培養された膀胱上皮を越えるヒト好中球の移行の定量的評価

サマリー

私たちは、尿路病原性大腸菌で膀胱の感染中の急性の炎症反応の重要な要素を模倣したin vitroモデルを開発しました。 transuroepithelial好中球遊走アッセイは、細菌感染や化学誘引物質に反応して、透過性の支持体上で培養、膀胱上皮間でヒト好中球の遊走の定量的評価が可能になります。

要約

炎症部位への周囲からの免疫細胞の動員は、任意の粘膜表面での自然免疫応答において重要なステップです。膀胱の感染の間に、多形核白血球（PMN、好中球）は、血流から移動した膀胱上皮を横断する。好中球応答がない場合に感染を解決しないと、膀胱防御にPMNの重要性を示している。膀胱上皮、尿路病原性大腸菌 （UPEC）、尿路感染症（UTI）の大部分の原因物質の定着を促進するために、部分的に定義された様々な機構を使用して急性炎症反応を弱める。さらに、ホストおよび細菌病原体の間の相互作用を調べるために、我々はUPECに対する自然免疫応答のこの態様のインビトロモデルを開発した。 transuroepithelial好中球遊走アッセイでは、Boydenチャンバーのバリエーション、培養された膀胱epithelial細胞は透過性支持体の下側に密集するまで成長させる。 PMNは、ヒト静脈血から単離され、膀胱上皮細胞層の側底側に適用される。細菌感染または化学誘引物質の分子に反応して、生理的に適切な基底外側への頂端方向を表すPMNの移行は、血球計数器を使用して列挙されている。このモデルは、UPECおよび真核細胞間の相互作用を調査するために、ならびにPMNによる膀胱上皮のトラバーサルのための分子の要件を調べるために使用することができる。 transuroepithelial好中球遊走モデルは、膀胱内のUPECへの初期炎症反応の我々の理解を促進します。

概要

全身の細胞の動きは、多くの場合、長い距離を越え、成長と発展、創傷治癒、および免疫応答に必要です。細胞移動は複雑であり、シグナル伝達カスケードおよび細胞骨格成分の再配置を含む多くの異なるプロセスの調整を必要とする。細胞は（ケモキネシス）だけでなく、定義された化学勾配（走化性）に向かってランダムに移動することができます。多くの技術は、 インビトロで細胞遊走を研究するために開発されてきた。最も古く、最も一般的な手法、Boydenチャンバーは、化学誘引物質は下部チャンバー内に配置され、目的の細胞を上部チャンバー¹内に配置された垂直2チャンバシステムで構成されています。二つのチャンバーを分離する規定サイズの孔を有する通気フィルターを横切る細胞の移動は、監視される。さらなる技術は、Zigmond室²及びダンチャンバを含む、細胞移動を研究するために開発されている^3。これらの集合的なアプローチは、多くの異なる細胞型の移動に重要な洞察が得られている。

ケモキネシスおよび走化性の基本原理に問い合わせることに加えて、二チャンバーアッセイは、細胞外マトリックス成分との両方の内皮細胞および上皮細胞層を介して細胞移動の調査を促進した。他の技術上の2つのチャンバシステムの利点は、多孔質膜は、例えば、コラーゲンまたはフィブリノーゲンのようなタンパク質でコーティングすることができる、および細胞外マトリックス状の障壁を横切る細胞移動を評価することができることである。さらに、培養細胞株を増殖させ、透過性の支持体上で区別することができる。内皮障壁を横切る細胞の移動を調べるために、培養内皮細胞を播種し、透過性支持体の上部リザーバ中で増殖させる。例えば、免疫細胞などの運動性細胞は、エン全体の下池に上部貯水池と移行に追加されます生理学的な頂端から側底方向にdothelial障壁が観察される。このモデルは、血流からの免疫細胞の血管外遊出を理解する上で非常に貴重であった。移行を経内皮とは対照的に、上皮バリアを横切る細胞の移動は、典型的には、側底側から頂端方向に発生する。 インビトロでこれらのイベントをモデル化するために、研究者らは、透過性支持体の下側に培養上皮細胞を播種し、成長する。運動性の細胞は側底から頂端方向を表す、上皮バリアを横切る上側リザーバおよび遊走に追加され、監視される。経上皮の移行のようなモデルが大幅に粘膜表面での炎症反応、特に肺のものと^、4,5腸の我々の理解に貢献した。

