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方法論記事

還元的にメチル化されたタンパク質上の13C-ジメチルN末端アミンのNMR共鳴を同定する方法

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DOI:

10.3791/50875

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2013年12月12日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University

この記事について

サマリー

還元的に13C-メチル化N末端リジンのα-およびε-ジメチルアミン核磁気共鳴信号を割り当てるための2つの方法が説明されています。1つの方法は、還元的メチル化反応のpH誘導選択性を利用し、もう1つの方法はアミノペプチダーゼを使用してN末端リジンを選択的に除去します。

要約

核磁気共鳴(NMR)分光法は、タンパク質の構造と動的研究のための実証済みの技術です。NMRでタンパク質を研究するには、通常、安定な磁気同位体を代謝的に取り込むことで感度を向上させ、逐次的な共鳴割り当てを可能にします。還元的13C-メチル化は、同位体取り込みの最も一般的な方法である細菌宿主の過剰発現に適さないタンパク質の代替標識法です。還元的13C-メチル化は、タンパク質の主要なアミノ基(リジンε-アミノ基とN末端α-アミノ基)を13のC-ジメチルアミノ基に修飾する穏やかな条件下で行われる化学反応です。ほとんどのタンパク質の構造と機能は、修飾によって変化しないため、代謝標識の実行可能な代替手段となっています。還元的な13C-メチル化はスパースな同位体標識を付加するため、NMRシグナルを割り当てる従来の方法は適用できません。タンパク質13C-ジメチルアミンNMRシグナルの割り当てを支援するための質量分析(MS)を使用した代替割り当て方法が開発されました。この分析法は、各一次アミノ基における13C標識の部分的および異なる量に依存しています。この方法の1つの制限は、タンパク質のN末端残基がリジンである場合、Lys1のα-およびε-ジメチルアミノ基をMSで個別に測定できないためです。この制限を回避するために、N末端のα-アミンと側鎖のε-アミンの両方に関連する13のC-ジメチルアミンのNMR共鳴を同定するための2つの方法が説明されています。ニワトリ卵白リゾチームLys1のN末端α-ジメチルアミンと側鎖ε-ジメチルアミンのNMRシグナルは、1 H-13Cヘテロ核単量子コヒーレンススペクトルで同定されます。

概要

核磁気共鳴(NMR)分光法は、タンパク質1の構造解明に有用なツールです。NMR分光法は、天然状態のタンパク質の溶液構造を決定するために使用できます。安定磁気同位体の天然存在量の低さを克服するためには、目的のタンパク質に13Cと15Nを組み込む必要があります。採用される最も一般的な方法は、細菌宿主2-3における組換え発現である。しかし、細菌宿主の過剰発現の2つの欠点は、翻訳後修飾を生じさせることができないことと、すべてのタンパク質に対して機能するわけではないことです3-4。細菌の発現がタンパク質産生の実行可能な経路ではない場合、非細菌性宿主での過剰発現を使用できますが、同位体標識は困難で高価です5。NMR分析のために13Cおよび15N同位体をタンパク質に組み込むための代替発現方法には、メチル標識6および単一13C、15Nアミノ酸7-9のための代謝前駆体を用いたスパース標識技術が含まれます。本明細書で使用されるスパース標識への化学的アプローチは、確立された還元的13C-メチル化反応(図1)であり、タンパク質上の主要なアミノ基 - N末端α-アミンおよびリジン、側鎖ε-アミン - がメチル化される。モノメチルアミンが形成されると、アミンはpKa値が高いため、再びメチル化され、ジメチルアミンを形成します。

還元的メチル化は、MeansとFeeney10によってタンパク質を化学的に修飾する方法として最初に導入されました。この反応の利点は、その広範な適用性と、緩衝された生理学的pHおよび低温での穏やかな反応条件です11,12。ホルムアルデヒドとジメチルアミンボラン錯体(DMAB)などの還元剤の存在下では、リジンε-アミノ基とN末端α-アミノ基が選択的にメチル化されてジメチル化アミンが生成されます。ホルムアルデヒドはメチレン架橋の形成を通じてタンパク質を架橋することが知られているが、このプロセスは還元剤13,14によってブロックされる。

