方法論記事

大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

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DOI：

10.3791/50880

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2013年11月18日

 , 
1Department of Medicine, University of Dresden, 2Center for Regerative Therapies Dresden

この記事について

サマリー

成人脳から採取した神経幹細胞は神経系の発達の基礎研究から再生医療の潜在的な臨床応用を探索範囲の用途に利用が増加している。これは実験的な成果を鳴らす重要なこれらの細胞を成長させるために使用される分離と培養条件に厳密な制御を行う。

要約

最近の研究は、中枢神経系（CNS）腫瘍形成は、再生および幹細胞の集団（SCの）成体の脳内に存在することを含むことを示している。しかし、これらの正常静止細胞は、神経回路網の適切な機能を確保するだけでなく、神経変性過程の傷害や緩和からの回復におけるそれらの役割に採用するメカニズムはほとんど理解されています。これらの細胞は、血管系および免疫系の両方から調節シグナルを含む維持環境を提供する「ニッチ​​」と呼ばれる地域に存在します。未知の要因を除外する規定された培養条件の下での分離、メンテナンス、およびCNS SCの分化は、従って、それらのin vivoでの行動への洞察を提供し、薬理学的または遺伝的手段による治療にそれらにアクセスできるようになります。ここでは、成人の脳の異なった領域から中枢神経系のSCの文化を生成する方法に関する詳細な情報を提供し、そのDを評価するために近づいたニューロン、アストロサイト、およびin vitroでオリゴデンドロサイトへのifferentiationポテンシャル。この技術は、個々のSCおよびその子孫を研究するために可視化することができる単層培養として均一な細胞集団が得られる。さらに、損傷した成体の神経系において回生応答を予測するために以前に使用されて、異なる動物モデル系および臨床試料の両端に印加することができる。

概要

神経生物学のセントラルドグマは、前世紀以上ラモン·Y.カハールによって行われた脳の細胞構築の基本的な観測が定めた、神経新生はCNS 1で見つかったニューラルネットワークの複雑さを考えると、思春期の後にそうだったと判示した。 1960年代のアルトマンの作品、およびそれ以降のカプランは、3 H-チミジンは、実際にはニューロンは、成体脳の異なる領域で生成されていたことを示している成熟した神経細胞で見つけることができることを実証しているにもかかわらず、定説は2、3を保持し続けた。証拠は小鳥の脳4に存在するニューロンの数の季節変化を記述するノッテボームの研究をマウントし続けた。これはグールドらはラットの連合学習課題の性能だけでなく、Kornackとラキッチdemonstraの観察と海馬が増大するニューロンの生成に作品を発表1999年までではなかったティンは剛性が低く、より多くのプラスチック、脳の概念は、5認識された大人のマカク、6で神経新生を続けた。

これらの新たに生成された神経細胞のための細胞源の探索はニッチ7と呼ばれる脳の領域に存在する幹細胞（SCS）の離散的な人口の発見につながる。脳室下帯と海馬のサブ粒状ゾーンは二つの主要な神経性の地域8,9であると考えられている。これらの場所から単離された細胞は、古典的な胚または胎児に由来するSCの特徴的な、自己再生および分化能を表示します。神経幹細胞（NSC）の場合、それらは、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに分化させることができる。さらに、これらのSCは、例えば、中間径フィラメントタンパク質ネスチン10胎児NSCマーカーについて陽性に染色。 SCSはこれらのTに限定されていない可能性があり、より最近の研究のハイライトエリア、WOとは、実際にはしっかりと血管系11に関連する細胞の大部分は静止人口として脳全体にローカライズされています。

