機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Summary

高品質の酵母細胞抽出物の調製は、個々のタンパク質または全体プロテオームの解析に必要な最初のステップである。ここでは、タンパク質機能、相互作用、および翻訳後修飾を維持するために最適化された出芽酵母細胞のための、高速で効率的、かつ信頼性の高い均質化プロトコルが記載されている。

Abstract

ビーズ打つことによって均質化は、悪名高い混乱させるのは難しいです出芽酵母の細胞からDNA、RNA、タンパク質、代謝物を解放するために、高速かつ効率的な方法です。ここでは、機能的相互作用およびタンパク質の翻訳後修飾を維持するために最適化されたバッファーにタンパク質を抽出するためのビーズミル、ホモジナイザーの使用を記載している。目的のタンパク質を発現する対数的に増殖している細胞は、選択した液体増殖培地で増殖させる。増殖培地は、誘導性プロモーター（ 例えば、ガラクトース）からのタンパク質発現を誘導するための試薬 ​​を補充することができる（ 例えば 、ノコダゾール）の細胞周期段階を同期させる、または（ 例えば、MG132）プロテアソーム機能を阻害する。次に細胞をペレット化し、プロテアーゼおよび/またはホスファターゼ阻害剤を含有する適当な緩衝液中に再懸濁しており、すぐに処理されるか、後で使用するために液体窒素中で凍結される。均質化は20秒BEAの6サイクルによって達成されるD-鼓動（5.5メートル/秒）、氷上で1分間インキュベートした各。得られたホモジネートを遠心分離によってクリアされ、小さな微粒子を濾過により除去することができる。結果クリア全細胞抽出物（WCE）はウェスタンブロッティング続いSDS-PAGEによる全タンパク質の直接分析のためにTCA 20％を使用して沈殿させる。抽出物はまた、特定のタンパク質のアフィニティー精製、翻訳後修飾、または共精製タンパク質の分析の検出に適している。ほとんどのタンパク質精製プロトコルの場合と同様に、いくつかの酵素やタンパク質は、それらの精製および他のためのユニークな条件やバッファー組成物が記載された条件の下で不安定になったり、不溶性のかもしれませんが必要な場合があります。後者の場合、提示プロトコルは、経験的にタンパク質抽出および精製のための最良のビード打ち戦略を決定するために有用な出発点を提供することができる。私たちは、エピトープタグSUMO E3リガーゼ、SIZ1、細胞周期の抽出と精製を示すSlx5、SUMO化およびリン酸化と同様、SUMO-ターゲットユビキチンリガーゼのサブユニットの両方になるタンパク質を規制。

Introduction

酵母遺伝学の素晴らしいパワーは伝説ですが、出芽酵母、 サッカロマイセス·セレビシエ、から天然タンパク質の調製及び分析は、多くの場合、問題をはらんでいます。後者は、酵母細胞壁¹のかなりの機械的強度及び弾性のためである。別の手段は、酵素的、化学的、機械的、圧力ベースの全細胞タンパク質抽出物^2-6を得るために、酵母細胞の破壊のために記載されている。これらの技術は、その後の分析または精製工程に使用することができる細胞代表、天然のタンパク質抽出物を得るためにそれらの効力が大きく異なる。例えば、酵母細胞壁溶解酵素（ 例えばザイモリアーゼ）、得フェロブラストで除去することができるが、剪断、界面活性剤、またはタンパク質を放出する浸透溶解によって破壊することができる。このアプローチは成功し、多くの細胞下分画するための出発点として使用されるが、それは長いインキュベーションを必要とされていますそれはいくつかのタンパク質⁷の安定性と互換性がありません。

酵母細胞のタンパク質の化学的抽出のための独自の酵母溶解試薬 ​​（例えば、界面活性剤など）、市販されているが、これらのタンパク質抽出における試薬およびタンパク質のその後の生化学的特徴付けに対する効果の有効性は必ずしも明らかではない^8。高圧ホモジナイザーは、しばしばフランス語押下と呼ばれる、効果的に第1高圧にそれらを施し、次いで圧力セル内の小さな開口部を介してそれらを押し出すことによって酵母細胞を破壊する。この技術は、高品質の抽出物を生成したが装置は非常に高価であり、細胞または複数のサンプル⁹少量のに適しているわけではない。したがって、ビーズミルで酵母細胞の機械的破壊は、しばしば、天然の酵母タンパク質調製物¹⁰を選択する方法である。この技術は、酸のWAを有する酵母細胞壁の機械的破壊を伴うシェーカー、vortexersまたはビーズミルの様々行うことができるガラスビーズを流した。特に、この方法は、同時に複数のより小さな試料（1 mlの細胞以下）を処理するために使用することができる。さまざまなビーズやビーズミル混乱行列は今や2 mlのチューブに細胞型のほとんどすべての種類を妨害するために市販されている。他の技術と設備を考慮し、ビーズミル、プロテアーゼおよび/またはプロテアソーム阻害剤と適切なバッファが利用される場合は特に、例えばSUMO化などの翻訳後修飾を維持するのに役立ち、これ酵母細胞の破壊は非常に速く起こるという利点を有しているそして抽出物の温度が制御される。