還元的メチル化は、NMRとX線結晶構造解析の両方でタンパク質を研究するために成功裏に使用されています。還元的メチル化は、他の方法では難治性タンパク質の結晶化を促進するために使用される15。鶏卵白リゾチームは、ジメチル化の形で結晶化した最初のタンパク質でした。メチル化リゾチーム構造と非メチル化リゾチーム構造の重原子間の二乗平均平方根差は0.40 Å16です。この比較は、還元的メチル化後もタンパク質構造を維持できることを示しており、反応は構造解明のための実行可能な標識ツールになります。

還元的メチル化反応に13個のC標識ホルムアルデヒドを用いることにより、13個のC-ジメチル化アミンが生成されます。13種類のC-ジメチルアミンは、タンパク質のダイナミクス、構造、および機能の研究に広く使用されているNMR検出可能なプローブです。NMRおよび還元的13C-メチル化は、β2アドレナリン受容体17、リボヌクレアーゼA18、リゾチーム19、fd遺伝子5タンパク質20、およびシトクロムc21のタンパク質-リガンドおよびタンパク質-タンパク質相互作用の研究に使用されています。同様に、構造的および機能的特性は、還元的に13C−メチル化リボヌクレアーゼA22、リゾチーム23、fd遺伝子5タンパク質24、Clostridium pasteurianum ferredoxin25、IgG26のFcフラグメント、アポリポタンパク質A−I27、およびMIP−1α28の13C−ジメチルアミノ基の動態が、コンカナバリンA29−30およびカルモジュリン31で研究されてきた。

還元的13C-メチル化がNMRによるタンパク質の研究に広く使用されてきたにもかかわらず、NMR共鳴26を割り当てることの難しさにより、標識方法は常に制限されてきました。還元的に13C-メチル化タンパク質のためのほとんどの割り当て戦略は、少数の部位に依存してきました、20,28既知の構造特性11,19,23,26,31,32。または広範な遺伝子改変33。これらの研究のいずれも、各リジン33の部位特異的突然変異誘発によってピークが割り当てられたカルモジュリン研究を除いて、13のC-ジメチルアミンピークすべてを成功裏に割り当てたわけではありませんでした。MIP-1αダイマー形成の研究では、還元的に13個のC-メチル化アミンのNMR割り当てを支援するための質量分析(MS)の使用が最初に報告されました28。 マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)MS を使用して、ダイマーの界面におけるリジンを同定しました。ヒトMIP-1αトリプシンペプチドの部分メチル化リジンをMSで同定し、2D 1 H-13C HSQC NMRスペクトル28で観察されたインタクトタンパク質のモノメチルアミンシグナルおよびジメチルアミンシグナルの出現と相関しました。私たちのグループは、MSの使用を拡大し、アミノ酸配列34以外のタンパク質の構造や特性に関する予備知識を必要としない割り当て方法を提示しました。この方法は、ほとんどのタンパク質に適用できます。1つの例外は、N末端リジンαおよびε-13C-ジメチルアミンのMS同位体プロファイルを独立して測定できないため、タンパク質がN末端リジンを有する場合です。

ここでは、N末端リジン残基のN末端α-ジメチルアミンと側鎖ε-ジメチルアミン部位を同定するための、化学的方法と酵素的方法の2つを紹介します。最初の方法は、Córdovaらに触発されました。タンパク質アセチル化の選択性を制御するためにpHを使用した人35。この反応は、低pHではN末端のα-アミン、高pHでは側鎖のε-アミンに有利であり、彼らの研究では、キャピラリー電気泳動によりタンパク質α-アミノ基とε-アミノ基を区別することができる。還元的 13C-メチル化反応を使用してタンパク質アミノ基の標識を変更し、MS 支援割り当て戦略の適用を可能にするために、高 pH と低 pH がどのように使用されるかを示します。N末端α-およびε-13C-ジメチルアミンをアサインする2番目の方法は、組換えAeromonas proteolytica aminopeptidaseを用いてN末端残基を選択的に除去する方法を利用します。

