方法論記事

線維芽細胞媒介フィブリンゲル圧縮の観察と定量

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DOI：

10.3791/50918

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2014年1月16日

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1Department of Biomedical Engineering, University of Iowa

この記事について

サマリー

時間経過顕微鏡と画像処理技術は、48時間の期間にわたって環境制御バイオリアクターにおける線維芽細胞媒介ゲル圧縮およびフィブリン線維再調整を観察し、分析するために使用された。

要約

コラーゲンおよびフィブリンゲルに埋め込まれた細胞は、ゲルの繊維に牽引力を加え、作用します。これらの力は、ゲル微細構造の局所およびグローバルな再編成および再編成につながる可能性があります。このプロセスは、細胞の位置、ゲルの幾何学的形状、およびゲルの機械的拘束との相互作用に部分的に依存する複雑な方法で進みます。これらの変数がグローバルな繊維アライメントパターンを生成する方法をよりよく理解するために、我々は、環境制御されたバイオリアクターと組み合わせたタイムラプス差動干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を使用して、幾何学的に間隔をあけた外植(線維芽細胞のクラスター)間の圧縮プロセスを観察する。次に、画像をカスタム画像処理アルゴリズムで分析し、歪みのマップを取得します。この技術から得られた情報は、創傷治癒、疾患の発生、および組織工学の応用におけるプロセスを理解する上で重要な意味を持つ様々な細胞マトリックス相互作用のメカノバイオロジーを調査するために使用することができる。

概要

細胞とマトリックスの相互作用を研究するための重要なツールは、細胞に取り込まれたコラーゲンゲル1,2である。ゲルは、組織の in vivo 特性に近く、従来の2D培養3によって提供されるよりも細胞の挙動を理解するのに適した3D環境を提供する。線維芽細胞がコラーゲンゲル内に均一に分布していた初期の研究では、細胞がコラーゲン線維を急速に統合し、ゲル4,5をコンパクト化することを発見した。フリーフローティングゲルの収縮線維芽細胞は、ゲルが完全に圧縮1,6,7に達した直後に静止状態に移行する。境界で拘束されたゲル中の線維芽細胞は活性な合成状態8のままであり、ゲル幾何学と外部拘束に依存する方法で繊維アライメントを生成する5,9。細胞活性の違いは、細胞がゲル内のコラーゲン線維にインテグリンを介して牽引力を発揮するにつれて発症する内部張力(またはその欠如)の結果であるように思われる。

この技術の変形は、線維芽細胞の外植体(すなわち細胞の塊)をコラーゲンゲル内に離れた距離に配置し、細胞とマトリックスの相互作用を観察し、外植体(靭帯状ストラップと呼ばれることもある)10-12の間の繊維アライメントの段階的な発達を含む。外植システムの主な利点は、細胞を単純な幾何学的パターンに配置できるため、細胞駆動型繊維再調整の基礎となるメカニズムをより簡単に視覚化して調査できることです。これらのアライメントパターンは、主に細胞牽引力、細胞空間分布、ゲル形状、およびゲル上の機械的制約間の相互作用に依存するものであり、グローバル組織組織、機械的機能、および局所的な機械環境における中心的な役割を果たすため、理解することが重要である。

組織工学の分野では、機械的に機能的で工学的組織を製造するための1つの戦略は、人工組織がネイティブ組織14,15のそれを模した繊維アライメントを有するように、細胞圧縮から発生する繊維アライメントパターンを制御することを含む。このようなアライメントは、人工組織がネイティブ組織の複雑な機械的挙動を複製するために必要と考えられる。この戦略の修正は、コラーゲンゲルをフィブリンゲル16に置換することです。フィブリンゲルは、圧縮時にコラーゲンゲルと同様のアライメントパターンを発現する。時間が経つにつれて、フィブリンは分解され、初期のフィブリン繊維アライメントパターンに従う細胞合成ECMに置き換えられます。得られた工学的構造は、コラーゲンゲル由来の構築物17と比較して有意に改善された機械的特性を有する。