対照的に、尿路の上皮を介して免疫細胞の輸送はそれほど注目されている。私たちのunderstandiを促進するために膀胱上皮バリア⁶渡って動き、（好中球、PMN）NG尿路病原性大腸菌 （UPEC）による感染時の尿路内の自然免疫応答のため、我々は多形核白血球の調査を可能にするin vitroアッセイ、transuroepithelial好中球遊走アッセイを開発^-8。経上皮遊走の他の二チャンバーモデルと同様に、培養されたヒト膀胱上皮細胞は、透過性支持体の下側に増殖させ、コンフルエント上皮層を形成している。静脈血から単離されたヒト好中球は、上皮層の側底側に適用され、生理学的に関連する側底から頂端方向に上皮を横切る遊走は、E.の異なる株による感染に応答して定量化される大腸菌や化学誘引分子の存在。多くの研究は、追加の細胞型の非存在下での好中球の移動、ケモキネシスおよび走化性の両方に焦点を当てていた。それは考慮感染の間、膀胱上皮細胞と免疫細胞との間の複雑な相互作用を要するようtransuroepithelial好中球遊走アッセイは有利である。この扱いやすいin vitroモデルは、尿路上皮表面における免疫応答の詳細な調査を許可する可能性を秘めている。

プロトコル

1。 5637膀胱上皮細胞を培養

層流の組織培養フードUV照射を用いて調製し、70％エタノールで拭いで次の手順を実行します。

1. 水浴中で10％ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI-1640培地を調製[RPMI +称される]、フィルターは、0.22μmの孔径のフィルターを用いて滅菌し、37℃に加温し。
2. 37℃の水浴中で、5637細胞（膀胱癌由来アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクションHTB-9）のクライオバイアルを解凍する。すぐに20ミリリットルのRPMI +を含む75cm ^2の組織培養フラスコに解凍した細胞を移す。
3. 細胞が約95％コンフルエント（フラスコあたり約6×10 ⁶細胞）を、約4日になるまで、5％CO ₂の加湿雰囲気中で37℃でフラスコをインキュベートする。
4. 5637細胞を継代培養するには、次のように
   1. フラスコから培地を除去します。 10ミリリットルダルベッコリン酸緩衝サリンで細胞を洗浄室温でのE（DPBS）。
   2. 6ミリリットル温かい（37℃）0.05％トリプシンをフラスコに0.02％EDTA溶液を添加し、15分間、5％CO _2、37℃でインキュベートする。
   3. 15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移し、5分間300×gでの遠心分離によってペレット化。トリプシン/ EDTA溶液を除去します。
   4. 6ミリリットルRPMI +（10 ⁶細胞/ ml）で細胞を再懸濁し、20mlのRPMI +を含む新しい75cm ^2のフラスコに転送1ミリリットル（10 ⁶細胞）。
5. 4日ごとに、または細胞が95％コンフルエントに達する細胞を継代培養を繰り返して手順1.4。

