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方法論記事

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

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DOI:

10.3791/50905

⸱

2013年11月25日

 ,  ,  ,  , 
1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。

要約

脳室下帯（SVZ）は、出生後の脳内の主要な神経性のニッチの一つです。ここで、神経前駆細胞は増殖し、嗅球（OB）に向かって吻側細胞移動（RMS）に沿って移動することができる神経芽細胞を生じさせる。この長距離移動は、OBにおける新生ニューロンのその後の成熟に必要であるが、このプロセスを制御する分子メカニズムは未だ不明であるされている。神経芽細胞の運動性を制御するシグナル伝達経路を調査すると、神経発生における基本的なステップを理解するのに役立つだけでなく、治療上の再生能力を持っている、損傷、脳卒中、または変性の影響を受けた脳の部位を対象とし、これらの神経芽細胞の能力を与えられたことだけではなく。

本稿では、我々はin vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよびマウスのRMSにおける神経芽細胞の遊走のその後のタイムラプスイメージングのための詳細なプロトコルを記述します。出生後のエレクトロポレーションを効率的にSVZ前駆をトランスフェクトすることができる今度は、RMSに沿って移行する神経芽細胞を生成する細胞が、。急性脳スライス培養での共焦点スピニングディスクタイムラプス顕微鏡を用いて、神経芽細胞の遊走は、密接に、生体内の条件に似た環境で監視することができます。また、神経芽細胞の運動性を追跡し、定量的に分析することができる。一例として、我々は、RMSに沿って移行する神経芽細胞を標識し、可視化するために、GFP発現プラスミドのin vivo出生後のエレクトロポレーションを使用する方法について説明します。 loxPシステムを用いたコンディショナルノックアウトマウスのshRNAまたはCREリコンビナーゼ発現プラスミドのエレクトロポレーションはまた、目的の遺伝子を標的化するために使用することができる。急性脳切片培養物の薬理学的操作は、神経芽細胞遊走における異なるシグナル伝達分子の役割を調べるために行うことができる。タイムラプスイメージングと生体内エレクトロポレーションに結合させることにより、我々は、神経芽細胞の運動性を制御する分子機構を理解し、開発に貢献したいと考えてい小説のMENTは、脳の修復を促進することに近づく。

概要

哺乳動物の脳では、新しいニューロン（神経新生）を生成する、2つの領域、側脳室および海馬1の歯状回における下帯の脳室下帯（SVZ）を中心に、出生後に発生します。近年では集まったかなりの証拠は、海馬や嗅球メモリ機能1-3出生後の神経新生の重要な役割をサポートしています。重要なのは、出生後の神経新生はまた、治療のため神経変性疾患との関係の可能性、および脳4-6で負傷部位に移動する神経芽細胞の能力を保持している。

脳室下帯（SVZ）は最近、重要な神経性のニッチとして浮上している。 SVZ由来の神経芽細胞は、この出生後の脳の1,7,8の中で最も長い移行プロセス作り、吻側渡り鳥ストリーム（RMS）を介して嗅球（OB）に向かって移動。哺乳類SVZ / RMS / OBシステムになっていますこのような増殖、遊走及び分化1,8などの神経発生における様々なステップを、研究するための有用なモデル。多くの増殖因子および細胞外の合図は、RMSに沿って、SVZニューロン新生と移動を調節するが、細胞内の分子メカニズムは今のところ、完全に1,9を理解しているからである。 RMSに沿って適切な移行が新生ニューロン10のその後の成熟のために重要である。さらに、いくつかの研究は、SVZ由来の神経芽細胞は、脳損傷部位4-6,11-13にRMSから移動できることが示されている。このように、神経芽細胞の遊走を制御するシグナル伝達機構を研究することは、神経発生を理解するだけでなく、潜在的な治療用途のみならず基本である。

ここでは、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションによってSVZ神経前駆細胞を標識し、タイムラプス回転するディスク共焦点microscoを使用して急性脳スライス培養のRMSに沿ってそれらの移動を監視するための詳細なプロトコルを記述PY。エレクトロポレーションは広く、胚から成体の段階14〜18までの発達の研究に使用されている。それは、SVZ神経前駆細胞を標的とし、操作するための強力なツールであり、ウイルスベクターやトランスジェニックモデル1,15,19,20の世代の定位注入に安く、かなり高速な代替を表しています。これは、手術を必要とし、高い生存率を有していない比較的簡単な手順である。 loxPシステムを用いたマウスでのshRNAまたはCREリコンビナーゼ発現プラスミドのエレクトロポレーション遺伝モデルは、従って、成体神経新生のための有用なツールを表すこと21,22を研究し 、目的の遺伝子を標的とするか、SVZ前駆細胞の永久的な標識化を達成するために使用することができる。