フィブリンゲルにおけるアライメントプロセスとその後のリモデリングイベントは、複雑で理解が不十分な方法で進行します。これらの相互作用と細胞挙動とECMリモデリングへの影響をより良く特徴付けるために、我々は、外植法に基づく手順を開発した。この方法では、線維芽細胞の外植は、異なる幾何学的パターンでフィブリンゲル上に配置される。ゲルは、環境制御された顕微鏡実装型バイオリアクター18に維持され、圧縮および繊維再調整のプロセスは、タイムラプス差動干渉コントラスト(DIC)顕微鏡で監視される。変位フィールドはカスタムアルゴリズムで定量化されます。これらの実験から得られたデータは、組織工学戦略の最適化、創傷治癒の改善、病理学的組織リモデリングの治療など、多くのプロセスに大きな影響を及ぼします。

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プロトコル

1. ステンシルの準備

パラフィルム上にステンシルを用意して、各外植の位置を、目的のジオメトリ(図1A および 1B)に従ってレイアウトします。スペースは、約1〜2ミリメートル離れて各植え出し。この距離は、外植間の繊維の整列を生成するための理想的な間隔に対応します。カバーグラスの下に、サンプルをテープで用意する場所の下にステンシルを貼り付けます。

2. 殺菌

70%エタノールを使用してバイオリアクターのすべての成分を徹底的に洗浄し、実験前にUV光下で2〜3時間殺菌します。代替容器がバイオリアクターの代わりに使用されている場合は、適切な滅菌技術を使用する必要があります。ガラス底ペトリ皿の使用に関するコメントについては、ステップ4.12を参照してください。

3. フィブリンゲル調製

バイオリアクターの成分が滅菌された後、カバーグラスの表面にフィブリンゲルの薄い層を投げる。フィブリノーゲンおよびトロンビンのストック溶液を調製するための詳細は、6.6 mg/mlフィブリンゲルを製造するためのものです。13 Yeらによる同様のプロトコル.3.3 mg/ml フィブリンゲルを作るための19も、JoVE のウェブサイトで見ることができます。

  1. DMEMの蛍光マイクロビーズの溶液を1000万ビーズ/mlの濃度で調製します。ビーズはゲルの変位を追跡するのに役立ちます。この濃度を達成するには、マイクロビーズストック溶液0.017 mlと0.149 mlのDMEMをマイクロ遠心チューブに組み合わせます。
  2. この懸濁液を10分間超音波処理してビーズを分散させ、溶液を均質化します。
  3. フィブリン溶液 - 15 mlのcチューブで、0.22 mlのフィブリノーゲンストック溶液を0.44 mlの20 mM HEPESバッファーと混合します。ステップ 3.1 で作成したマイクロビーズを使用して、DMEM の 0.1667 ml を追加します。
  4. トロンビン溶液 - 別の15 ml cチューブで、トロンビンストック溶液0.0328 ml、20 mM HEPESバッファーの0.131 ml、および0.00246 mlの2 M CaCl2を混ぜ合わせます。
  5. スロンビン溶液(ステップ3.4)をフィブリノーゲン溶液(ステップ3.3)と慎重に混合し、溶液が均等に分配されるまで5〜10倍上下にピペット化します。できるだけ気泡を導入しないでください。発生する気泡の量を減らすには、混合しながらピペットを充分に排出しないように注意してください。
  6. トロンビンを添加すると、溶液が素早くゲル化する(〜30秒)。できるだけ早くカバーグラスに混合溶液をピペット。ゲルをRTで重合させる。
  7. バイオリアクターをシールし、加熱ブロックを挿入し、熱電対を温度コントローラに接続します。ゲルを37°Cで15~30分間インキュベートします。