このプロトコルは、内因性および過剰発現タンパク質の機能を維持するために究極の目標と穏やかな条件の下でタンパク質相互作用、および翻訳後修飾の、高速で効果的、かつ信頼性の高い抽出に焦点を当てています。増殖培地、細胞溶解バッファー組成物、及びビーズミルの設定は、タンパク質間相互作用、例えばSUMO化とユビキチン化などの翻訳後修飾を維持するために最適化される。

Protocol

変性条件下で出芽酵母細胞で発現6xHisタグタンパク質の精製

1。タンパク質発現の酵母細胞と誘導の成長

^（2から変更）

オプション：関心の代わりに後述のガラクトース誘導性の文化のタンパク質を発現対数的に成長している酵母培養を使用してください。

1. ギャル⁺コードするプラスミドで酵母株の選択のガラクトース誘導性6xHisタグタンパク質の細胞を形質転換する。例えば、試薬のリストを参照してください。
2. 2％ショ糖を含む適切な選択培地（ 例えば SD-ウラシル）5ml中の形質転換体を植菌。 30°CO / N、回転でインキュベートする。
3. 600nmでの光学密度が2％ショ糖と選択培地33 mlの0.3（= 0.3 OD _600）を測定するようにO / N文化を希釈します。 （Δ150rpm）で揺れ、30℃で成長する。
4. 文化は、OD ₆₀₀ = 0.8に達したとき-1.5、2％ガラクトースの1x YEPの最終濃度が、6％ガラクトース（ 表1のレシピ）で3回17mlのYEPを添加することにより、所望のタンパク質の発現を誘導する。合計培養液量は現在50ミリリットルです。インキュベートし、追加の5-6時間、30℃で、揺れ。
   注：培養液量を変化させることができる。ステップ1.3で、希薄所望の最終体積の三分の二に。ステップ1.4では、3倍YEP / 6％ガラクトースの三分の一、最終容量を追加します。
5. 4℃で5,000 rpmで5分間誘発文化や遠心分離機、細胞のΔ150-200 OD ₆₀₀単位のOD _600を測定します
6. 1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルと2 mlのスクリューキャップチューブに移すと1ミリリットルの氷冷1X PBSで再懸濁し、細胞ペレット。
7. 4℃で15,000 rpmで1分間遠心し℃で上清をデカント。
8. -80℃で即時細胞溶解またはストレージが続く液体窒素、℃でさらに使用するまで、Cで凍結細胞ペレットをスナップ。

2。酵母細胞の均質化とタンパク質の抽出

1. 前のステップからの凍結細胞ペレットに、酸洗浄ガラスビーズと氷冷溶解バッファー（ 表1のレシピや、選択した細胞溶解バッファーを使用します）500μlの200μlのを追加します。
2. 簡単に言うとペッティング上下。これは完全に細胞ペレットを再懸濁する必要はない。すべての回で氷の上にチューブを保管してください。
   注：ピペットチップの先端が上下にピペッティング前に切断されることがあります。
3. 4℃で、場所ビーズミル、バランス、ロック、そして当たり製造元の指示としてマシンを実行中に細胞とチューブ（秒）。
4. 5.5で20秒間チューブ（s）を含むビーズビーターメートル/秒、その後1分間ぬかるみ氷上に置きを実行します。合計で6倍を繰り返します。
5. 4℃15,000 rpmで15分間、℃で遠心分離により抽出したタンパク質をクリアオプション：SpinXフィルターを通して遠心分離により小さな微粒子を除去。
6. 全細胞eのサンプルを準備しますウェスタンブロットによって目的のタンパク質の存在を確認する（WCE）xtract：
   1. 800μlの20％トリクロロ酢酸（TCA）への細胞の2 OD ₆₀₀台（クリアエキス例えば 、5μlの細胞の200 OD ₆₀₀台が収穫されている場合）に対応するWCE追加。ミックスする渦。
   2. 4℃で15,000 rpmで2.5分間遠心上清をデカントしたが、ペレットを保持するように注意してください。
   3. 4℃15,000 rpmで2.5分間遠心分離し、ペレットとボルテックスチューブにTCA 2％800μlの、℃までを追加上清をデカントしたが、ペレットを保持するように注意してください。
   4. TCAサンプルバッファー100μlの（ 表1のレシピ）、ペレットを溶解するために渦を追加します。注意：サンプルバッファがペレットに添加した後（黄色に変わります）、酸性になった場合、Δ10μlのトリス塩基のアリコートを追加[1M]サンプルは再び青になるまで。
   5. 2-5分間100℃のヒートブロックでインキュベートする。
   6. 渦AGAINペレットの残党がまだ存在する場合は、完全に溶解する。この方法で調製したペレットは、完全に溶解するの難しいことで知られています。それは完全にペレットを溶解するためにボルテックスのΔ10分かかる場合があります。
   7. -80 Storeサンプル°C、さらに使用するまで。
7. さらに使用するまで-80℃で液体窒素や店舗内の残りのクリアWCE°Cのアリコートを凍結スナップ。