無傷の脳内でのイメージングのRMS神経芽細胞の遊走は、現在の技術的な制限のため、依然として困難である。しかしながら、この方法は適切なシステム経験を提供する急性脳切片の共焦点スピニングディスクタイムラプス顕微鏡を用いてモニターすることができるEMは、密接に薬理学的操作23,24にも適用できるin vivoでの条件に似ている。タイムラプスイメージングを用いたin vivo生後のエレクトロポレーションでの結合は、神経芽細胞の運動性を制御する分子機構の理解を容易にし、脳の修復を促進するための新しいアプローチの開発に貢献していきます。

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プロトコル

この手順では、英国内務省の規制（動物科学手続法、1986）に準拠しています。科学者たちは、彼らの機関や国の動物規制機関によって確立され、承認されたガイドラインに従う必要があります。

1。出生後のエレクトロポレーション

1.1。ガラス管は、DNAソリューションとエレクトロポの調製

  1. DNA注入用のプルガラスキャピラリー（0.86ミリメートル：1.5ミリメートル、ID OD）を準備します。 （サッターP-97キャピラリープラーの指標設定は、次のとおりです。熱283; 50を引いて、速度90、タイム50）。約2μLの容量に対応したキャピラリーにマークを作る。
  2. 850ミリ秒間隔（100 V、50ミリ秒のONパルスは、850ミリ秒、パルス5をOFFパルス）で、100 Vで5矩形パルス、50ミリ秒/パルスにエレクトロの電圧を設定します。
  3. 1〜2μgの/μLの最終濃度になるように、高純度（OD 280分の260> 1.80）エンドトキシンフリーのプラスミドDNAを希釈エンドトキシンフリーのトリス-EDTA緩衝液またはPBSで。それは、DNA溶液（首尾注射した場合に染料が心室に広がる必要があります）に0.1％ファストグリーンを追加することをお勧めします。
  4. 5〜7ミリの電極を用意し、電極ゲルと加熱パッドを温める。

1.2。エレクトロポレーション

  1. ケージから生後2マウス子犬を削除して（〜0.6リットル/分の流量で）、イソフルラン吸入によってそれを麻酔。
  2. 約1分後に、足のピンチ応答を使用して麻酔の状態を決定する。移動が発生しない場合は、室内注射を進める。
  3. キャピラリーに接続されている吸引管を用いたDNAの1〜2μlのキャピラリーニードルをロードします。
  4. 冷光源の下では、親指とあなたの少ない利き手の人差し指で子犬の頭を保持します。少し右に注入点の識別を助けるために頭の上に肌を引き戻す。
  5. 目とTの間に仮想回線を検討彼は画期的なラムダ（ 図1A）頭骨計測の。ラムダ（ライン中点から約1mm）15からこのラインの長さの約3分の1にキャピラリ針を挿入する。脳内に深く浸透を避けるために確認しながら、約2ミリメートルの深さのキャピラリーを挿入します。
  6. 口からゆっくりと吹き込んでプラスミドを注入（キャピラリーに接続されたシリンジを使用することもできます）。この手順の間、これが成功したプラスミド注入を防止することができますようにあなたの指が、脳に過剰な圧力を適用していないことを確認してください。
  7. DNA溶液の最小量がキャピラリー内で放置されたときに注入を停止する。これは、頭蓋内圧の有害な増加を避けるために、1未満μLを注入することをお勧めします。
  8. コート両方の電極をゲルとし、DNAを注入した半球の側方（ 図1A）に正側でそれらを配置します。吻側SVZへのDNA取り込み、わずかに吻側場所電極用注入点。電極位置を変化させることSVZ 22,25のさまざまな分野で、エレクトロポレーションの地域特異性を達成することができます。
  9. パルスフットペダルを押すと、現在の転送を開始します。エレクトロポレーションが完了すると、（より低い電圧値が悪いエレクトロポレーション効率と相関するので、電圧値は、90 V以下のであってはならない）エレクトロ·ディスプレイの電圧を確認してください。
  10. 数分間加熱パッド上に酸素の下に子犬を生き返らせるとケージに戻して、母親から離れて置くこと。母親が子犬を取得し、ごみの残りの部分と一緒に再会を確認してください。エレクトロポレーション後、次のステップの前に4-7日間、自分の母親と子犬のままにしておきます。