4. 細胞外植の準備

  1. ヒト皮膚線維芽細胞を含むT-75フラスコから培地を除去する。
  2. 約5mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で表面を慎重にすすいで血清タンパク質を除去します。トリプシン-EDTAを1ml加え、3分間、または細胞が持ち上げられるまでインキュベートします。
  3. 細胞を持ち上げた後、200 x gの遠心分離機で懸濁液を5分間回転させます。上清を取り除き、2000万個の細胞/mlの最終的な濃度を可能にするDMEMの容積のペレットを再懸濁させる。
  4. 遠心分離機で細胞が回転している間、バイオリアクターは加熱ブロックと熱電対から切り離されます。バイオリアクターをバイオセーフティキャビネットに移し、次のアセプティックな技術に従って蓋を慎重に取り外します。
  5. ステンシル上のパターンに従って、重合フィブリンゲルに細胞懸濁液の0.3 μlをピペット化して、外植体を作成します。各外植は約6,000個の細胞を含む必要があります。少量のマイクロピペットチップ(0.1~10 μl)を使用してください。
  6. 細胞が37°Cで1時間、フィブリンマトリックスに沈着し、沈着させます。
  7. バイオリアクターがまだ開いている場合、約5mlのDMEMを10%のウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.1%アンホテリシンB、10mg/mlアプロチニンをバイオリアクターに直接加えます。DMEMは、炭酸水素塩緩衝処理され、中性pHを維持するために5%のCO2を必要とする。バイオリアクターはCO2を供給していないので、使用前に2〜3時間5%CO2でインキュベーター中の培地を条件とします。アプロチニンは、フィブリン分解率20を低減するために広く使用されているセリンプロテアーゼ阻害剤である。
  8. バイオリアクターを再シールします。注射器を使用して、入口ポートの有刺鉄線の付属品を介してCO2コンディショムの追加5 mlを供給します。ゆっくりと培地を分配し、バイオリアクターチャンバーの全容が満たされていることを確認します。バイオリアクターに形成される気泡を慎重に除去します。
  9. pHを維持し、栄養素を供給し、廃棄物を除去するために、実験全体を通してバイオリアクターに新鮮な、5%のCO2コンディション培地を供給します。5%CO2コンディション培地で満たされた10 mlまたは30mlシリンジでシリンジポンプをセットアップします。シリンジをバイオリアクターの蓋の入口ポートにLuerロック装着の無菌チューブで直接接続します。オスのフィッティングを取り外し、チューブをバイオリアクターの有刺鉄線の付属品に取り付けます(図1Cを参照)。
  10. 灌流速度を0.01 ml/分に設定します。両方の出口の港に管の変更された部分を接続し、廃棄物を収集するために100 mlビーカーに端を置きます。
  11. ラボジャックを使用して、バイオリアクターで圧力差が発生しないように、入口と出口フィードの高さを設定します(参考用の 図1D を参照)。
  12. バイオリアクターが利用できない場合は、ガラスの上に35mmのガラス底ペトリ皿にサンプルを用意してください。使用する特定の目標のセットに合わせて最適化されたカバースリップサイズを使用します。ペトリ料理で調製されたサンプルは、37°Cおよび5%CO2のインキュベーターで維持する必要があります。
    注:ポリスチレン脱分極光は光を妨げ、DICイメージングを妨げるので、DICイメージングを行う場合はガラストップを使用する必要があります。位相コントラストは、適当な代替イメージングモダリティである。インキュベーターと顕微鏡の間で食器を移すと、画像の登録が困難になります。画像が正しく登録されていない場合、セクション6で計算された歪みは正確ではありません。

5. タイムラプスイメージング

  1. サンプルが準備されたら、バイオリアクターを再シールし、加熱ブロックと熱電対を再接続し、バイオリアクター温度を37°Cに設定します。
  2. バイオリアクターを、電動化ステージに取り付けた顕微鏡にセットします。ビューポートの下に 20X DIC の目標を配置します。特に、精密な電動ステージが利用できない場合は、低倍率の目標が許容されます。偏光子、アナライザ、プリズムがすべて整っていることを確認します。あるいは、サンプルは位相コントラストを用いて画像化することもできる。
  3. イメージングソフトウェアを開きます。
  4. 目的を 3 つの外植植物の間の領域に焦点を合わせます。
  5. この位置の座標(x、y、z)をイメージングソフトウェアに保存します。
  6. 外植の間と周囲の領域全体を画像化するために、大きな画像を取得するオプションを選択し、領域のサイズを指定します。これにより、指定した領域の周囲に複数の画像を取得し、サンプルのより大きな領域を表すタイル画像を作成できます。
  7. 光毒性による細胞死を避けるため、細胞、マイクロビーズ、フィブリン繊維を判別するのに十分な解像度を提供しながら、露光時間と光強度を可能な限り低い値に設定します。