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プロトコル

1. リゾチームの還元的メチル化

  1. pH 7.5の50 mMリン酸ナトリウム緩衝液500 mLを調製します。室温で保存してください。
  2. 完全標識サンプル(FLS)、低pH部分標識サンプル(LpH)、および高pH部分標識サンプル(HpH)用の3本の1 mL微量遠心チューブを標識します。
  3. リゾチーム10 mgを秤量し、リン酸ナトリウム緩衝液2 mlに溶解して、濃度5 mg / mlの水溶液を作成します。各チューブに500 μlのリゾチーム溶液を添加します。
  4. ジメチルアミンボラン錯体(DMAB)と13C-ホルムアルデヒドの新鮮な1.0 M溶液を調製します。0°Cで保存してください。
  5. 完全に標識されたサンプルには1:10のモル比(反応性アミン:ホルムアルデヒド)を使用し、部分的に標識されたサンプルには1:5の比率を使用します。あるいは、比率を最適化することもできます。例えば、低 pH での α-13C-ジメチルアミンのピークの優位性を確認するためには、2:7 の比率が必要でした。
  6. FLSに6.1 μlの1.0 M DMABを添加し、1.0 M DMAB3.2 μlをLpHおよびHpHに添加し、穏やかにボルテックスします。次に、12.3 μlの1.0 M 13C-ホルムアルデヒドをFLSに加え、6.1 μlの1.0 M 13C-ホルムアルデヒドをLpHとHpHに加えます。反応混合物を4°Cで2時間振とうします。
  7. 前のステップと同様に、1.0 M DMABと13C-ホルムアルデヒドの別のアリコートを加え、反応混合物を4°Cで一晩振とうし、合計18〜24時間の反応時間を確保します。
  8. サンプルのバッファーをpH 7.5のリン酸に交換し、遠心フィルター(分子量カットオフ値3 kDa)を使用して余分な試薬と副生成物を除去します。
  9. 部分的に標識されたサンプルについては、pH 7.5でサンプルを天然存在量のホルムアルデヒドで還元的にメチル化して、均一に修飾されたタンパク質を作成します。DMABと天然存在量のホルムアルデヒドの新しい1.0 M溶液を調製します。
  10. サンプルチューブをホイルで覆い、6.1 μlのDMABをLpHとHpHに加え、穏やかにボルテックスします。次に、12.3μlの天然存在量ホルムアルデヒドを加えます。反応混合物を4°Cで2時間振とうします。
  11. 前のステップと同様に、1.0 M DMABと天然存在量のホルムアルデヒドの別のアリコートを追加し、反応混合物を4°Cで一晩振とうし、合計18〜24時間の反応時間を確保します。次に、ステップ2.5-2.6を使用してバッファー交換を行い、MS用に50μgのサンプルを-20°Cで保存します。