2。急性脳スライス培養の準備

2.1。ソリューションとツールの準備

  1. 以下の溶液が必要である（それが解剖およびイメージングのための高グルコースDMEMを使用することも可能である17）：
    解剖培地（500ml）に
    をゲイの平衡メディア - 500ミリリットル
    45％のグルコース - 5ミリリットル
    ムービー培地（10ml）に
    45％のグルコース - 0.110ミリリットル
    HEPES、1M - 0.100ミリリットル
    ペニシリン/ - 0.100ミリリットル
    FCS - 0.500ミリリットル
    B27 - 0.100ミリリットル
    グルタミン - 0.200ミリリットル
    ダルベッコ改変イーグル培地（フェノールレッドを含まない） - 8.89ミリリットル
  2. 37℃での映画の媒体を温める
  3. ミリセルは37℃/ 5％CO 2の加湿インキュベーター中で、映画媒体と場所の1ミリリットルを含む35ミリメートルのガラスボトム培養皿に挿入配置します。
  4. ビブラアクセサリー（ねじ回し、チャンバー、かみそりの刃、接着剤）を準備します。
  5. はさみ、小さなヘラ、ストレートピンセット：解剖ツールを準備します。
  6. スライスを処理するためのツールを準備します。小さな絵筆またはソフト接種ループ（サイズ：10μL）、プラスチック製パスツールピペット、アイスボックスといくつかの6cmのプラスチック製の食器を。
  7. 解剖媒体を予冷2-4℃で、

2.2。脳スライスの作製

  1. 予備冷却解剖培地で6cmディッシュを記入し、（新たにカットスライスを保つために）氷の上に置きます。
  2. 頸椎脱臼に続いて、マウスの仔を斬首するためにハサミを使用しています。 、メスで頭皮を削除小脳にOBから半ば矢状縫合糸に沿って頭蓋骨をカットし、静かにピンセットを用いて頭蓋フラップを削除します。脳全体が露出していることを確認し、慎重に組織を損傷しないように特別な注意しながら、へらを使用してそれを解剖する。解剖は、慎重に行わなければならないが、同時に非常に迅速に（可能ならば分未満）。医薬品/ガス麻酔薬との終末麻酔は神経芽細胞の遊走特性と動物の犠牲次比較的早く画像化される必要がある脳のスライス培養の健康な状態に影響を与えることができるので、頸椎脱臼は、我々の好ましい方法である。
  3. RAZで脳を二等分するまたはブレード（ 図2）。非注入半球を捨てるか、他の実験のために使用します。
  4. ビブラホルダーにテープの小片を置き、その上に脳半球（ 図2）を添付する接着剤の必要最小限の量を使用しています。これは、繰り返される接着剤の用途にホルダー表面の損傷防止します。
  5. 接着剤は数秒間乾燥させます。
  6. 予備冷却解剖溶液で満たしビブラトームトレイにホルダーを配置します。ブレード（ 図2）に向かって嗅球を指す。
  7. 適切な設定を用いて脳半球の切断を開始する。以下のパラメータを推奨します。スライス厚さ300μm、スピード〜3月5日;周波数〜9。高周波と低速度がスライスへの損傷を防止することをお勧めします。
  8. 小さな絵筆またはソフト接種ループを使用してスライスを収集します。のみ表示OB（通常は2〜3スライス/脳）でスライスを保つ。通常、RMS CAの大部分を含むスライスN底面から〜300程度で見つけること。
  9. （両サイドに蛍光を確認するためにそれらを裏返しにしてくださいする）GFPシグナルのための標準的な蛍光顕微鏡下でスライスをチェックして、RMSの大部分に沿って明るい蛍光を示すものを選択します。

2.3。脳スライスを培養

  1. 細胞培養フードでは、脳切片の最も尾三を切り取るとファインストレートピンセットやマイクロダイセクションメスを使用して、任意の接着剤の痕跡を除去。
  2. 繊細にして挿入して予め温めミリセルの中心に置きます（これはスライスの損傷を避けることができます、大きな開口部を作成するためにピペットの先端をカット）プラスチック製パスツールピペットを用いてスライスを吸引除去する。
  3. （倒立顕微鏡とイメージングのために）を挿入明るい蛍光シグナルを持つ側がミリセルに接触して配置されていることを確認します。
  4. ピペットを用いて、インサートの上に余分な解剖ソリューションを削除します。
  5. にスライス培養を残す少なくともイメージングの前に1時間、37℃/ 5％CO 2インキュベーター内で落ち着く。