6. ひずみ追跡

歪み追跡ソフトウェアの詳細と指示については、使用されている歪み追跡ソフトウェア (図 2)を参照 してください。21アルゴリズムは 、http://www.license.umn.edu/default.aspxからダウンロードできるカスタム MATLAB コードです。DIC イメージには、歪みトラッキングに十分なテクスチャが付くことがよくあります。マイクロビーズは、計算されたひずみフィールドのチェックとして機能するように含まれています。ひずみ追跡が行われる場合、取得した画像が正確に同じ場所で撮影され、画像が登録されるようにすることが重要です。未登録の画像は、スプリアス株を生成します。

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結果

組織のリモデリングは、細胞と周囲のマトリックスとの間の相互的な物理的相互作用によって部分的に駆動される複雑なプロセスです。細胞は周囲の繊維を再編成し、繊維ネットワークで張力を発生させる。繊維と機械環境の位置合わせは、細胞の挙動を制御し、細胞とマトリックスの両方がグローバルに再編成して再構成された組織を作り出す。本実験では、外植体の細胞は、最初は形態において丸くなり、ゲル内に伸び、フィブリン繊維に付着し始めた(図3)。細胞は、ゲルを通って伝播する牽引力を発揮し、外植体間の軸に平行に繊維の配向を誘発した。数時間のうちに「ストラップ」が見えるようになりました(図3A)。ひずみ測定はまた、最大の歪みが外植の間の軸に横向きであることを示した(図3D および 3E)。この領域の繊維は軸方向に自由に変換できるため、この領域ではひずみが最も高くなります。

このプロトコルは、細胞誘導マトリックスのリモデリングと繊維の位置合わせが細胞挙動に及ぼす影響を研究するための単...

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ディスカッション

このプロトコルは、細胞介在ECMリモデリングに関与する力学を観察し、定量化することを目的として開発されました。このようなプロセスは、多くの生物現象の根源であり、工学組織2,22に重要な意味を持ち、瘢痕1,23を減少させ、病理学的組織改修を理解する12,24。タイムラプスDIC顕微鏡を使用することで、細胞牽引力の結果として生じるフィブリン繊維の変位と位置合わせを解決し、定量化することができます。ここで観察された再編成は、リモデリングプロセスの第1段階であり、コラーゲン11に観察された組織パターンに従う。再編成は、フィブリン分解とECM合成の組み合わせが続く。改造の再編成段階は数時間から数日にわたって行われるのに対し、改造プロセスの合成段階は13を展開するのに数週間かかる。ここで説明するシステムは数週間動作可能であるため、これらの後段階のイベントを監視するように調整できます。

この手法を変更する可能性がある場合は、外植の場所、数、およびサイズを変更して、異なるジオメトリを作成し...

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

ジョージ・ジュディスとスティーブン・エリアソンは、ヒトの真皮線維芽細胞とラメシュ・ラグパシーに株追跡アルゴリズムの助けを寄付してくれたことに感謝します。この作業の支援は、米国教育省の国家支援フェローシップ(GAANN P200A120071)の大学院支援によって提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
シグマ・アルドリッチF8630
シグマ・アルドリッチT4648
ギブコ11965-092
ギブコ15140-122
シグマ・アルドリッチA2942
シグマ・アルドリッチH0887
シグマ・アルドリッチ223506
Gibco25200-056
Invitrogen3000
LonzaDE14-701F
Molecular ProbesF8858
GIBCOA10483-01
GIBCO11430-030
Fisher-ScientificSS264-1
Sigma-AldrichA3428-25MG
Biotense BioreactorADMET
Ti-Eclipe顕微鏡ニコン
# 0 35 mm ガラス底ペトリ皿MatTekP35G-0-20-C
# 0 35 mm ガラストップペトリ皿MatTekP35GTOP-0-20-C
プラスチックルアー継手、ルアーエンド付きPVCチューブコールパーマー30600-65

参考文献

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