な増加は通常、麻酔からの差し迫った回復に関連している。
14. 秒後にessionが完了し、そりから猫を取り除く。動物が完全に回復するまで加熱パッド、タオルで補助加熱を提供し続ける。咽頭反射が戻ると、気管内チューブを取り外します。正向反射が施設に動物を戻し、その後回復するまで猫を監視します。実験からの悪影響のないことを確認するための手順の翌日動物を評価する。

3。脳撮像

1. アキシャルスライス向きで猫の脳の解剖学的スキャンを収集します。 TR = 750ミリ秒、TE = 8ミリ秒= 256×256マトリクス、X 1.0ミリメートル取得ボクセルサイズ= 281ミクロンX 281程度でフラッシュ撮影シーケンス：解剖学的基準ボリュームに対して次の撮像パラメータを使用してください。解剖学的スキャンの持続時間は約6分、図4（左パネル）指定されたパラメータを用いて得られたサンプルの解剖学的画像スライスを提供している。
2. のfunctioのため、次の撮影パラメータを使用して、NALボリューム：TR = 1,000ミリ秒、TE = 15ミリ秒、3セグメント/プレーン、21×1ミリメートルのスライスにセグメント化されたインターリーブされたエコープラナー買収（EPI）、マトリックス= 96×96;視野= 72ミリメートル×72 MM、取得ボクセルサイズ=×0.75ミリメートル×1.0ミリメートル0.75ミリメートル;取得時間= 3秒/ボリューム4（右パネル） の図は、指定されたパラメータを使用して得られた試料機能画像スライスを提供します。

4。刺激提示

1. 聴覚刺激が30秒間再生されたブロックの設計に広帯域白色雑音刺激（0-25 kHzの、5ミリ秒の立ち上がり/立ち下がり時間、1プレゼンテーションと100ミリ秒のバースト毎に200ミリ秒、90〜100デシベルSPL）を提示し、 30秒のベースライン（無刺激）状態（ 図5）と交互に。音響的に誘発BOLD活性聴覚皮質で観察されるまで、この手順を繰り返します。ブロックデザインを用いて、各機能の実行の持続時間は90ボリュームに対して約4.5分である。
2. APに刺激を提示機能実行の希望数のpropriateブロック設計構成。

5。データ解析

1. 獲得した機能的なボリュームを処理するために、適切なfMRIの解析ソフトウェア（ 例えば 、SPM、FSL）を選択します。
2. 参照解剖学的スキャンに時間的に近い取得したボリュームに、各機能のボリュームを再調整。ステップ5.6で使用するための結果の動き補正値を保存します。回転ヘッドの動きが1°または翻訳頭の動きが1ミリメートルを超えを超えている任意の機能の実行を除外します。
3. 参照解剖学的スキャンとCoregister各ボリューム。
4. 2ミリメートル半値全幅（FWHM）のガウスフィルタで各ボリュームを滑らかに。
5. 一般線形モデル（GLM）への回帰として、ON-OFFの刺激ブロックの設計に対応している方形波（ボックスカー）機能が組み込まれています。
6. 運動関連の成果物を考慮して興味のない説明変数として動き補正値を組み込む。 Uを適用BOLD活性化のクラスタを表示するには、GLMの結果にP = 0.001の統計的しきい値をncorrected。クラスタレベルでP <0.05のしきい値：訂正さ（FWE家族単位の誤差）を満たす最小のクラスタのサイズを決定します。関心領域の統計学的に有意なクラスターを表示するには、この値にクラスタのエクステントのしきい値を設定します。
7. ベースラインのブロックの間に刺激をブロックし、平均BOLD信号中の平均BOLD信号との差として、各ボクセルでBOLD％の信号変化（PSC）を定義します。

結果

代表的な機能のデータは、7T水平ボアスキャナで取得し、MATLABでの統計的パラメトリックマッピングツールボックスを用いて分析した。聴覚刺激に対してロバスト皮質血行動態応答が一貫して記述実験プロトコル^43を使用して、猫に観察されている。 図6は、ブロックの設計で提示30秒の広帯域ノイズ刺激に応答した2匹の動物に太字の活性化を示している。ベースラインに対して広帯域ノイズ（無刺激）のt統計マップは2画像のスライス面のコントラスト聴覚皮質（ 図6aおよび6dに二国間の音響的に誘発作用の連続クラスターを明らかにし、クラスタレベルFWE補正されたしきい値：P < 0.05）。それぞれ図6aおよび6dにハイライトされたボクセルの単一の機能の実行中に、BOLD信号の数値6bと6eはショーの変調を、。方形波一般線形モデルのフィット感、1は太字の信号がブロックのON-OFFのパターンと同様に聴...

ディスカッション

（I）皮質反応に対する麻酔の影響は、バックグラウンドのスキャナノイズ（II）の影響、及び（iii）の最適化：聴覚機能の麻酔をかけた動物モデルのためのfMRI実験を設計する際には、以下の問題が慎重に検討を与えられるべきである実験手順のデータ収集段階である。

麻酔された調製物は、鎮静作用の持続期間を生成し、機能イメージングセッション中に潜在的な頭部の動きを最小限にするという重要な利点を提供するが、麻酔は、皮質血行動態に影響を与えることが知られている。このプロトコルで説明麻酔薬は、一般的に猫の聴覚^46-48と視覚野^26-28,42の機能イメージング（イソフルラン）の研究をそれぞれ電気生理学（ケタミン）で使用されている。ケタミンは、最小限の皮質自発活動⁴⁹に影響^を与えることが知られているが、脳代謝、従って時間を減少させることが示されている10ミリグラムの用量でラットの聴覚皮質におけるemodynamic応答は/ ^50をキロ。しかし、この手順（4 mg / kg）の中で推奨される用...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Materials
アトロピン硫酸塩注 0.5 mg/ml	垂木 8 製品
アセプロマジン 5 mg/ml	Vetoquinol Inc.
塩酸ケタミン 100 mg/ml	Bimeda-MTC
デクスメデトミジン塩酸塩 (デキスドミトール 0.5 mg/ml)	オリオン ファーマ
イソフルラン 99.9%	アボット ラボラトリーズ
リドカイン (キシロカイン 気管内 10 mg/定量)	アストラ ゼネカ
潤滑光学軟膏 (リフレッシュ ラクリ ルーブ)	アラガン株式会社
生理食塩水0.95%
IVカテーテル22g(翼)
IVエクステンションセット	Codan US Corp.	BC 269
IV 投与セット 10点滴/ml
管内チューブ 4.0
ヒーティングパッド(寄り添い金庫)	Lenric C21 Ltd.
シリンジ 60 ml
Equipment
外部サウンドカード	ローランド株式会社	Cakewalk UA-25EX
ステレオパワーアンプ	Pyle Audio Inc.	Pyle Pro PCAU11
MRI対応インサートイヤホンシステム	センシメトリック・コーポレーション	S14
インサートイヤホン用フォームイヤーチップ	E-A-R 聴覚システム	Earlink 3B
呼気終末<>サブ2モニター	Nellcor	N-85
MRI対応パルスオキシメータ	ノニンメディカル	モデル7500
シリンジポンプ	ハーバード装置	70-2208