のSCが傷害に応答して動員される観察は、神経変性疾患および脳卒中12,13からの回復を助けるために回生目的のために、これらの細胞を利用することができるという可能性を示唆している。これは、間葉系幹細胞（MSC）は、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞14になる可能性がある血管周囲細胞として見出される結合組織の治癒において果たす役割とは違っていません。しかし、NSCは、ルーチン吸引および密度勾配遠心法によって骨髄からのMSCと同様にして採取することができないし、続いて自己細胞に基づく治療に利用する。結果として、そのようなEMBに由来する胎児ニューロンのNSC又は前駆体の使用などの細胞の他の源ryonic幹細胞が広範囲に成功15の様々な程度で、動物の病気や怪我モデルで検討されている。体細胞の供給源を利用して人工多能性幹細胞技術は、限られた在庫および胚細胞および胎児組織16の使用に関する倫理的な問題を克服する、広範囲の用途のために治療的に有用な細胞ベースの治療を製造するための別の潜在的な手段を提供する。しかし、これらの知見の臨床的変換は、SC-ベースの治療アプローチ17,18と同様に、規制当局の認可を曲がりくねった経路で種々の神経学的状態を治療する闘争に示されているように、困難な作業であることが証明されている。別のアプローチとして、特定の薬理学的治療の導入は、NSC数を調節し、パーキンソン病および脳卒中19のモデルの回復を促進することができる。戦略は、効果的にこれらの細胞を操作する方法を理解することがありますどのようなアクセス可能なin vitroの系を必要とします。

NSCの培養物はまた、ニューロスフェアとしても知られている凝集体の培養物として、または単層8,20のいずれかとして行うことができる。両方の技術は、広く、規定された培養条件の確立を可能にする、多能性前駆体の膨張を提供するマイトジェン源として上皮成長因子（EGF）または塩基性線維芽細胞成長因子（bFGFの） すなわち使用が使用されてきた。ニューロスフェア培養物が単離された細胞型のクローン増殖能力を研究するためのより適しているかもしれないが、システム21は、膨張時に細胞の混合集団を産生することが示されている。また、ニューロスフェアの密閉構造は、細胞の薬理学的操作が非現実的になり、これらの要因が持つ影響力の解釈は、ニューロスフェア自体の中で確立された微小環境に混乱する可能性があります。単層培養物は、他の一方で、あることができるSCの増殖および分化を調節し、特にこの細胞集団を標的とする新規化合物を発見する機会を開くシグナル伝達機構を探索するための強力なツールを提供する、小分子ライブラリーのハイスループットスクリーニングに用いられる。

その結果、再現可能脳内の関心の異なる領域からの成体NSCの培養物を生成する能力は、中枢神経系（CNS）の発達の研究からの新規な再生医療アプローチを探索するに至るまで、研究用途の広いスペクトルにおいて使用することができる。ここで紹介するプロトコルは、成人の齧歯類脳から単離されたCNS SCの分化能力を分析し、評価する方法を示しています。

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プロトコル

仕事はHelsinskiの宣言とARVO動物ステートメントに準拠しています。ドレスデン大学の動物施設の指示に従って、動物は組織収集のために使用された、関連するすべてのメソッドに従った。動物は処理され、収容された実験動物の使用とケアのためのドイツ連邦ガイドラインに従って、および研究はLandesdirektionドレスデンで承認されたされた。適切な安楽死の方法論について、あなたの機関の獣医ポリシー（動物実験委員会または他のボード）にご相談ください。

特定の株式や試薬の使用濃度は、このプロトコルに付随する試薬、表に記載されています。

1。培養皿の準備

  1. 一晩細胞培養インキュベーター中で75μg/ mlのポリ-L-オルニチン（6ウェルプレートのつまり 2ミリリットル/ウェル）の十分なボリュームのあるコートディッシュ2日前までにスケジュールされた解剖日まで。
  2. 吸引し、ポリ-L-オルニチン、次の日および5分間のPBS 3mlで各ウェル2Xを洗う。
  3. 最後の洗浄を削除し、プレートにフィブロネクチン（希釈1:250、PBS中の4μg/ mlの）を追加し、一晩培養器に料理を置く。
  4. 解剖の日にフィブロネクチンを吸引し、皿をPBSで2回洗浄します。まだ解離した組織は、培養のための準備ができるまで、インキュベーターに洗って、最終的なPBSを含むプレートを返します。その時に、前に組織をメッキに、PBSを除去します。
  5. ストア·プレートは、最大3週間、インキュベーターをポリ-L-ornithineinで被覆。フィブロネクチンでコーティングしたプレートは1週間まで保存することができる。緊急の場合は、フィブロネクチンコーティングは、わずか2時間で行うことができる。フィブロネクチンは、変性を受けやすい。ソリューションを撹拌や食器を乾燥させてください。