3。神経芽細胞遊走のタイムラプスイメージング

  1. イメージングの前に少なくとも2時間は、ニコンのTi-Eの顕微鏡を反転パーキンエルマーUltraViewVoX共焦点スピニングディスクシステム、オンにし、浜松C10600-10B（ORCA-R2）は一定に設定されたデジタルCCDカメラと、加熱システム（ソレントSci​​entific）を冷却37℃の温度
  2. Volocityソフトウェア取得モジュールを開いて、「VIZ」ボタンをクリックし、画像化するためのレーザを選択します。
  3. 脳スライス標本の2時間以内に、顕微鏡ステージ上で画像化チャンバー内で脳切片を含むガラスボトムディッシュを置く。
  4. 画像化されるスライスの領域を選択し、集中するための適切な蛍光灯の下でニコンCFIスーパープランフルーアELWD 20X/0.45目標（ 例えば単なる注射部位の後のRMSの最初の下降部分、またはELBOを使用W RMSの領域、または単に肘後神経芽細胞がOBに入る前に）。
  5. 次のアクションでタイムラプスイメージングを設定します。
    1. 顕微鏡では、試料のレーザー走査を可能にするためにL100]ボタンをクリックしてください。
    2. Volocityでは、適切なレーザー（GFP用など 488 nmのレーザーを使用）を選択してULTRAVIEWレーザーチェンジャーを開きます。
    3. 蛍光シグナルの強度に応じて、（通常は100〜500ミリ秒の間）、露光時間とレーザ強度​​（通常20％）を設定します。
    4. セルの視覚化を改善するために、画像のデジタルゲインを調整します。
    5. 脳切片の内部 （通常は100〜120ミクロン間隔での）イメージにzスタック間隔を選択します。 （これは、その後の追跡分析を容易にする）極力可能な重複を避けるために、単離された細胞の適当な数で時間間隔を選択する。
    6. 各zスタック画像（通常は2〜4程度）の間の間隔を選択します。
    7. 時間INTを選択してください各zスタックキャプチャ（ 例えば 3分）、総イメージング時間（ 例えば 3時間）の間erval。
    8. 撮像パラメータの変更を保存し、「保存」アイコンをクリックしてください。
    9. イメージングを開始するには録画ボタンを押してください。
  6. 同じ日を通して制御及び実験試料の代替画像（例えば車両/薬物治療または別のエレクトロポレーションしたプラスミド）。

4。神経芽細胞の移行を分析する

  1. Volocity定量モジュールでは、タイムラプス実験を完了した後に作成された目的のライブラリを開きます。左上のボックス（ 図4A、ステップ1）からの「拡張フォーカス」を選択します。
  2. （ 図4A、ステップ2）測定ウィンドウを表示し、「測定」タブをクリックします。
  3. タスクのリストが画面の左下に表示されます。の下部に向かってドラッグして「トラック」（「その他」の下に存在上の空間のリスト）。これは画面（ 図4（a）、ステップ3）の左上部には「トラック」と呼ばれる新しいウィンドウのオープンを要求されます。
  4. トラックウィンドウ（ 図4A、ステップ4）の「入力」タブから「ポイント」を選択します。
  5. ポイントツール（ 図4A、ステップ5）をクリックします。
  6. 細胞体の中央部上をマウスでクリックすることにより移行する神経芽細胞の追跡を開始し、時間経過の最後の時点まで、細胞の動きを追跡しておくに達した（3時間に及ぶ映画のための例のポイント番号61の場合） 。
  7. データを得るために測定メニュー（ 図4B、6-7ステップ）から「測定項目の作成 ​​」を選択します。ウィンドウが画面中央に表示されます。
  8. このウィンドウでは、 "と呼ばれる新たな測定項目を「選択した（ 図4C、ステップ8）の名前を入力します。 PRの前に「すべての時点」オプションを選択することを忘れないでくださいディエッサー、OK（ 図4C、ステップ9）。測定項目ファイルには、タイムラプスファイルの下に表示され、定量分析のためのパラメータ（ 例えば移動距離、速度、変位、変位速度）が含まれています。
  9. ウィンドウ（ 図4D、ステップ10）ようにして開き、測定項目ファイルをダブルクリックします。
  10. 分析した細胞の単一トラックを視覚化するために、「表示」オプション（ 図4D、ステップ11）から「トラックバック·ポイント」を選択します。
  11. 右の測定項目ファイルをクリックし、移行パラメータを分析するためのExcelのようなプログラムにインポートすることができ、テキストフ​​ァイルとしてエクスポートします。
  12. 撮影期間中に各セルによって行われた連続したフレームとポーズの間の動きを測定するために、測定項目ファイルの「表示」オプションの「点」または「集団」とIDをクリックします（すべてのトラックが固有のIDを持っている）から選択する。続行による結果のファイルをエクスポートするステップ4.10で説明したようにING。