2。透過性支持体上に5637細胞を播種し、成長

無菌法を用いて組織培養フードで次の手順を実行します。最適な結果を得るために、10未満のサブカルチャーを受けた5637細胞を使用しています。

1. 滅菌ピンセットを使用して、無菌の25ミリメートルの深さの組織培養皿に透過性のサポートを反転。
1.4.1-1.4.3の手順に従って、95％コンフルエンスで5637細胞の75cm ^2のフラスコをトリプシン処理。
2. 1,000μピペットを用いて、穏やかに血球計数器を用いて細胞計数によって決定3×10 ⁶細胞/ mlの濃度まで〜2ミリリットル+ RPMI中で細胞を再懸濁する。
3. 膜に接触することなく、各透過性支持に細胞懸濁液50μl（1.5×10 ⁵細胞）を適用します。皿に蓋を置き、慎重にこれ以上の16以上の時間のために、5％のCO _2、37℃での皿を置く。
4. ウェルあたり0.6ミリリットルのRPMI +を含む24ウェルプレートに滅菌ピンセット、右透過性担体を用いる。各透過性支持の上部タンクに0.1ミリリットルのRPMI +を追加します。 5％のCO _2、37℃でインキュベートする。
5. 2日ごとに培地を交換してください。最初、吸引下池に続く上部貯水池からの培地、および、低い貯水池（0.6ミリリットル）に、逆の順序で新鮮な、RPMI +を適用してから、上RESErvoir（0.1ミリリットル）。
6. 七日5637細胞と浸透支援を播種後、細胞の合流点を評価。 、RPMI +（〜0.35ミリリットル）を上部貯水池を埋める。媒体は、上下のリザーバとの間に平衡しない場合に細胞がコンフルエントに十分である。

3。細菌接種の準備

1. 無菌法を用いて、キャップを250ミリリットルのフラスコに、適切な培養液20ミリリットルを追加。 E.のためのルリア-ベルターニ（LB）培地を使用してください大腸菌の文化、そして適切な場合には培養液に抗生物質を追加します。
2. 無菌接種ループを使用して、グリセロールストックからの細菌やストリークプレートと培養液に接種。 UPEC株について、（1型線毛の産生を促進するために）、振とうすることなく、約16時間、37℃で細菌培養物をインキュベートする。
3. 遠心管に細菌培養を転送します。 10分間8000×gでの遠心分離によって細菌をペレット化。
4. 上清をデカント、および〜10 ⁹ CFU / mlのと同等の_、600 = 1.000にOD PBSに細菌を懸濁します。
   1. 熱殺菌細菌刺激を生成するには、30分間55℃で再懸濁した細菌の一定分量（150μL中の例えば 〜1.5×10 ⁸ CFU）をインキュベートする。細菌の死を確認するために、熱殺菌懸濁液の一部をメッキ。
5. 使用直前に再懸濁させ、細菌を（ライブまたは熱殺菌）10倍暖かい無血清RPMI中⁸ CFU / mlの10には、マイクロチューブ内に[RPMI-呼ば]希釈する。

4。末梢血からヒト好中球の分離

成人ボランティアからの採血は、事前審査や治験審査委員会の承認を必要とします。適切な個人保護具を着用し、適切にヒトの血液への暴露をさけるため、有害物質を処分。

1. 健康な成人vから静脈血を約25ミリリットルolunteerは瀉血の訓練を受けたスタッフが3無菌ヘパリンナトリウム含有採血管に引き込まれるべきである。
   1. しっかりと肘の上、上腕にゴム止血帯を包む。
   2. 無菌70％アルコール拭きを使用して、侵入部位、前肘窩を消毒。
   3. 翼付き翼状針システムにプラスチック製のチューブホルダーを取り付けます。
   4. 上を向いて傾斜、30°の角度以下で肘正中静脈に針を挿入します。血液のスパートは、プラスチックチューブで表示されたときに針が静脈に穿刺しています。
   5. プラスチックチューブホルダ内に採血管を挿入する。最初のコレクションチューブが満杯になると、第2の収集チューブに置き換える。第3のチューブを繰り返します。
   6. 第三のコレクションチューブは約半分いっぱいになったときに、止血帯を削除します。
   7. 無菌コットンボールで穿刺部位をカバーし、徐々に静脈から針を引き抜く。針と場所、私の上に保護シールドをスライドさせバイオハザードシャープコンテナNA。
   8. 穿刺部位に圧力を加える。絆創膏で穿刺部位や綿球をカバーしています。
   9. 穏やかにヘパリンを分散させるために採血管を反転させる。