2。解剖/メッキ

  1. このプロトコルは、3成体ラット（生後3〜6ヶ月）の使用に適用されます。
  2. 子どもラットを安楽死させる前に、L氷上で脳切片のブロック。
  3. 氷上で追加されたbFGFを持つN2培地の5ミリリットルが含まれている15ミリリットルファルコンチューブを配置します。
  4. あなたの機関の獣医ポリシーに従ってラットを安楽死させる。
  5. 頭の正中切開下にすることで頭蓋骨から脳を取り出します。慎重に抽出されるべき脳を可能に骨を離れて剥離する鉗子を使用してください。
  6. 氷冷PBSを含む10 10cmペトリ皿に脳を置きます。これは残留髪と血液を除去します。 （ 図1A）
  7. チルド切片ブロックに脳を置きます。 （ 図1B）
  8. 図1Cに写真のようにブロックに1新しいクリーンかみそりの刃を挿入します。
  9. 図1（d）に示すように、第1、第2のクリーンかみそりの刃3ミリメートルの尾側を挿入します。
  10. 彼らと関心のある部分を取って、ブロックからブレードを慎重に持ち上げます。
  11. 秒フロートPBSに浸漬することにより、ブレードオフTION。 （ 図1E）
  12. 関心領域から収穫組織は＃5ピンセットを使用して（この例では、前交連、（前方）ACA、 図1Fに使用される）およびbFGFを含む1ミリリットルN2培地を含む15ミリリットルコニカルチューブに集める。
  13. 無菌条件下で、プロトコルの残りを継続する、層流細胞培養フードにチューブを移動させる。
  14. 機械的にP1000ピペッターに装着1ミリリットルピペットチップを用いて組織を解離する。ピペットは、上下に数回（約20倍、毎秒1分注サイクルの割合で）円錐管の底部にピペットチップの開口部を押しながら（1G 1-3図 ）。溶液が均一になったときにチュレーションを停止します。
  15. ソリューションは、任意の大きな非解離組織が底に沈殿することができるように2分間静置する。 （ 図1G 4）
  16. homogenを集めるeous上清とN2培地の8.5ミリリットルを加えた20 ng / mlのbFGFを、500 ng / mLのDll4の、500 ng / mLのAng2は、200 nMJAK阻害剤を含むコニカルチューブに入れます。
  17. /ウェルの希釈した細胞溶液3mlを用いて、6ウェルプレートの3ウェルにそれらをプレート。
  18. 37°C、5％CO 2、5％O 2の加湿細胞インキュベーター中にプレートを置き。

3。毎日のケア

  1. めっき後24時間後に阻害剤のbFGF、Ang2は、Dll4の、およびJAKを含むN2培地で培養皿上でメディアを交換してください。
  2. bFGFは、Dll4の、Ang2は、次の日に、JAK阻害剤のボーラスを追加します。
  3. メディアの変化と、10〜14日の計因子添加のこの交互のプロセスを継続する。

4。分化誘導

  1. 培地を含む阻害剤のbFGF、Dll4の、Ang2は、およびJAKを撤回し、任意の追加要素が含まれていないN2培地に交換してください。
  2. 隔日の媒体を変更します。
  3. 10日後に細胞を固定し、免疫細胞化学を行う。