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結果

SVZ由来の神経芽細胞遊走の標識は、通常、4〜8日に成功し、エレクトロポレーション（ 図1B）の後に、RMSに沿って観察することができる。長い時間点も選択することができますが、それらのほとんどは、OBを入力してするので、少ない細胞は、RMSに記載されています。神経芽細胞は、約2〜3週間後にエレクトロポレーション（図示せず）のOBでの成熟顆粒細胞の典型的な形態や機能の取得を開始。 〜1時間培養した後、エレクトロポ仔マウスからの脳切片を確実にまで3-4時間にわたり画像化することができる。以前に報告されているように23,26、神経芽細胞を定量（ 図4）トラッキングセルを用いて分析することができる、複雑な移行の動力学（ 図3及びビデオ1）を表示することができる。

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ディスカッション

RMSに沿って神経前駆細胞の効率的な移行は、機能的なニューロン10に彼らのその後の成熟を ​​保証します。 OBに向けた神経前駆細胞の顕著な流れは、人間の初期の段階で表示され、出生後早期人間の脳の発達27に重要な役割を果たしている可能性が高い。さらに、これらの細胞は傷害および神経変性4,28の影響を受けた脳の部位を標的とすることができます。リアルタイムで神経芽細胞動態に遺伝子操作の影響を監視することができることは、完全に神経芽細胞の移動が案内され、規制されているかを理解することが不可欠となります。

ここでは、急性脳スライス培養の経時共焦点スピニングディスク顕微鏡でインビボ出生後エレクトロポレーションを結合することによってSVZ由来の神経芽細胞遊走をモニターするためのプロトコルを記載している。具体的には、神経前駆細胞を移行するSVZにおいて、プラスミドENCをエレクトロポレーションによって標識することができるかを示しているGFPをoding。研究の目的に応じて、プラスミドのいくつかのタイプ（

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

MSとYZはKCLとKCL-中国の博士課程のstudentshipsによってサポートされています。 MOは、バイオテクノロジー·生物科学研究評議会の博士課程の学生の身分によって資金を供給された。私たちは、エレクトロポレーションについて貴重なアドバイス勝岡部と純一宮崎PCX-EGFPプラスミドおよびアランChedotalとアテナイプシランティに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ミリセルミリポアPICM0RG50
35 mm ガラス底培養皿MatTekP35G-0-14-C
Gey's バランス培地SigmaG9779-500ML
グルコース、45%SigmaG8769-100ML
HEPESΣH3375-25G
ペン/溶連菌GIBCO15140-122
FCSGIBCO10109-163
B27 supplementInvitrogen Life Technologies17504044
L-GlutamineInvitrogen Life Technologies>25030-081
DMEM (フェノールレッドフリー)GIBCO31053-028
Fast GreenSigmaF7252-5G
注射用ガラス毛細管ハーバード装置30-0057
アスピレーターチューブシグマA5177
サッター P-97 キャピラリープーラーサッター装置P-97
ECM830 矩形波エレクトロポレーターハーバード装置45-0052
プラチナピンセット 7 mmハーバード装置45-0488
フットスイッチ モデル 1250Fハーバード 装置45-0211
電極用ゲルCefar Compex6602048
IsofluraneMerialAP/DRUGS/220/96
VibratomeLeicaVT1000S
GlueRoti collRoti coll 1
UltraViEW VoX スピニング ディスク システムPerkin Elmer浜松製作所搭載のカスタマイズセットアップ(複数のレーザー光源を使用可能)
OVOCITYソフトウェア VolocityソフトウェアPerkin Elmer取得・定量・可視化モジュール
顕微鏡用環境チャンバーソレント・サイエンティフィックカスタムメイド
Ti-E倒立顕微鏡ニコンCFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA 対物レンズは、このホワイトペーパーで説明するアプリケーションに最適です
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参考文献

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生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中
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