無菌法を用いて組織培養フードで次の手順を実行します。

2. 10ミリリットルピペットを用いて、優しくフレッシュな滅菌50ミリリットルコニカルチューブに血液を移す。 3％に相当する容量を追加します（w / v）の0.9％NaCl中のデキストランおよび転倒混和。 20分間室温で直立管をインキュベートする。
3. 下層を中断させることなく、慎重に上層を吸引し、新しい50ミリリットルコニカルチューブに移す。 10分間300×gでの遠心分離により細胞をペレット化。上清を捨てる。
4. 血液の出発体積に相当する0.9％のNaClの容量で細胞ペレットを再懸濁する。
5. 細胞懸濁液に、p下で密度遠心分離溶液10mlレイヤ2つの相の間の界面を予約する。ブレーキなしで30分間400×gで遠心分離する。上清を捨てる。
6. 残りの赤血球を溶解するために10mlの冷0.2％NaCl中で細胞ペレットを再懸濁する。 30秒間インキュベートした後、速やかに等張性を復元するために10ミリリットルの冷1.6％のNaClを追加します。
7. 6分間300×gでの遠心分離により細胞をペレット化。上清を捨てる。
8. 細胞ペレットは、赤血球、溶解の典型的には3回がないことが表示されるまで繰り返して、4.6から4.7を繰り返します。
9. 1,000μピペットを用いて、温かい（37℃）RPMI-に血球計を用いて細胞計数によって決定10 ⁷細胞/ mlの濃度で、主としてPMN、細胞ペレットを再懸濁。使用するまで37℃で細胞を維持する。それぞれ、染色後の核の形態を、トリパンブルー排除および可視化により評価されるように、典型的には、PMN生存率および純度は> 99％である。

5。 Transuroepithelial好中球移行など言う

無菌法を用いて組織培養フードで次の手順を実行します。ステップ2.7で決定されるように、コンフルエント5637細胞層を担持する透過性をサポートのみを使用してください。 RPMI-することができ、予め用意し、使用するまで5％CO _2、37℃で維持することを含む24ウェルプレート。

1. 24ウェルプレート内の一定分量1ミリリットル暖かいRPMI-ウェルあたり、透過性支持体につき3ウェルを準備します。
2. 透過性支持体の上部及び下部容器から培地を吸引する。
3. 滅菌ピンセットを使用して、ステップ5.1で作成、24ウェルプレートに透過性のサポートを転送する。ウェルからウェルに支援を転送することにより、透過性のサポートを3回洗浄します。
4. 細菌接種を使用する場合は、無菌の25ミリメートル深部組織培養皿に透過性支持体を反転させる。化学誘引物質（ 例えば 、N-ホルミル-Met-Leu-Phe（のfMLF）またはIL-8）を使用する場合、5.6に進む。
5. ライブまたは殺さBACTを用いた実験のためにerial刺激は、60μlのRPMI-（モック感染症）、あるいは細菌接種ステップ3.5で調製された（6×10 ⁶ CFU）を各透過性支持の頂端側に接種。皿に蓋を置き、1時間、5％CO _2、37℃でインキュベートする。
6. 24ウェル低取付板によくRPMI-あたり0.6ミリリットルを追加します。透過性のサポート、ウェルあたり1を準備します。 PMN入力を列挙するために、RPMI-0.5ミリリットルを含む3つのウェルを準備します。
   1. 化学誘引物質は、細菌の代わりに使用されている場合は、ステップ5.6で調製した24ウェルプレートRPMI-0.6 mlに化学誘引物質を加える。
7. 24ウェル低接着プレートに右透過性をサポート。
8. 各透過性支持の上部貯水池（側底側）に、ステップ4.9で作成0.1ミリリットルのPMN（10 ⁶ PMN）を追加します。直接500μL含むウェルに100μlのPMNを追加したRPMIを。 1時間、5％CO _2、37℃でインキュベートする。
9. 滅菌ピンセットを使用して、優しくこすりウェルの縁に透過性支持体の膜は、頂端側から追加のPMNを削除し、サポートを処分する。
10. そっと千μlのピペットチップで各ウェルの底をこすることでPMNを収集し、チューブを微量遠心するPMN懸濁液を移す。
11. 血球計数器を用いてPMNを列挙。
12. 下側リザーバ内PMNの合計数を計算するには、6,000（100 nlの） ^は 1〜2mmでPMNの数を乗算する。データを入力PMNの割合として、または10 ⁶の入力PMNに正規化PMNの数として報告することができる。