2. NMR分析用の試料を調製します。

  1. H2OでpH 8.5の2.0 Mホウ酸ナトリウム緩衝液を調製します。
  2. 375 μlの2.0 Mホウ酸ナトリウム緩衝液を4本の15 mLコニカルチューブに加えます。上部と突っ穴をパラフィルム化します。フラスコを凍結乾燥フラスコに入れ、サンプルを凍結します。
  3. 凍結したサンプルを凍結乾燥機に置き、乾燥させます。乾いたら取り外します。
  4. ピペットを使用して、各チューブに15 mlのD2Oを加えて混合します。
  5. 3 つの 4 ml 遠心フィルター (分子量カットオフ 3 kDa) に FLS、LpH、HpH を標識し、対応するサンプルをフィルターチューブ (~500 μl) に加えます。pH 8.5の50 mMホウ酸ナトリウム緩衝液3.0 mLを各チューブに加えます。3本目のチューブ用のバランスチューブを作製し、4°C、7,500 rcfの35°固定角ローターを備えた遠心分離機を使用して、サンプルを500 μlに濃縮します。
  6. 各フィルターの下のトラップを空にします。さらに3.0 mLのバッファーをサンプルに加え、サンプルを再び500 μlに濃縮します。手順2.5を4回繰り返します。
  7. ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ36を用いて、各試料の濃度を決定する。リゾチームサンプルを50 mMホウ酸ナトリウムバッファーで希釈して、150 μMサンプルを作製します。
  8. 530 μlを5 mm NMRチューブに、または250 μMを5 mm磁化率適合チューブに移します。
  9. 1,2-ジクロロエタン-13C2 in D2Oの80 mMストック溶液を調製し、このストック溶液を-80°Cで保存し、80 μlで24 mMに希釈し、同軸インサートチューブに移してNMR分析のリファレンスとして使用します。NMRでサンプルを分析します。注:1D 1 H-13C HSQC を解析し、各共振のピーク面積を積分します。ピーク面積は、完全に標識されたサンプルで同じである必要があります。

3. リゾチームのアミノペプチダーゼ分解

  1. 超純水に5 mg / mlのリゾチーム溶液を調製します。.
  2. 250 μlのリゾチーム溶液を清潔な1 mLの遠心分離チューブに加えます。
  3. 0.1 Mトリシン溶液(pH 8.0)25 μl、2.16 μg/mL Aeromonas proteolytica aminopeptidase溶液6 μlを添加します。
  4. 37°Cで6時間インキュベートします。
  5. 2.16 μg/mlのアミノペプチダーゼ溶液を6 μl追加してサンプルに加え、アミノペプチダーゼとリゾチームのモル比を1:50にします。37°Cで20時間インキュベー
    6. トします。
  6. C18スピンカラムを使用してサンプル30 μlを脱塩します(メーカーのプロトコルに従います)。MALDI MS分析のために-20°Cで保存してください。
  7. 残りのタンパク質サンプルをNMR用に調製します(プロトコル2)に記載)。

4. 質量分析用のサンプルを準備する

  1. ステップ 2.3 でリザーブした 50 μg のサンプルを使用して、バッファーを 100 mM 重炭酸アンモニウム (pH 8.0) に交換し、1 mL の遠心フィルター (分子量カットオフ値 3 kDa) を使用して約 50 μl に濃縮します。サンプルを1 mLの遠心分離チューブに移し、アルミホイルで包みます。
  2. 2.0 μlの500 mMジチオスレイトールを添加して、ジスルフィド結合を減らします。溶液を60°Cで1時間インキュベートします。
  3. 調製したばかりの500 mMヨードアセトアミド2 μlを加えて、チオール基をアルキル化します。室温で20分間インキュベートします。
  4. ホイルをはがし、500 mMのジチオスレイトール溶液1.0 μlを加えて反応をクエンチします。
  5. 2.0 μgのシーケンシンググレードのトリプシンを添加して、タンパク質を消化します。混合物を37°Cで16〜24時間インキュベートします。
  6. pHが2未満になるまでTFAを添加して、消化を急冷します。(ギ酸、酢酸も使用可能)
  7. C18スピンカラムでサンプルを脱塩し、タンパク質を80%アセトニトリル/0.1%TFAで溶出します。真空濃縮器を使用してサンプルを乾燥させます。
  8. MALDI MS分析のために、5.0 μLの50%アセトニトリル/0.1% TFAにサンプルを再構成します。等量の再構成したサンプルと2,5-ジヒドロキシ安息香酸マトリックス溶液の飽和溶液をMALDIターゲットプレート上で混合します。MALDI MSでサンプルを分析します。注:タンデムMSを使用して、ペプチドピークの同一性を確認してください。マススペクトルを平滑化して分析します。各ジメチルアミン含有ペプチドについて、プロファイル内の各同位体のピーク強度とピーク面積を決定します。前述の34のように、13C-incorporationの割合を計算します。