5。免疫細胞化学的検出

  1. 培地を吸引し、20分間、4％パラホルムアルデヒド2mlの細胞培養プレートを固定する。
  2. 5分ごとに、3mlのPBSで洗浄2X。
  3. PBSを吸引除去し、次に20分間、5％正常ロバ血清（NDS）および0.1％トリトンX-100を含有するPBS 2 mlを添加することにより細胞を透過し、遮断する。
  4. 5％、NDSを含むPBS中の一次抗体ミックスを調製する。のTuJ1（クラスIIIβ-チューブリン）、GFAP、およびCNPアーゼ抗体は分化マーカーの三重染色のために一緒に使用することができ、一方、抗ネスチン抗体は、SCのを識別するために使用することができる。
  5. ブロッキング溶液を吸引し、各ウェルに一次抗体混合物の1.5ミリリットルを追加。 90分間室温でインキュベートする。
  6. 一次抗体を除去し、3mlのPBSで2回洗浄し、5分ごとに5％のNDSを含むPBS 3mlで1X。
  7. た準備5％NDSを含有するPBSで二次抗体を電子。
  8. 最終洗浄を吸引し、各ウェルに二次抗体溶液1.5mlを加える。室温で40分間、暗所でインキュベートする。
  9. 二次抗体溶液を除去し、新たに調製されたDAPI染色（PBS中500 ng / mL）を2 mlを加える。 3分間インキュベートする。
  10. DAPI溶液を吸引し、5分間ずつ3mlのPBSで3回洗浄します。細胞は、今や蛍光顕微鏡で可視化することができる。

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結果

神経幹細胞を採取するための関心領域を識別することは重要な第一歩であり、それは細胞のコンフルエントなプレートを取得するのにかかる時間の量を定義する。例えば、SVZは、古典的な神経原性領域であり、従って、神経幹細胞のより高い相対的割合を有している。しかしながら、ここに記載した技術は、多くの場合、成人期にロバスト神経原性ポテンシャルを有すると認識されていない他の領域で使用することができる。このプロトコルの目的のために、我々は、前交連（前部）を使用した。細胞や残骸の一部がメッキの際に解決しますが、中には通常存在する以下のチュレーションで細胞材料の量の結果として濁ったままになります。 24時間で最初の培地交換はこれの大部分を除去します。光学顕微鏡で可視化されるように、でも、最初の培地交換した後、血管に沿って、残りの細胞物質を多量にあるように表示されます。の過程で今後数日間は、明確な増殖細胞集団のコロニーは、顕微鏡（ 図2A）の下に見えるようになります。これらは、bFGF、Ang2は、Dll4の、およびJAK阻害剤を含有するN2培地を用いて増殖について選択された神経幹細胞である。また、複数の細長い紡錘状の細胞集団が...

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ディスカッション

成功した分離、拡大、及び成体脳由来の神経幹細胞の分化にとって重要なステップの多くは、標準的な組織培養技術に共通に共有される。心に留めて目的は、成人の脳から単離されたNSCは、できるだけそれらのインビボ特性（ 図2J）の多くを維持するべきであるということです。多くの場合、必要​​な注意と適切な速度のバランスが打たれる必要がある。頭蓋骨から脳を単離とケアは、関心領域の識別が大幅に容易になります。動物の安楽死、次の可能な限り迅速に組織を除去し、収穫や洗浄中に脳の寒さを保つことは、それを維持し、より剛性の大幅それは、金型を区画ステンレス鋼に置かれたときに組織の処理に役立ちます。これはまた、切削プロセスの間に組織をリッピング可能性を最小限に抑えることができます。プロトコルは、ABLであることから利益を得るそれらはインビトロで置かれたら、これは細胞生存率を増加させるように、電子、迅速にめっきする点に細胞を取得する。前切片への適切な組織の洗浄には、培養中の汚染の可能性を減らすことができます。解離工程中に1mlのピペットチップで粉砕し、激しくあるべきであるが、過剰な気泡または負に影響...