結果

transuroepithelial好中球遊走アッセイは、種々の刺激（ 図1B）に対応して培養し、膀胱上皮細胞層全体の人間のPMNの移行の定量的評価が可能になります。プロトコルは単純であるが、PMN遊走に影響を及ぼし、その結果、このアッセイの再現性に影響を与えることができる変数の数がある。技術的、生物学的反復間の変動を減らすために透過性をサポートし、PMNの準備中な処置を行うこと。例えば、十分にコンフルエント5637細胞層を含有するのみ透過性支持体は、実験で使用されるべきである。 5637細胞の合流点は、液体に不透過性を測定する機能アッセイを用いて評価される。上部貯水池に添加した培地は、透過性支持体間で平衡化した場合、5637細胞が実験を行うために十分にコンフルエントではありません。上部リザーバ内の体積が維持される場合、次いでpermeことができる支持体は、PMN遊走を評価するために使用することができる。我々は、細胞の合流の際に適度に上昇し、このシステムでの経上皮電気抵抗を測定しているが、この方法を選択した場合、注意がそうでなければ、無菌セットアップを汚染しないように注意してください。播種7日後に56...

ディスカッション

培養された膀胱上皮細胞株および新たに単離されたヒトPMNを使用して、我々はtransuroepithelial好中球遊走のインビトロモデルを確立した。このモデルは、尿路感染症（UTI）の間に自然免疫応答、通常UPEC ⁹に起因する非常に一般的な細菌感染症の複雑さを分析し始めに尽力されています。膀胱、または膀胱炎の感染の間に、膀胱内腔へのPMNの補充は、細菌のクリアランス¹⁰に不可欠である。炎症反応に直面して足場を確立するには、UPECはUPECが免疫圧力^6,11が存在しない場合に膀胱上皮に侵入できる期間を延長膀胱へのPMNの到着を遅らせる。この表現型は、初期の時点UPECによるPMN遊走の抑制は、transuroepithelial PMN遊走の我々のin vitroモデルにおいて観察される。非病原性E.による感染コリ MG1655を誘発する尿路病原性の感染よりもかなり多くのPMNの移行大腸菌 UTI89（ 図2A）、MG1655と...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トランズウェルインサート(つまり 透過性サポート)	Corning	3472	6.5 mm, 3 μm孔、ポリエステル膜インサート
BDバキュテナー採血チューブ	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー(BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 mlの緑色のキャップチューブ、ヘパリンナトリウム
BD Safety-Lok採血および輸液セット	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー(BD)	367281	21 G x 0.75インチ針x 12インチ
バキュテナーワンユース、 積み重ね不可ホルダー	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	From Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS 密度遠心分離ソリューション	GE Healthcare	17-1440-02
超低アタッチメントプレート	Corning	3473	24ウェル、クリアフラットボトム
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	DMSOで再構成された10 mM
組換えヒトCXCL8/IL-8	R&Dシステム	208-IL	PBSで100&muに再構成されました。グラム/ミリリットル

チューブBDは