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結果

還元的メチル化とpH

リゾチームにおいて、pH誘導による化学選択的な還元的な13C-メチル化反応が実証されています。低pHでは、反応は側鎖のε-アミンよりもN末端のα-アミンを優先し、高pHではその逆となります。溶液中では、タンパク質のアミノ基は遊離アミンと共役酸の間で平衡状態にあり、これはpHによって調整可能です。この反応の最適pH範囲は、使用する還元剤によって異なります。本例では、ジメチルアミンボランの最適pHは7.0-9.0です。還元剤の最適範囲外で操作すると反応効率が低下しますが、今回のケースではそれが利点となります。還元的なメチル化反応では、α-アミンの酸解離定数（pKa）が約723であり、ε-アミンの約1032よりも低いため、pH 6.0では優先的にN末端のα-アミンが修飾されます。pH 6.0では、平衡が共役酸側に劇的にシフトしますが、還元的なメチル化反応における反応形態である遊離アミンの濃度は、α-アミンにおいて最も高くなります。pH 10.0では、...

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ディスカッション

この同位体標識法を十分に利用するには、還元的に13のC-メチル化タンパク質のNMRシグナルを割り当てる必要があります。MS を使用して、部分的な 13C 取り込みデータの相関を通じて NMR 信号の割り当てを支援することは、有望な手法です。他の割り当て方法に対するこの手法の利点は、一次アミノ酸配列のみが必要であることです。α-ジメチルアミンとε-ジメチルアミンでの13C-取り込みはMSで別々に測定できないため、N末端アミノ酸がリジンの場合、MS支援割り当て法は制限されます。滴定実験では通常、α-ジメチルアミンの化学シフトのpH依存性が示されますが、塩橋やその他の構造的寄与により、化学シフトは信頼性の低い割り当て方法になります。提示された方法を使用すると、この問題を解決するだけでなく、MSでα-およびε-ジメチルアミノペプチドの個々の13C-%取り込みを測定するという問題も回避できます。1つの部位が標識されているため、13°C%の取り込み量をMSで直接測定できます。Lys1 α-およびε-ジメチルアミンの以前の割...

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開示事項

開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所の国立研究センターからの賞番号R00RR024105によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトニトリルシグマ34851
アミコンウルトラ 4 ml 遠心フィルター (3k MWCO)フィッシャーサイエンティフィックUFC800308 (8pk)
アミノペプチダーゼクリエイティブ バイオマートアミノペプチダーゼ-86A
重炭酸アンモニウムΣA6141
硫酸アンモニウムΣA5132
ボラン-ジメチルアミン錯体シグマ180238使用前に新鮮な1 M溶液を作ります。
ホウ酸Sigma B6768
ウシ膵臓インスリンSigmaI5500
C18 スピンカラムThermo Scientific89870
酸化重水素Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-4-100
1,2-ジクロロエタン-13C2Sigma714321-80°Cで保存された80 mMのストック溶液は、24 mMのNMRスペクトルで参照として使用されます。
ホルムアルデヒド(36.5%wt/wt)シグマ33220使用前に新鮮な1 M溶液を作ります。
13C-ホルムアルデヒド(99%)ケンブリッジアイソトープラボラトリーズCLM-806-1前に新鮮な1M溶液を作ります。
リゾチーム(鶏卵白)SigmaL6376
リン酸ナトリウム(二塩基性七水和物)SigmaS9390
リン酸ナトリウム(一塩基性)SigmaS9638
トリシンSigmaT0377
トリフルオロ酢酸Sigma302031
700 MHz Varian VNMRS と 5 mm HCN 5922 プローブAgilentテクノロジー
Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOFBruker
使用

参考文献

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