3。酵母細胞ホモジネートからのタンパク質のバッチ精製

注：この精製法は、Co ^{2 +}金属アフィニティー樹脂に6xHisタグタンパク質の精製の ​​ために最適化されました。

1. レジン平衡
   1. 細胞のΔ20-40 OD ₆₀₀台から調製クリアWCEのサンプルについては、マイクロ遠心チューブに親和性樹脂の50〜100μLを加える。例えば、アミロース、所望のタンパク質または非特異性樹脂を発現しない細胞から抽出したタンパク質を、コントロールとして使用することができる非特異的結合のための。
   2. 洗浄緩衝液1mlで5倍の樹脂を洗う：トップオーバーボトム反転樹脂を再懸濁させた後、4℃で5,000 rpmで1分間スピンするまで℃に上清を吸引。
      注：同じ日に抽出·精製を行う場合は、樹脂平衡化、抽出の前に行うことができる。
2. アフィニティー精製の ​​ためのタンパク結合
   1. 50〜100μlの洗浄したビーズにクリアライセート100-200液（Δ20-40 OD ₆₀₀単位）を追加し、溶解緩衝液で1ミリリットルの合計容積をもたらす。
   2. 2-5時間で4章動またはロッキング°Cでインキュベートする。
   3. 4℃で5,000 rpmで1分間スピン
   4. 必要に応じて、非結合タンパク質のその後の分析のために残りの上清のサンプルを保存します。 TCAはWCE（ステップ2.6）については、上記の詳細として沈殿する。
   5. 5,000 rpmで少なくとも1分間スピンコートした後、洗浄緩衝液1mlで5倍の結合タンパク質で樹脂を洗浄4℃洗浄中にサンプルは冷やしておく。
3. 結合したタンパク質の溶出
   1. 4で、樹脂にうなだれるを150μlの溶出バッファーを追加℃で5分間、4℃で5,000 rpmで1分間スピン℃、新しいチューブに上清を保存します。オプション：2倍とプール溶出を繰り返します。
   2. 、溶出したタンパク質の25μlに2μlのβ-メルカプトエタノール（BME）と25μlの2倍のリチウムドデシル硫酸塩（LDS）サンプルバッファーを加え、2分間100℃のヒートブロックでインキュベート：ウェスタンブロット用溶出サンプルを準備します。
      注：標準2XのLaemmliサンプル緩衝液を用いてもよい。
   3. 液体窒素中で凍結過剰溶出タンパク質をスナップ。
      オプション：65℃2倍LDSサンプルバッファー等量と樹脂からのストリップの残りのタンパク質は℃で5分間、新しいチューブにLDS-溶出タンパク質を除去し、ではない樹脂に、溶出したタンパク質に2μlのBMEを追加します。この順序は、抱合あるあらゆるイオンまたは抗体の除去を防止するためであるビーズにテッド。
   4. -80℃でさらに使用するまで、店舗のサンプル。
4. タンパク質を可視化するための適切な抗体を用いたウェスタンブロットおよびプローブ 。
   1. 各サンプルの10〜20μL（Δ1-3 OD ₆₀₀台）と、選択したSDS-PAGEゲル中のタンパク質ラダーの3-10μLをロードします。日常的にこのプロトコルに使用ゲルは4〜12％ビス - トリス、8％トリス - グリシンが含まれています。
   2. 50分間200 Vでゲルを実行します。
   3. 20〜30分（ 表1のレシピ）が19 Vでセミドライ転送によりゲルからPVDF膜にタンパク質を転送します。
   4. 4％milk/1xトリスのブロック膜は、4℃（ 表1のレシピ）でRTまたはO / Nで1時間食塩水TWEEN（TBST）をバッファリング。
   5. 4℃でRTまたはO / Nで1-3時間、4％milk/1xのTBSTの関心のエピトープタグタンパク質に一次抗体を有する膜をインキュベート
   6. 1×TBSTで5分間ごとに、3倍の膜を洗浄します。
   7. 適切なメンブレンをインキュベート二次西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合室温で1-3時間、抗体。
   8. 1×TBST大容量で15分ごとに、3倍の膜を洗浄します。
   9. サランラップでECL基質とラップでメンブレンをカバーしています。
   10. フィルムに膜を露出させ、タンパク質を可視化するために開発しています。