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開示事項

我々は、開示することは何もありません。

謝辞

イメージングおよび硬化環境代謝疾患、ヘルムホルツ協会のイニシアチブとネットワーク基金を通じ、エルスKroener-フレゼニウス財団からの助成金、およびドイツ学術振興（からの助成金 - この作品は、ヘルムホルツアライアンスICEMEDによって（部分的に）資金を供給したSFB 655：組織への細胞）。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6ウェル組織培養皿BD Biosciences353934
Poly-L-ornithineSigma-AldrichP-3655

5 mg/ml 二度蒸留水で調製したストック溶液 (-20°C;C).

水中の作業濃度0.5 mg/ml(4°C;C).

フィブロネクチンR&D Systems1030-FN攪拌しないでください ストック溶液
ろ過装置コーニングライフサイエンス430769
DMEM/F-12Mediatech10-090-CV完全なN2培地調製については、以下の注を参照してください
Apo-transferrinSigma-AldrichT-2036
インスリンSigma-AldrichI-0516
PutrescineSigma-AldrichP-57801 M ストック溶液、ddH2O (20 °C;C for 6 months)
亜セレン酸ナトリウムSigma-AldrichS-5261500 µddH2O中のMストック溶液(-20°Cで安定;C for 6 months)
プロゲステロンSigma-AldrichP-8783100 µエタノール中のMストック溶液(-20°Cで安定;C for 6 months)
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140-122
Phosphate Buffered SalineMediatech21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)R&D Systems233-FB使用濃度 20 ng/ml 
Delta4 (DLL4)R&D Systems1389-D4使用濃度  500 ng/ml
アンジオポエチン 2 (Ang2)R&D Systems623-AN使用濃度  500 ng/ml
JAK 阻害剤Calbiochem420099使用濃度 200 nM 
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA-2058
15 mlおよび50mlの円錐管コーニングライフサイエンス430053、430829
その他の必要なアイテムには、 カミソリの刃や鉗子などの一般的な解剖器具、成体ラット(生後3〜6ヶ月;Sprague-DawleyまたはLong Evans)、CO2中毒チャンバー、細胞培養およびインキュベーター用の層流フードインキュベーター(加湿、37°C;C、5%CO2、5%O2)。注:完全なN2培地調製のために、DMEM/F-12(500 ml)の1本のボトルに、0.05 gのアポトランスフェリン、0.0125 gのインスリン(1 mLの10 mM NaOHに新たに溶解)、50 μプトレシンのl、30 μ亜セレン酸ナトリウムのl、100 μl プロゲステロンストック、および5 mLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液。必要に応じて、pHを7.2に調整します。フィルター滅菌し、4°Cで保管します。Cは最大3週間持続し、光から保護します。
免疫蛍光試薬表
パラホルムアルデヒド電子顕微鏡 科学15719
正常ロバ血清 (NDS)Sigma-AldrichD-9663
Triton X-100Sigma-AldrichT-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD-84175 mg/ml ストックメタノール
Primary Antibody Table
NestinChemiconMAB353

Dilution Factor: 1:400

Species: Mouse IgG1

Hes3 Santa Cruzsc-25393

Dilution Factor: 1:100

Species: Rabbit IgG

Sox2R&D SystemsMAB2018

希釈係数: 1:100

種: マウス IgG2a

CNPaseChemiconMAB326

希釈係数: 1:200

種: マウス IgG1

&β;-tubulin III (TUJ1)R&D SystemsMAB1195

希釈係数: 1:500

種: マウス IgG2a

グリア線維性酸性タンパク質 (GFAP)Dako North AmericaZ0334

Dilution Factor 1:500

種: Rabbit

二次抗体テーブル
Alexa  568InvitrogenA-21124

希釈係数: 1:200

種: ヤギ抗マウス IgG1

Alexa 488InvitrogenA-21131

希釈係数: 1:200

種: ヤギ抗マウス IgG2a

Cy5Jackson ImmunoResearch59883

希釈係数: 1:200

種:ヤギ反ウサギ

溶液

参考文献

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