Results

我々の代表的な結果について説明ビード打ちおよびタンパク質抽出プロトコルは、ダウンストリーム·アプリケーション（ 表2に要約）の様々なタンパク質の再現可能な製造のために有用であることを明らかにした。 WCEsのクーマシー染色したSDS-PAGEでタンパク質（〜12〜> 250 kDaの）広範囲の再現性酵母細胞（ 図1A）から抽出することができることを示している。分子量の範囲にわたる離散的なバンドは、高品質のタンパク質抽出物を示す。抽出物の品質は、ウエスタン特異的エピトープタグ融合タンパク質のためのブロッティングにより確認することができる。示さΔ120kDa（ 図1B）に移行ガラクトース過剰発現、V5タグ付きSUMOリガーゼSIZ1ための代表的な結果である。一般的には、部分的に分解されたタンパク質は、予想体重以下複数の断片として実行しますが、ここでの唯一の全長タンパク質が観察される。所与のタンパク質さらに、高分子量の付加物翻訳後修飾を示すことがあります。例えば、私たちはガラクトース過剰SUMO化Siz1Δ440と全長SIZ1（

Discussion

このプロトコルは、無傷の、ネイティブの準備に焦点を当て、翻訳後のダウンストリームアプリケーションのため出芽酵母細胞からタンパク質を変更しました。このプロトコルを試みる前に、目的のタンパク質を容易に変性条件下¹²で調製したタンパク質抽出物中で検出することができるかどうかを判断することが重要である。ポリクローナル抗体が利用できない場合、それは、融合タンパク質をウエスタンブロットで検出できるように、タグの目的のタンパク質のエピトープすることが有利であり得る。現在のプロトコルでは、我々はHA、6×-V5、またはMYCエピトープタグでSIZ1をタグ付けし、この戦略は、私たちが明らかにウエスタンブロット（ 図1）上のタンパク質とSUMO化の形態を識別することができました。高親和性抗GFP抗体が（データは示さず）を得ることが困難である可能性があるので、我々は、GFPタグ融合タンパク質を検出少ない成功を収めた。別の重要な問題は、目的のタンパク質の発現量に関するものである。個々のレベルタンパク質は^、4出芽酵母細胞内で広く変化し、いくつかのタンパク質は、それらが...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
BG1805	ThermoScientific	YSC3869	GAL+ 酵母株の ORF 菌株 誘導および抽出に使用できます
pYES2.1 TOPO ベクター	ライフ テクノロジー	ズ K4150-01	GAL+ 誘導および抽出に使用できる酵母株; V5/6xHIS タグ
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)	Thermo Scientific	1860932
2.0 ml スカート付きチューブ、テザースクリューキャップ付き	BioExpress	C-3369-3	チューブがビーズラプターに適切に収まることを確認してください
ガラスビーズ、酸洗浄、425-600 & マイクロ;m (30-40 US sieve)	Sigma-Aldrich	G8772
Corning Costar Spin-X 遠心分離管フィルター	Sigma-Aldrich	CLS8161	清澄化されたライセートの追加ろ過に使用
TALON 金属親和性樹脂	Clontech	635502	6xHISタグ付きタンパク質の精製用
NuPAGE LDS サンプルバッファー (4x)	Life Technologies	NP0007	SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングNuPAGEの前にサンプルを調製および/または溶出するには
4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	ウェスタンブロッティング前のSDS-PAGEによく使用されるプレキャストゲル
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	タンパク質ゲル染色
哺乳類溶解バッファー	Promega	G9381	代替市販溶解バッファー
抗V5アガロース	Sigma	A7345	免疫沈降法
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF 膜	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS gels Life	Technologies	NP0321BOX
anti-myc antibody	Covance	mms-150R
secondary antibody	Abcam	ab97040	ヤギ pAb からマウス IgG (HRP)